Cardioprotective Effect of Maternal Supplementation with Resveratrol on Toxicity Induced by Doxorubicin in Offspring Cardiomyocytes.

BACKGROUND: Doxorubicin (DOX) is frequently used to treat many types of cancers, despite its dose-dependent cardiotoxicity. Alternatively, resveratrol is a polyphenol that has shown useful cardioprotective effects in many heart dysfunction models.
OBJECTIVE: This study investigated whether resveratrol treatment in pregnant rats protects against doxorubicin-induced toxicity in offspring cardiomyocytes.
METHODS: Wistar rats (n=8) were supplemented with dietary resveratrol during pregnancy. Upon the offspring's birth, hearts (9-11) were used to obtain the primary culture of cardiomyocytes. DOX-induced cardiotoxicity and the effects of resveratrol supplementation were evaluated by oxidative stress markers, such as dichlorofluorescein diacetate oxidation, decrease in the activity of antioxidant enzymes, and oxidation of total sulfhydryl content, in addition to cell viability evaluation, DNA damage generation, and DNA damage repair response. A value of p<0.05 was considered statistically significant.
RESULTS: Neonatal cardiomyocytes from resveratrol supplemented rats exhibiting an increase (p<0.01) in cell viability and lower (p<0.0001) apoptotic/necrotic cells after DOX treatment, which correlates with the activities of antioxidant enzymes and dichlorofluorescein production. Moreover, resveratrol protected cardiomyocytes from DOX-induced DNA damage, showing a decrease (p<0.05) in DNA breaks induced by oxidative stress, evaluated by the activity of DNA-repair enzymes endonuclease III and formamidopyrimidine glycosylase. Supplementation with resveratrol increased (p<0.05) the expression of the repair protein Sirt6 in the cardiomyocytes of the pups.
CONCLUSION: This research indicates that supplementation with resveratrol during the gestational period has a notable cardioprotective effect on the offspring's heart against DOX-induced toxicity, which may well be due to its antioxidant function, and the increase in the DNA damage repair response.

Introdução

A antraciclina doxorrubicina (DOX) é um agente quimioterápico usado geralmente usado para tratar leucemia e uma variedade de tumores sólidos. [1] Sua ação citotóxica em células tumorais está relacionada à inibição da topoisomerase II; intercalação e dano ao DNA, que produzem quebras de dupla hélice; e um aumento na geração de radicais livres, que comprometem os processos de replicação e transcrição. [2] Recentemente, demonstrou-se que a DOX expulsa histonas de regiões específicas do genoma, causando danos à cromatina com alterações epigenéticas e transcricionais consequentes. [3]

O tratamento com DOX pode causar efeitos colaterais graves, demonstrando uma ação terapêutica limitada devido a sua forte cardiotoxicidade que pode levar a cardiomiopatia dependente da dose. [4] No nível intracelular, muitas vias podem estar envolvidas na toxicidade induzida por DOX. Em muitos delas as espécies reativas do oxigênio (ERO) geradas pelo metabolismo da DOX têm um papel importante na disfunção miocárdica devido ao stress oxidativo. [5]

Não está claro se os efeitos adversos do tratamento com DOX são necessários para sua eficácia antitumoral. Algumas estratégias de redução da toxicidade foram investigadas, mas, atualmente, o agente quelante de ferro dexrazoxane é clinicamente o único método alternativo para evitar a cardiotoxicidade induzida por DOX. [6]

Portanto, o desafio atual é elaborar um protocolo cardioprotetor para tratamentos curtos e longos com DOX, sem impedir sua atividade antitumoral. Muitas estratégias terapêuticas, tais como a suplementação com antioxidantes ou o aumento da capacidade antioxidante pelo exercício, já foram propostas para limitar a toxicidade da DOX. [7 , 8] Surpreendentemente, dados recentemente publicados por nosso grupo de pesquisa demonstram que o exercício materno durante a gestação pode reduzir os efeitos cardiotóxicos induzidos por DOX em cardiomiócitos de filhotes de ratos. [9]

Nesse sentido, o resveratrol é um composto polifenólico que tem recebido atenção por seu potencial de proteção contra doenças cardiovasculares. [10] Seus benefícios cardiovasculares estão relacionados aos efeitos em sistemas biológicos - evitando a agregação plaquetária, [11] diminuindo a expressão da sintase do óxido nítrico, [12] exercendo efeitos antioxidante e neutralizando radicais livres. [13] A demanda global por terapias mais razoáveis identificou características importantes para a saúde humana no resveratrol, associada à boa relação custo benefício: baixa toxicidade e alta disponibilidade. [14] Além disso, o interesse nesse composto bioativo aumentou recentemente após a identificação de sua ação protetora contra o câncer de pele. [15]

Moléculas bioativas presentes na dieta materna dos ratos têm recebido destaque devido a sua participação na reprogramação do metabolismo da ninhada. [16 , 17] Como o resveratrol atravessa a membrana placentária, a suplementação pela mãe durante a gestação já foi associada a efeitos benéficos em modelos experimentais, tais como evitar a morte do embrião no curso do diabetes gestacional, [18] e controle da hipertensão na prole de animais espontaneamente hipertensos. [19] Entretanto, o efeito cardioprotetor, na ninhada, do resveratrol presente na dieta materna ainda não foi investigado.

Portanto, considerando os efeitos bioativos do resveratrol em doenças cardiovasculares, neste estudo testou-se a hipótese de que o resveratrol, presente na dieta materna durante o período gestacional, tem um efeito cardioprotetor na toxicidade induzida por DOX na cultura de cardiomiócitos da ninhada, por meio de seus possíveis efeitos no sistema de defesa antioxidante e na resposta ao dano de DNA.

Métodos

Animais

Ratos Wistar adultos machos e fêmeas (provenientes do Biotério da UFCSPA) pesando entre 70-100 g foram abrigados em condições controladas de luz, temperatura e umidade (períodos de 12h luz/escuridão, a 22ºC ± 2, e 55% ± 5 de umidade relativa), com água e dieta padrão ad libitum . Essa pesquisa foi realizada em conformidade com as diretrizes nacionais e internacionais sobre o uso de animais para fins científicos, e foi aprovada pelo Comitê de Ética da UFCSPA e registrado sob o número de protocolo 183/13.

Protocolo experimental

O procedimento de acasalamento foi realizado após o primeiro ciclo estral. Na manhã seguinte ao procedimento de acasalamento, esfregaços vaginais foram analisados para detectar espermatozoides, que era a confirmação do dia zero da gestação. Em seguida, as fêmeas foram distribuídas nos seguintes grupos:

Grupo controle (C-G, n=8): sem suplementação com resveratrol. Recebiam solução salina com 0,05% de Tween 80 por gavagem, e eram manipuladas uma vez por dia, 5 dias/semana, durante 21 dias de gestação, totalizando 15 dias de gavagem.

Grupo resveratrol (RV-G, n=8): suplementado com 2,5 mg/kg de peso corporal com resveratrol [20] (dispersado em solução salina com 0,05% de Tween 80) [21] por gavagem (uma vez por dia, 5 dias/semana, durante 21 dias de gestação, totalizando 15 dias de suplementação).

Para a estimativa do tamanho da amostra, a pesquisa de Singh et al., [18] foi utilizada como referência. Para isso, um teste bicaudal foi aplicado, com um nível de significância de 5% e poder de 95%. Estimou-se uma diferença mínima entre os grupos de 12 ŋmol/mg de proteína, com um desvio padrão de 0,096, para resultar em uma avaliação significativa do teste de grupos sulfidrila utilizado para estimativa da amostra. A estimativa do tamanho da amostra resultou em oito animais por grupo.

Ao final do período gestacional, filhotes de até 3 dias de idade foram submetidos à eutanásia e seus corações [9 - 11] foram usados para obter um agregado de cardiomiócitos usado para a cultura primária, como demonstrado na linha do tempo simplificada da Figura 1 .

Figura 1

– Linha de tempo simplificada do protocolo experimental.

Cultura de cardiomiócitos

A cultura primária dos corações de ratos neonatos foi obtida conforme descrito previamente por nosso grupo de pesquisa. [9] Em resumo, os corações foram submetidos a ciclos repetidos de uma digestão enzimática em um tampão contendo pancreatina e BSA, a 37°C. Ao final dos ciclos, o agregado de células foi colocado em frascos de cultura de 75 cm 2 para adesão de fibroblastos. A suspensão celular foi aspirada, centrifugada e disposta em placas de cultura tratadas com gelatina (0,1% em PBS) para adesão de cardiomiócitos. Quando as células haviam adquirido confluência, a cultura foi tratada com DOX (0,1, 0,5 ou 1,0 µM) durante 24 ou 48 h para a análise descrita abaixo. Todos os experimentos foram realizados em triplicata, para garantir a precisão dos resultados.

Ensaio de viabilidade celular e mecanismos de morte

O teste azul de tripan (TB) foi utilizado para avaliar a viabilidade das células. [22] O número de células viáveis e células mortas foi contado em um contador de células automático (Countess®), que permite estimar a porcentagem de células viáveis (relação células viáveis/células totais). Desse ponto em diante, o mecanismo de morte foi avaliado pela citometria de fluxo. Depois do tratamento com DOX, a cultura de cardiomiócitos foi lavada, centrifugada e ressuspensa em tampão aglutinante (100 µL) com Anexina V-PE (3 μL) e 7-AAD (3 μL), e depois incubada no escuro por 15 minutos. Foram realizadas análises por citometria de fluxo, considerando 5.000 eventos/amostra, para acessar as células viáveis, apoptóticas ou necróticas (FACSCalibur com software CellQuest).

Detecção de danos no DNA

A genotoxicidade induzida por DOX foi avaliada pelo índice de danos ao DNA, por meio do ensaio do cometa alcalino descrito previamente. [23 , 24] Após o tratamento, a cultura de cardiomiócitos foi lavada, tripsinizada, centrifugada e ressuspensa em PBS. Trinta μL de suspensão celular foram dissolvidos em 0,75% agarose (com baixo ponto de fusão) que foi distribuída em uma lâmina previamente coberta com agarose a 1% (com ponto de fusão normal). Lâminas de microscópio foram incubadas em solução de lise durante 24 horas a 4°C. Para avaliar a presença de danos oxidativos ao DNA, as lâminas foram retiradas da solução de lise, lavadas e incubadas com enzimas reparadoras - endonuclease III (EndoIII) ou formamidopirimidina glicosilase (FPG) - (300 mU/gel; 45 min a 37°C). Depois da lise e/ou incubação com EndoIII ou FPG, o DNA foi desenrolado por 20 minutos em um sistema de eletroforese horizontal contendo tampão alcalino fresco (300 mM NaOH/1 mM EDTA a pH 13,0). A expressão de sítios alcali-lábeis do DNA ocorreu por migração dos danos ao DNA sob corrente elétrica (25 V; 300 mA; 0,9 V/cm). As lâminas foram antes neutralizadas e coradas como descrito previamente. [25] Um total de 100 células/lâminas foi visualizado por microscopia ótica, e classificado de acordo com o método descrito previamente. [26]

Extratos proteicos de cardiomiócitos

Depois de 24 ou 48 horas de tratamento com DOX, o meio celular foi retirado, e os extratos proteicos de cardiomiócitos foram preparados como descrito anteriormente, [9] os quais foram utilizados para todas as análises adicionais descritas abaixo.

Quantificação do stress oxidativo

A diclorofluoresceína diacetato (H 2 DCF-DA) é uma sonda que é hidrolisada por esterases de meio intracelular para formar um produto não fluorescente o qual é oxidado por oxidantes intracelulares gerando uma diclorofluoresceína fluorescente (DCF). [27] Resumidamente, a H 2 DCF-DA foi incubada com extrato proteico de cardiomiócito conforme descrito anteriormente, [9] e a intensidade da fluorescência foi medida em um leitor de microplacas (SpectraMax M2℮, Molecular Devices, California) a 480 ηm (EX) e 535 ηm (EM).

Sistema de defesa antioxidante

A atividade do sistema de defesa antioxidante de cardiomiócitos neonatais foi avaliada por meio da atividade enzimática de catalase (CAT) e superóxido dismutase (SOD), conforme descrito anteriormente. [28 , 29] O teor de sulfidrila total, que é inversamente proporcional aos danos oxidativos em proteínas, foi estimado pelo método descrito previamente. [30]

Resposta aos danos ao DNA

A resposta dos cardiomiócitos aos danos ao DNA induzidos por DOX foi avaliada pelo ensaio de immunoblotting da Sirt6 (sirtuína 6), uma desacetilase de histonas que age como uma proteína scaffold no reparo dos danos ao DNA. Para esse ensaio, 25 μg de proteína de cardiomiócitos foram separadas por um SDS-PAGE a 12% por um método anteriormente descrito. [31] Membranas foram incubadas com anti-Sirt6 e actina (C-2), a 1:500. O blot foi revelado utilizando-se um kit de quimiluminescência (ECL, Thermo Scientific). As densidades óticas dos immunoblots foram determinadas com o software ImageJ 1.48v (Wayne Rasband, National Institutes of Health, EUA).

Quantificação da proteína

A concentração de proteína dos extratos proteicos foi determinada conforme descrito anteriormente. [32]

Análise estatística

Os dados foram analisados utilizando-se o software Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) versão 16.0 (IBM Company, Armonk, NY, EUA). A distribuição normal e a homogeneidade das variâncias foram avaliadas pelos testes de Kolmogorov-Smirnov e Levene, respectivamente. A análise de variância de uma via (ANOVA) e o teste de Tukey post hoc foram usados para a comparação entre os grupos. As correlações foram realizadas pelo coeficiente de correlação de Pearson. Os dados foram expressos como média ± erro padrão de média (EPM) e um p <0,05 foi considerado significativo.

Resultados

O resveratrol atenuou a apoptose e a necrose induzida por DOX em cardiomiócitos de neonatos

Os efeitos da suplementação materna com resveratrol durante a gestão foram avaliados inicialmente pelo teste de exclusão com azul de tripan (TB) ( Figura 2 ), que evidenciou a morte celular dependente da concentração de DOX. Entretanto, a suplementação com resveratrol durante a gestação protegeu células de neonatos da morte induzida após 48 h do tratamento com 1,0 ou 0,5 µM DOX ( Figura 2B ), em relação aos cardiomiócitos de neonatos de ratas não suplementadas.

Figura 2

– Viabilidade de cardiomiócitos de neonatos expostos a DOX (0,1, 0,5 ou 1,0 µM) por 24 h (A) ou 48 h (B), pelo teste de exclusão azul de tripano (TB). Cultura de cardiomiócitos de ninhadas de ratas suplementadas com resveratrol (2,5 mg/Kg) (RV-G) ou grupo de controle (C-G). Os valores são média ± EPM (n=8). O símbolo * indica p <0,001, # p<0,01, e p<0,05 entre o grupo RV-G e o grupo C-G. O símbolo Φ indica p <0,001, $ p <0,01, e Δ p <0,05 de células de controle (não expostas ao DOX), pelos testes de ANOVA de uma via, e teste post hoc de Tukey .

Na sequência, o principal mecanismo de morte de cardiomiócitos foi explorado por citometria de fluxo ( Figura 3 ). Os resultados confirmam os obtidos pelo ensaio TB, demonstrando um aumento na morte de cardiomiócitos relacionada ao tratamento com DOX, exibindo a fração mais alta da morte celular por apoptose na concentração de 1 µM DOX (p <0,001). Esses resultados também demonstram que a apoptose é o principal mecanismo de morte induzida por DOX em cardiomiócitos de neonatos ( Figura 3A ), corroborando resultados prévios de nosso grupo de pesquisa. [9] Além disso, o resveratrol protegeu cardiomiócitos contra a morte induzida por DOX 48 h após o tratamento, com um aumento de células viáveis (p <0,001) e redução de células apoptóticas e necróticas (p <0,001) ( Figura 3B ).

Figura 3

– Cultura de cardiomiócitos de ninhadas de ratas suplementadas com resveratrol (2,5 mg/Kg) (RV-G) ou grupo de controle (C-G) foi analisada por citometria de fluxo. Depois de 24 h (A) ou 48 h (B) de tratamento com DOX (0,1, 0,5 ou 1,0 µM) foram analisadas a viabilidade, a apoptose, ou a necrose de cardiomiócitos de neonatos. O grupo de controle indica células sem DOX. Os valores são média ± EPM (n=8). O símbolo * indica p <0,001, # p<0,01, e p<0,05 entre o grupo RV-G e o grupo C-G. O símbolo Φ indica p <0,001, $ p <0,01, e Δ p <0,05 de células de controle (não expostas ao DOX), pelos testes ANOVA de uma via, e seguido por post hoc Tukey .

O stress oxidativo é atenuado em células neonatais pela suplementação com resveratrol durante a gestação

O mecanismo mais aceito para a toxicidade induzida por DOX é a formação de ERO, que, por sua vez, leva à formação do stress oxidativo. [5] As Figuras 4A e B demonstram que os cardiomiócitos de neonatos expostos à DOX apresentaram um aumento (p <0,001) na produção de oxidantes intracelulares, em relação ao grupo de controle (células não expostas à DOX). É importante observar que a suplementação com resveratrol durante a gestação atenuou (p <0,05) o stress oxidativo em células neonatais após o tratamento com 0,5 ou 1,0 µM DOX ( Figura 4B ), em relação grupo de controle (C-G). Além disso, a viabilidade celular e a produção do stress oxidativo, também medidos pela oxidação de DCF, apresentaram-se inversamente proporcionais em 24 e 48 h (r=-0,8, p<0,0001 e r=-0,789, p <0,001), respectivamente. Notadamente, uma correlação direta entre a produção de stress oxidativo intracelular e a apoptose (r=0,836, p<0,0001, r=0,817, p<0,0001) observou-se após o tratamento com o DOX, 24 h e 48 h, respectivamente.

Figura 4

– Stress oxidativo em cardiomiócitos de neonatos tratados com DOX (0,1, 0,5 ou 1,0 µM) por 24 h (A) ou 48 h (B). Os valores são média ± EPM (n=8). O símbolo & indica p<0,05 entre o grupo RV-G e o grupo C-G. O símbolo Φ indica p <0,001, $ p <0,01, e Δ p <0,05 de células controle (não expostas à DOX), pelos testes ANOVA de uma via, seguido por post hoc Tukey .

O resveratrol reduz danos oxidativos ao DNA induzidos por DOX em cardiomiócitos de neonatos

O stress genotóxico induzido por DOX foi avaliado pelo ensaio cometa alcalino, que detecta os sítios alcali-lábeis e quebra de hélices no DNA. [33] Os resultados demonstram um aumento nos danos ao DNA induzidos por DOX em células neonatais de todos os grupos de mães ( Figuras 5A-B ), que era dependente de concentração. Entretanto, a suplementação gestacional com resveratrol protegeu cardiomiócitos de danos ao DNA induzidos por DOX.

Figura 5

– Danos ao DNA em cardiomiócitos de neonatos tratados com DOX (0,1, 0,5 ou 1,0 µM) por 24 h (A) ou 48 h (B). Os danos oxidativos ao DNA foram analisados pelas enzimas endonuclease III (EndoIII) e formamidopirimidina glicosilase (FPG) nas células tratadas com DOX por 24 h (C e E) ou 48 h (D e F). Os valores são média ± EPM (n=8). O símbolo * indica p <0,001, # p<0,01, e p<0,05 entre o grupo RV-G e o grupo C-G. O símbolo Φ indica p <0,001, $ p <0,01, e Δ p <0,05 de células controle (não expostas à DOX), pelos testes ANOVA de uma via, seguido do teste post hoc Tukey .

Considerando que a produção do stress oxidativo induzido por DOX foi reduzido (p <0,05) pelo resveratrol ( Figura 4 ), a avaliação dos danos ao DNA relacionados ao stress oxidativo gerado por DOX se torna uma questão importante. Dessa forma, foi examinada a atividade das enzimas reparadoras do DNA endonuclease III (EndoIII) e formamidopirimidina glicosilase (FPG) ampliando a especificidade do ensaio de cometa, reconhecendo bases danificadas por stress oxidativo e convertendo em quebras de fita simples. [26 , 34] A Figura 5 (C-F) demonstra que a magnitude dos danos oxidativos ao DNA causado pelo tratamento com DOX que foi reconhecido pelas enzimas reparadoras. Notadamente, os cardiomiócitos neonatais de mães suplementadas apresentaram uma diminuição (p <0,001) em danos oxidativos observados no DNA. Além disso, a suplementação com resveratrol conseguiu diminuir os danos oxidativos ao DNA de cardiomiócitos neonatais não expostos a DOX, 24 e 48 h após o tratamento com DOX.

Os cardiomiócitos de neonatos de mães suplementadas com resveratrol apresentaram um sistema de defesa antioxidante mais eficiente

Com o objetivo de avaliar se os efeitos do resveratrol sobre a geração do stress oxidativo danos ao DNA estão associados com um aumento no sistema de defesa antioxidante, foram examinadas as atividades das enzimas CAT e SOD ( Tabela 1 ), bem como o teor total de grupos sulfidrila ( Figura 6 ). As atividades das enzimas CAT e SOD foram reduzidas por DOX em cardiomiócitos neonatais das mães do grupo controle em comparação com as células neonatais de mães que receberam o suplemento resveratrol ( Tabela 1 ).

Tabela 1

– Efeitos da suplementação gestacional com resveratrol nas atividades das enzimas SOD e CAT de cardiomiócitos de neonatos expostos à DOX.

	Controle	Resveratrol	Controle	Resveratrol
	SOD (U/mg proteína)
	24 horas		48 horas
Controle	4,61 ± 0,31	6,26 ± 0,61*	4,46 ± 0,15	6,00 ± 0,73
0,1 µM DOX	3,90 ± 0,39	5,31 ± 0,19*	3,98 ± 0,05 #	6,06 ± 0,50*
0,5 µM DOX	3,22 ± 0,42 #	5,22 ± 0,37*	3,03 ± 0,37 #	5,12 ± 0,42*
1,0 µM DOX	2,83 ± 0,20 #	5,56 ± 0,32*	2,53 ± 0,54 #	5,19 ± 0,69*
	CAT (U/mg proteína)
	24 horas		48 horas
Controle	12,15 ± 1,25	24,08 ± 1,31*	12,30 ± 0,54	27,11 ± 1,28*
0,1 µM DOX	6,16 ± 0,41 #	13,00 ± 2,15* #	7,85 ± 0,59 #	13,56 ± 1,31* #
0,5 µM DOX	4,04 ± 0,28 #	9,47 ± 1,26* #	5,35 ± 0,36 #	12,24 ± 1,94* #
1,0 µM DOX	2,62 ± 0,11 #	8,78 ± 1,86* #	2,68 ± 0,75 #	8,36 ± 0,80* #

As células foram tratadas com DOX (0,1, 0,5 ou 1,0 µM) durante 24 ou 48 h. Os valores são média ± EPM (n=8). * indica p <0,05 entre resveratrol e grupo de controle, e # indica p <0,05 do grupo controle (células sem DOX), pelo teste ANOVA de uma via e seguido do teste post hoc Tukey..

Figura 6

– Total de grupos sulfidrílicos de cardiomiócitos neonatais tratados com DOX (0,1, 0,5 ou 1,0 µM) por 24 h (A) ou 48 h (B). Os valores são média ± EPM (n=8). O símbolo * indica p <0,001, # p<0,01, e p<0,05 entre o grupo RV-G e o grupo C-G. O símbolo Φ indica p <0,001, $ p <0,01, e Δ p <0,05 de células controle (não expostas à DOX), pelos testes de ANOVA de uma via, seguido do teste post hoc Tukey .

A análise de correlação demonstrou que a atividade da CAT apresenta uma correlação inversa com a produção do stress oxidativo (r=-0,763, p <0,0001 e r=-0,808, p <0,0001) 24 e 48 horas após ao tratamento com DOX, respectivamente. O mesmo efeito foi verificado para a SOD, com uma correlação inversa com o stress oxidativo (r=-0,527, p <0,004 e r=-0,671, p <0,0001) 24 e 48 horas após ao tratamento com DOX, respectivamente. Particularmente, o resveratrol bloqueou a redução do teor total de grupos sulfidrila em células neonatais, nos dois momentos do tratamento com DOX ( Figura 6 ), sem efeito protetor em 1,0 µM de DOX ( Figura 6B ).

A expressão da Sirt6 e resposta aos danos ao DNA são aumentadas nos cardiomiócitos de mães suplementadas

A análise de immunoblotting demonstrou que a suplementação de ratas com resveratrol durante a gestação induziram um aumento (p <0.01) na expressão da proteína Sirt6 de cardiomiócitos neonatais em relação às células neonatais do grupo de controle. É importante notar que esse aumento da expressão de Sirt6 dependeu da concentração de DOX ( Figura 7 ).

Figura 7

– Expressão proteica de Sirt6 de cardiomiócitos neonatais tratados com DOX (0,1, 0,5 ou 1,0 µM) por 48 h (A) ou 48 h (B). O gráfico de barras corresponde à média ± EPM dos valores de quantificação da relação Sirt1/actina de todas as amostras. O símbolo * indica p <0,001, # p<0,01, e p<0,05 entre o grupo RV-G e o grupo C-G. O símbolo Φ indica p <0,001 de células controle (não expostas ao DOX), pelos testes ANOVA de uma via, e post hoc Tukey.

Discussão

Neste estudo, confirmou-se a hipótese de que o resveratrol, presente na dieta materna durante o período gestacional, tem um efeito cardioprotetor na toxicidade induzida por DOX na cultura de cardiomiócitos da ninhada, por meio do aumento no sistema de defesa antioxidante e na resposta ao dano de DNA.

A cardiotoxicidade relacionada à concentração de DOX foi observada em cardiomiócitos de neonatos de mães que não receberam resveratrol, com um aumento da morte celular. Confirmando os mecanismos de toxicidade celular induzida por DOX elucidados previamente, neste estudo a apoptose também foi o principal mecanismo da morte dos cardiomiócitos. A suplementação materna com 2,5 mg/kg de resveratrol por dia, durante o período gestacional, protegeu o coração neonatal contra a cardiotoxicidade induzida por DOX, com um aumento na viabilidade celular, também diminuindo as células apoptóticas, o que correlacionou-se com a redução da produção do stress oxidativo às 24 e 48 horas. Além disso, o resveratrol evitou a redução da atividade de SOD induzida por DOX e levou ao aumento da atividade do CAT, em células neonatais de mães que receberam o suplemento. Além das enzimas antioxidantes, os cardiomiócitos neonatais de mães que receberam resveratrol apresentaram um aumento no teor total de grupos sulfidrila, protegendo contra os efeitos oxidativos induzidos por DOX. Esses resultados são favoráveis à hipótese de que a suplementação materna com resveratrol durante a gestação pode modular respostas a agentes estressantes da prole.

A DOX é uma droga quimioterápica frequentemente utilizada na clínica, apesar de seus efeitos cardiotóxicos cumulativos dependentes da dose. [1] O desenvolvimento de estratégias terapêuticas adicionais para reduzir os efeitos colaterais do tratamento é essencial, tendo em vista o aumento da expectativa de vida por décadas após a terapia anticâncer. Pesquisas experimentais e clínicas, bem como a medicina preventiva destacam os benefícios do resveratrol em doenças cardiovasculares e metabólicas, [10] e, mais recentemente, nas ninhadas de animais que receberam o resveratrol durante a gestação. [18 , 19]

Estruturalmente, o resveratrol pode ser apresentado em isoformas cis ou trans , com uma atividade biológica relacionada principalmente ao isômero trans. [35] Devido aos anéis aromáticos presentes em sua estrutura, o resveratrol age como antioxidante, neutralizando radicais de hidroxila e a geração de stress oxidativo. [36] Além disso, outros efeitos protetores no sistema cardiovascular podem estar relacionados a sua ação de neutralização do H 2 O 2 , retardando o stress oxidativo e evitando a morte celular endotelial induzida por ERO. [37] Como o resveratrol consegue cruzar a membrana placentária, afetando o feto diretamente, [18] é possível que os efeitos cardioprotetores observados no estudo sejam uma ação direta do resveratrol na neutralização de ERO induzido por DOX. Além disso, a redução na produção do stress oxidativo também pode se dever a uma regulação do sistema de defesa antioxidante enzimático e não enzimático, que, por sua vez, neutraliza o ciclo fútil da produção de ERO durante a metabolização mitocondrial de DOX. Alinhado a isso, dados recentes publicados por nosso grupo demonstraram que uma regulação do sistema de defesa antioxidante nos cardiomiócitos neonatais é induzida pelo exercício durante a gestação, e protege células neonatais contra a toxicidade induzida por DOX. [9]

A DOX forma adutos com o DNA, que pode ativar respostas aos danos ao DNA e induzir a morte celular independentemente da topoisomerase II. [38] A DOX também age como um veneno da topoisomerase II, gerando quebras de dupla hélice no DNA e morte celular. [39] A ação celular da DOX também envolve danos à cromatina, mediada pela expulsão de histonas em sítios específicos do genoma. [3] Por outro lado, a DOX pode mediar a morte celular pela geração de stress oxidativo que pode resultar no dano ao DNA. [2 , 40] Recentemente, foi proposto por Qiao et al., [41] que a cardiotoxicidade induzida por DOX exige a combinação de ambas atividades celulares, particularmente a combinação de danos ao DNA e à cromatina induzidos pela cardiotoxicidade. Além disso, o dano à cromatina causado pela expulsão de histonas no genoma é apontada como ação essencial para a eficácia quimioterápica do fármaco, que deve ser desatrelada das quebras de dupla hélice e danos ao DNA nas células, que, em conjunto, são responsáveis pela cardiotoxicidade da DOX. [3 , 41]

Nesta pesquisa, células neonatais tratadas com DOX apresentaram um aumento de danos oxidativos ao DNA, avaliadas pelas atividades das enzimas FPG e EndoIII, que estavam correlacionadas ao aumento da produção do stress oxidativo gerado pela DOX. Entretanto, células neonatais de mães que receberam resveratrol apresentaram uma redução das quebras de DNA, através da avaliação por EndoIII ou FPG. Essa cardioproteção oferecida pelo resveratrol pode ser devida a seu perfil antioxidante, conforme mencionado anteriormente, já que consegue atravessar a barreira placentária. Entretanto, mecanismos adicionais podem estar envolvidos, tais como a regulação das enzimas reparadoras dos danos ao DNA.

Alinhado a isso, a Sirt6 é uma desacetilase de histonas (HDAC) com um papel central no reparo do DNA. [42 , 43] Nossos resultados demonstraram que os cardiomiócitos neonatais, de ratos que receberam resveratrol, expostos à DOX, demonstraram um aumento na expressão da Sirt6, que pode ser justificado pela ação protetora do resveratrol no dano ao DNA induzido em nosso modelo. A Sirt6 é uma proteína scaffold que, após os danos ao DNA, é atraída a quebras de hélices, ativando agentes de reparo de danos ao DNA para um reparo eficiente. [42 , 44] Além disso, a Sirt6 liga-se à PARP-1, uma enzima com função importante na regulação de processos celulares e subcelulares, incluindo reparo ao DNA, ciclo celular, expressão genética, e morte celular. [45 , 46]

De forma semelhante a outras HDACs, classe III, a atividade da Sirt6 é dependente da NAD + - uma coenzima com papel central nas reações metabólicas de oxi-redução. [47] Essa relação entre NAD + e Sirt6 no coração é confirmada durante uma situação de hipertrofia cardíaca, em que os níveis de NAD + diminuem e a Sirt6 é inativada. [44] A cardioproteção oferecida pelo resveratrol nesse modelo pode se dever ao aumento dos níveis de NAD + , já que o resveratrol inibe a atividade de síntese de ATP na mitocôndria ligando-se à subunidade G e prejudicando a fosforilação de ATP na mitocôndria. [48] Consequentemente, o resveratrol aumenta a proporção AMP/ATP, ativando a AMPK (proteína quinase ativada por AMP), [49] aumentando a NAD + , que agem como sensor metabólico da ativação da Sirt6. Demonstrou-se também que o resveratrol protege fibroblastos embrionários contra a cardiotoxicidade induzida por DOX pela ativação da AMPK, por meio de uma diminuição da produção de ERO. [50]

Entretanto, a expressão da Sirt6 não foi alterada em cardiomiócitos neonatais de ratas do grupo controle, que exibiram um aumento nos danos oxidativos ao DNA induzidos pela DOX e produção de stress oxidativo, sugerindo que a falta de cardioproteção é dependente da expressão da Sirt6. Notadamente, a expressão da Sirt6 não foi alterada em cardiomiócitos não expostos a DOX, independentemente da suplementação materna com resveratrol. Como a Sirt6 é vista como uma proteína de defesa, que ativa vias de defesa para sobrevivência em situações estressantes, tais como o dano hipóxico ou hipertrofia cardíaca, [44 , 51] é possível que a toxicidade induzida por DOX sobre cardiomiócitos foi o gatilho para sua atividade.

Portanto, nesse estudo, o efeito benéfico do resveratrol na toxicidade induzida por DOX no coração de filhotes de ratos foi demonstrado, pela primeira vez, por meio da suplementação das mães durante a gestação. Em relação às propriedades antioxidantes do resveratrol observadas nesta pesquisa, a maioria de seus efeitos cardioprotetores foi mediada pela superexpressão da Sirt6 e aumento da resposta aos danos ao DNA, preservando a integridade do DNA. Esses efeitos, juntamente com a modulação de enzimas antioxidantes e redução de stress oxidativo celular, contribuem para a sobrevivência de cardiomiócitos sob toxicidade induzida por DOX. Entretanto, são necessários estudos adicionais para definir o papel dos alvos de desacetilação da Sirt6, e epigenética no fenótipo cardioprotetor gerado pelo resveratrol na ninhada nesse modelo de cardiotoxicidade induzida por DOX.

Limitações

As principais limitações deste estudo foram a impossibilidade de se utilizar métodos para quantificar a dosagem de resveratrol no sangue dos filhotes, o que poderia evidenciar ou excluir a possibilidade de efeito direto do resveratrol. Além disso, a avaliação dos alvos de desacetilação da Sirt6 poderia esclarecer o papel da modulação epigenética neste modelo.

Conclusão

Nossa pesquisa demonstra, pela primeira vez, que a administração de baixas doses de resveratrol durante a gestação pode proteger cardiomiócitos de filhotes contra a toxicidade induzida por DOX. Essa proteção ocorreu pela regulação do stress oxidativo pelo sistema de defesa antioxidante e o aumento da resposta ao reparo dos danos ao DNA, mediada pela superexpressão da Sirt6. Tomados em conjunto, esses resultados denotam um envolvimento importante do ambiente materno nas respostas a agentes estressantes da prole durante toda a vida.

Introduction

Anthracycline doxorubicin (DOX) is a chemotherapeutic agent generally used to treat leukemia and a wide range of solid tumors.[1] Its cytotoxic action in tumor cells is related to topoisomerase II inhibition; DNA intercalation and damage, producing double-strand breaks; and an increase in the generation of free radicals, which compromises the replication and transcription process.[2] Recently, DOX has been proven to evict histones from specific regions in the genome, causing chromatin damage with consequent epigenomic and transcriptional alterations.[3]

The treatment with DOX can cause severe side effects, showing a limited therapeutic action due its strong cardiotoxicity, which can lead to dose-dependent cardiomyopathy.[4] At the intracellular level, many pathways may be involved in DOX-induced toxicity. In many of these, reactive oxygen species (ROS) generated by DOX metabolism play an important role in the outcome of myocardial dysfunction due to oxidative stress.[5]

It is currently unclear whether the adverse effects of treatment with DOX are necessary for its anti-tumor efficacy. With a look at its cardiotoxicity, some strategies to reduce toxicity have been investigated, but to date the iron chelating agent dexrazoxane is clinically an alternative method for preventing DOX-induced cardiotoxicity.[6]

Therefore, the present challenge is to design a cardioprotective protocol for short or long treatments with DOX, without hampering its antitumor activity. Many therapeutic strategies, such as supplementation with antioxidants or an increase in antioxidant capacity by exercise, have already been proposed to restrain DOX toxicity.[7 , 8] Remarkably, recently published data by our research group have demonstrated that maternal exercise during pregnancy is able to reduce the DOX-induced cardiotoxic effects on cardiomyocytes of rat pups.[9]

In line with this, resveratrol is a polyphenolic compound that has received attention due to its potential protection against cardiovascular diseases.[10] Its cardiovascular benefits are related to the effects on biological systems - preventing platelet aggregation,[11] decreasing the expression of nitric oxide synthase,[12] exerting antioxidant effects, and scavenging free radicals.[13] The global demand for more reasonable therapeutics has identified important features for human health in resveratrol associated with cost-effectiveness: low toxicity and high availability.[14] Moreover, the interest in this bioactive compound recently increased after the identification of its protective action against skin cancer.[15]

Bioactive molecules present in the rats’ maternal diet have received recent importance due their participation in the offspring’s metabolism reprograming.[16 , 17] As resveratrol crosses the placental membrane, supplementation by the mother during pregnancy has already been associated with beneficial effects in experimental models, such as preventing embryo death in the course of gestational diabetes[18] and controlling hypertension in the progeny of spontaneously hypertensive animals.[19] However, the cardioprotective effect on the offspring of resveratrol present in the maternal diet has not yet been investigated.

Therefore, considering the bioactive effects of resveratrol on cardiovascular diseases, this study tested the hypothesis that resveratrol, present in the maternal diet during the gestational period, has a cardioprotective effect on DOX-induced toxicity in an offspring cardiomyocyte culture through its possible effects on the antioxidant defense system and the response to DNA damage.

Methods

Animals

Adult female and male Wistar rats (Center of Animals Reproduction of the UFCSPA), weighing 70-100 g were housed under controlled light, temperature, and humidity conditions (12h light/dark period, at 22ºC ± 2, and 55% ± 5 relative humidity), with water and standard diet ad libitum . This research was conducted according to national and institutional guidelines on the use of animals for science, approved by the UFCSPA Ethics Committee, and logged under protocol number 183/13.

Experimental protocol

The mating procedure was conducted after the first estrous period. On the subsequent morning after the mating procedure, vaginal smears were analyzed to detect spermatozoon, which was the confirmation of the gestational day zero. Subsequently, the females were assigned to the following groups:

Control group (C-G, n=8): without supplementation with resveratrol. These received saline solution with 0.05% of Tween 80 by gavage, and were manipulated once a day, 5 days/week, during 21 gestational days, totaling 15 days of gavage.

Resveratrol group (RV-G, n=8): supplemented with resveratrol 2.5 mg/Kg body weight[20] (dispersed in saline with 0.05% of Tween 80)[21] by gavage (once a day, 5 days/week, during 21 gestational days, totaling 15 days of supplementation).

For the estimation of sample size, the research of Singh et al.[18] was used as the reference. For this, a two tailed-test was applied, with a significance level at 5% and a power of 95%. A minimal difference between groups of 12 ŋmol/mg protein was estimated, with a 0.096 standard deviation, to result in a significant evaluation of a sulfhydryl test, used for sample estimation. The sample size estimation resulted in eight animals per group.

At the end of the gestational period, pups up to 3 days old were euthanized and their hearts[9 - 11] were used to obtain a pool of cardiomyocytes used for the primary culture, as demonstrated in a simplified time line in Figure 1 .

Figure 1

– Simplified time line of the experimental protocol.

Cardiomyocyte culture

The primary culture from hearts of neonatal rats was obtained as previously described by our research group.[9] Briefly, the hearts were submitted to repeated cycles of an enzymatic digestion in a buffer containing pancreatin and BSA, at 37°C. At the end of the cycles, the pool of cells was plated in a 75 cm2bottle culture for fibroblast adhesion. The cell suspension was aspirated, centrifuged, and plated in culture plates treated with gelatin (0.1% in PBS) for cardiomyocyte adhesion. When the cells had acquired confluence, the culture was treated with DOX (0.1, 0.5 or 1.0 µM) for 24 or 48 h for the analysis described below. All experiments were conducted in triplicates to ensure the accuracy of the results.

Assay of cell viability and mechanisms of death

The trypan blue (TB) test was used to evaluate the viability of cells.[22] The number of viable and dead cells was counted in an Automated Cell Counter (Countess®), which enables the estimation of the percentage of viable cells (ratio of viable cells/total cells). Thereafter, the mechanism of death was evaluated by the flow cytometric analysis. After DOX treatment, the cardiomyocyte culture was washed, centrifuged, and resuspended in binding buffer (100 µL) with Annexin V-PE (3 μL) and 7-AAD (3 μL), and then incubated in the dark for 15 min. Analyses by flow cytometry, considering 5,000 events/sample, were used to access the viable, apoptotic, or necrotic cells (FACS Calibur with CellQuest software).

DNA damage detection

The DOX-induced genotoxicity was assessed by the DNA damage index, through the previously described alkaline comet assay.[23 , 24] After treatment, the cardiomyocyte culture was washed, trypsinized, centrifuged, and resuspended in PBS. Thirty μL of cell suspension was dissolved in 0.75% agarose (low melting) which was distributed on a slide pre-covered with 1% agarose (normal melting point). Microscope slides were then incubated in a lysis solution during 24 hours at 4°C. To evaluate the presence of oxidative damage in DNA, slides were withdrawn from the lysis solution, washed, and incubated with repair enzymes - endonuclease III (EndoIII) or formamidopyrimidine glycosylase (FPG) - (300 mU/gel; 45 min 37°C). After lysis and/or incubation with EndoIII or FPG, DNA was unwound for 20 min in a horizontal electrophoresis system containing fresh alkaline buffer (300 mM NaOH/1 mM EDTA at pH 13.0). The DNA expression alkali-labile sites occurred by migration of DNA damage under an electric current (25 V; 300 mA; 0.9 V/cm). Slides were neutralized and stained beforehand as previously described;[25] 100 cells/slide were visualized by optical microscopy and scored according to the method previously described above.[26]

Cardiomyocyte protein extracts

After 24 or 48 hours of treatment with DOX, the cell medium was removed and protein extracts of cardiomyocytes were prepared as previously described,[9] which were used for all additional analyses described below.

Quantification of oxidative stress

Dichlorofluorescein diacetate (H2DCF-DA) is a probe that is hydrolyzed by esterases of intracellular medium to form a non-fluorescent H2DCF that is oxidized by intracellular oxidants into a fluorescent dichlorofluorescein (DCF).[27] Briefly, H2DCF-DA was incubated with cardiomyocyte protein extract as previously described,[9] and the intensity of fluorescence was measured in a microplate reader (SpectraMax M2℮, Molecular Devices, California) at 480 ηm (EX) and 535 ηm (EM).

Antioxidant defense system

The activity of the antioxidant defense system of neonatal cardiomyocytes was evaluated by means of catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD) enzymatic activity, as previously described.[28 , 29] Total sulfhydryl content, which inversely correlated with the oxidative damage in proteins, was estimated by the method previously described.[30]

DNA damage response

The response of cardiomyocytes to DNA damage DOX-induced was assessed by immunoblotting analysis of Sirt6 (sirtuin6), a histone deacetylase that acts as a scaffold protein in DNA damage repair. For this assay, 25 μg of a cardiomyocyte protein were separated by a 12% SDS-PAGE in a previously described method.[31] Membranes were incubated with anti-sirt6 and actin (C-2), at 1:500. Blot was revealed using a chemiluminescence kit (ECL, Thermo Scientific). Optical densities of immunoblots were determined with the ImageJ 1.48v software (Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA).

Protein quantification

Protein concentration of the protein extracts was determined as previously described.[32]

Statistical analysis

Data were analyzed using the Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) version 16.0 (IBM Company, Armonk, NY, USA). Normal distribution and homogeneity of variances were evaluated by the Kolmogorov-Smirnov and Levene’s tests, respectively. One-way Analysis of Variance (ANOVA) and Tukey post-hoc test were used by comparison between groups. Correlations were performed by Pearson’s correlation coefficient. Data were expressed as mean ± standard error of mean (S.E.M) and a p<0.05 was considered significant.

Results

Resveratrol attenuated DOX-induced apoptosis and necrosis in neonatal cardiomyocytes

The effects of maternal supplementation with resveratrol during pregnancy were initially evaluated by the trypan blue (TB) exclusion test ( Figure 2 ), which demonstrated a concentration-dependent DOX-induced cell death. However, supplementation with resveratrol during pregnancy protected neonatal cells from death induced after 48 h of DOX treatment with 1.0 or 0.5 µM DOX ( Figure 2B ), in relation to neonatal cardiomyocytes from non-supplemented rats.

Figure 2

– Viability of neonatal cardiomyocytes exposed to DOX (0.1, 0.5 or 1.0 µM) for 24 h (A) or 48 h (B), by trypan blue (TB) exclusion test. Cardiomyocyte culture of the offspring from rats supplemented (2.5 mg/Kg) with resveratrol (RV-G) or the control group (C-G). Values are mean±S.E.M (n=8). Symbol * indicates p<0.001, # p<0.01, and & p<0.05 between RV-G and C-G. Symbol Φ indicates p<0.001, $ p<0.01, and Δ p<0.05 from control cells (not exposed to DOX), by One-Way ANOVA, Tukey post-hoc test.

Subsequently, the main mechanism of cardiomyocyte death was explored by flow cytometry ( Figure 3 ). The results confirmed those obtained by TB assay, showing an increase in cardiomyocyte death related to DOX treatment, exhibiting the highest fraction of cell death by apoptosis at a concentration of 1 µM DOX (p<0.001). These results also demonstrate that apoptosis is the main mechanism of death induced by DOX in neonatal cardiomyocytes ( Figure 3A ), corroborating previous results from our research group.[9] Moreover, the resveratrol protected neonatal cardiomyocytes against DOX-induced death 48 h after treatment, with an increase in viable cells (p<0.001) and decrease in apoptotic and necrotic cells (p<0.001) ( Figure 3B ).

Figure 3

– Cardiomyocyte culture of the offspring from rats supplemented (2.5 mg/Kg) with resveratrol (RV-G) or the control group (C-G) were analyzed by flow cytometry analysis. After 24 h (A) or 48 h (B) of DOX treatment (DOX (0.1, 0.5 or 1.0 µM), viability, apoptosis, or necrosis of neonatal cardiomyocytes were analyzed. Control indicates cells without DOX. Values are mean±S.E.M, n=8. Symbol * indicates p<0.001, # p<0.01, and & p<0.05 between RV-G and C-G. Symbol Φ indicates p<0.001, $ p<0.01, and Δ p<0.05 from control cells (not exposed to DOX), by One-Way ANOVA, Tukey post-hoc test.

Oxidative stress is attenuated in neonatal cells by gestational resveratrol supplementation

The most accepted mechanism for DOX-induced toxicity is the formation of ROS, which in turns leads to the formation of oxidative stress.[5]Figure 4A and B show that neonatal cardiomyocytes exposed to DOX showed an increase (p<0.001) in intracellular oxidant production, in relation to the Control (cells not exposed to DOX). Importantly, supplementation of mothers with resveratrol during pregnancy attenuated (p<0.05) oxidative stress in neonatal cells after treatment with 0.5 or 1.0 µM DOX ( Figure 4B ) in relation to the control group (C-G). Moreover, cell viability and oxidative stress production, also measured by DCF oxidation, are inversely correlated, both at 24 and 48 h (r=-0.8, p<0.0001 and r=-0.789, p<0.001), respectively. Notably, a direct correlation between intracellular oxidative stress production and apoptosis (r=0.836, p<0.0001, r=0.817, p<0.0001) was observed after DOX treatment, 24 h and 48 h respectively.

Figure 4

– Oxidative stress in neonatal cardiomyocytes treated with DOX (0.1, 0.5 or 1.0 µM) for 24 h (A) or 48 h (B). Values are mean±S.E.M, n=8. Symbol & indicates p<0.05 between RV-G and C-G. Symbol Φ indicates p<0.001, $ p<0.01, and Δ p<0.05 from control cells (not exposed to DOX), by One-Way ANOVA, Tukey post-hoc test.

Resveratrol reduces oxidative DNA damage DOX-induced in neonatal cardiomyocytes

The DOX-induced genotoxic stress was evaluated by the alkaline Comet assay, which detects alkali-labile sites and strand breaks in the DNA.[33] The results show an increase in DNA damage induced by DOX in neonatal cells from all groups of mothers ( Figure 5A-B ), which was concentration-dependent. However, gestational supplementation with resveratrol protected cardiomyocytes from DNA damage induced by DOX.

Figure 5

– DNA damage in cardiomyocytes treated with DOX (0.1, 0.5 or 1.0 µM) for 24 h (A) or 48 h (B). Oxidative DNA damage was analyzed by endonuclease III (EndoIII) and formamidopyrimidine glycosylase (FPG) enzymes in cells treated with DOX for 24 h (C and E) or 48 h (D and F). Values are mean±S.E.M, n=8. Symbol * indicates p<0.001, # p<0.01, and & p<0.05 between RV-G and C-G. Symbol Φ indicates p<0.001, $ p<0.01, and Δ p<0.05 from control cells (not exposed to DOX), by One-Way ANOVA, Tukey post-hoc test.

Considering that DOX-induced oxidative stress production was reduced (p<0.05) by resveratrol ( Figure 4 ), the evaluation of the DNA damage related to the DOX-generated oxidative stress becomes an important question. Thus, the activity of DNA-repair enzymes of endonuclease III (EndoIII) and formamidopyrimidine glycosylase (FPG) were examined, which improve the Comet test specificity, recognizing damaged bases by oxidative stress and converting them into single-strand breaks.[26 , 34]Figure 5 (C-F) shows the magnitude of oxidative damage in the DNA caused by DOX treatment, which was recognized by the repair enzymes. Notably, neonatal cardiomyocytes from supplemented mothers exhibited a decrease (p<0.001) in oxidative damage observed in DNA. Additionally, resveratrol supplementation was able to decrease oxidative DNA damage of neonatal cardiomyocytes not exposed to DOX, both 24 and 48 h after DOX treatment.

Neonatal cardiomyocytes from resveratrol supplemented mothers showed a more efficient antioxidant defense system

With the purpose of evaluating whether resveratrol effects on oxidative stress generation and DNA damage are associated with an increase in the antioxidant defense system, the activities of CAT and SOD enzymes ( Table 1 ) were examined, as was the total sulfhydryl content ( Figure 6 ). DOX reduced SOD and CAT activities in neonatal cardiomyocytes from control mothers when compared to resveratrol supplemented neonatal cells ( Table 1 ).

Table 1

– Effects of gestational supplementation with resveratrol on SOD and CAT activities of neonatal cardiomyocytes exposed to DOX

	Control	Resveratrol	Control	Resveratrol
	SOD (U/mg protein)
	24 hours		48 hours
Control	4.61 ± 0.31	6.26 ± 0.61*	4.46 ± 0.15	6.00 ± 0.73
0.1 µM DOX	3.90 ± 0.39	5.31 ± 0.19*	3.98 ± 0.05#	6.06 ± 0.50*
0.5 µM DOX	3.22 ± 0.42#	5.22 ± 0.37*	3.03 ± 0.37#	5.12 ± 0.42*
1.0 µM DOX	2.83 ± 0.20#	5.56 ± 0.32*	2.53 ± 0.54#	5.19 ± 0.69*
	CAT (U/mg protein)
	24 hours		48 hours
Control	12.15 ± 1.25	24.08 ± 1.31*	12.30 ± 0.54	27.11 ± 1.28*
0.1 µM DOX	6.16 ± 0.41#	13.00 ± 2.15*#	7.85 ± 0.59#	13.56 ± 1.31*#
0.5 µM DOX	4.04 ± 0.28#	9.47 ± 1.26*#	5.35 ± 0.36#	12.24 ± 1.94*#
1.0 µM DOX	2.62 ± 0.11#	8.78 ± 1.86*#	2.68 ± 0.75#	8.36 ± 0.80*#

Cells were treated with DOX (0.1, 0.5 or 1.0 µM) during 24 or 48 h. Values are mean ± S.E.M (n=8). * indicates p < 0.05 between resveratrol and control group, and # indicates p < 0.05 from Control (cells without DOX), by One-Way ANOVA, Tukey post-hoc test.

Figure 6

– Total sulfhydryl groups of neonatal cardiomyocytes treated with DOX (0.1, 0.5 or 1.0 µM) for 24 h (A) or 48 h (B). Values are mean±S.E.M (n=8). Symbol * indicates p<0.001, # p<0.01, and & p<0.05 between RV-G and C-G. Symbol Φ indicates p<0.001, $ p<0.01, and Δ p<0.05 from control cells (not exposed to DOX), by One -Way ANOVA, Tukey post-hoc test.

Correlation analysis demonstrated that CAT activity showed an inverse correlation with oxidative stress production (r=-0.763, p<0.0001 and r=-0.808, p<0.0001) both at 24 and 48 h after DOX treatment, respectively. The same effect was verified for SOD, with an inverse correlation with oxidative stress (r=-0.527, p<0.004 and r=-0.671, p<0.0001) at 24 and 48h of DOX treatment, respectively. Particularly, resveratrol blocked the decrease in total sulfhydryl content in neonatal cells, in both times of DOX treatment ( Figure 6 ), without a protective effect at 1.0 μM DOX ( Figure 6B ).

Sirt6 expression and response to DNA damage are increased in cardiomyocytes from supplemented mothers

Immunoblotting analysis showed that resveratrol supplementation of rats during pregnancy induced an increase (p<0.01) in the expression of the Sirt6 protein of neonatal cardiomyocytes in relation to neonatal cells from the controls. Importantly, this increase in Sirt6 expression was dependent on the DOX concentration ( Figure 7 ).

Figure 7

– Sirt6 protein expression of neonatal cardiomyocytes treated with DOX (0.1, 0.5 or 1.0 µM) for 48 h. Bar graph corresponds to mean±SE.M of the quantification values of Sirt1/Actin ratio from all samples. Symbol * indicates p<0.001 and # p<0.01 between RV-G and C-G. Symbol Φ indicates p<0.001 from control cells (not exposed to DOX), by One-Way ANOVA, Tukey post-hoc test.

Discussion

The present study confirmed the hypothesis that resveratrol, present in the maternal diet during the gestational period, has a cardioprotective effect on DOX-induced toxicity in an offspring cardiomyocyte culture, through an increase in the antioxidant defense system and the response to DNA damage.

A concentration-related cardiotoxicity induced by DOX was observed in neonatal cardiomyocytes from non-supplemented mothers, with an increase in cell death. In accordance with previously elucidated mechanisms of cell toxicity induced by DOX, in this study, apoptosis was also the main mechanism of cardiomyocyte death. Maternal supplementation with 2.5 mg/Kg resveratrol per day, during the gestational period, protected neonatal heart against DOX-induced cardiotoxicity, with an increase in cell viability, also decreasing the apoptotic cells, which was correlated with the decrease in oxidative stress production both at 24 and 48 hours. Moreover, resveratrol prevented the decrease in DOX-induced SOD activity and led to an increment in CAT activity, in neonatal cells from supplemented mothers. Besides antioxidant enzymes, neonatal cardiomyocytes from resveratrol supplemented mothers exhibited an increase in total sulfhydryl content, thus protecting against the oxidative effects induced by DOX. These results are favorable to the hypothesis that maternal supplementation with resveratrol during pregnancy can modulate the responses to stressful agents of progeny.

DOX is a chemotherapeutic drug frequently used in clinics, despite its dose-related cumulative cardiotoxic effects.[1] Development of additional therapeutic strategies to reduce the treatment outcomes is essential, considering the increase in life expectancy for decades after anti-cancer therapy. Experimental and clinical studies, as well as preventive medicine, have highlighted the benefits of resveratrol on cardiovascular and metabolic diseases,[10] and more recently on the offspring of animals that received resveratrol during pregnancy.[18 , 19]

Structurally, resveratrol can be present in cis or trans isoforms, with a biological activity mainly related to trans isomer.[35] Due to the aromatic rings present in its structure, resveratrol acts as an antioxidant, scavenging hydroxyl radicals and the generation of oxidative stress.[36] Additionally, other protective effects on the cardiovascular system can be related to its scavenging action on H2O2, delaying the oxidative stress and preventing endothelial ROS-induced cell death.[37] Since resveratrol is able to cross the placental membrane, directly affecting the fetus,[18] it is possible that the cardioprotective effects observed in this study might be a direct action of resveratrol in the scavenging of DOX-induced ROS. Moreover, the decrease in oxidative stress production can also be due to an upregulation of the enzymatic and non-enzymatic antioxidant defense system, which in turn defuses the futile cycle of ROS production during DOX mitochondrial metabolization. In line with this, recent data published by our group demonstrated that an up-regulation of the antioxidant defense system in neonatal cardiomyocytes is induced by exercise during pregnancy and protects neonatal cells against toxicity induced by DOX.[9]

DOX forms adducts with DNA, which can activate DNA damage responses and induce cell death regardless of topoisomerase II.[38] DOX also acts as a topoisomerase II poisoning, generating double-strand DNA breaks and cell death.[39] Cell action of DOX also involves the chromatin damage, mediated through histone eviction at specific genomic sites.[3] By contrast, DOX can mediate cell death through the generation of oxidative stress that results in DNA damage and cell death.[2 , 40] It was recently proposed by Qiao et al.[41] that DOX-induced cardiotoxicity requires the combination of both cell activities, particularly the combination of DNA and chromatin damage induced by cardiotoxicity. Moreover, chromatin damage caused by the eviction of histones in the genome is highlighted as the essential action for the drug’s chemotherapeutic efficacy, which must be uncoupled of double-strand breaks and DNA damage in cells, which together are responsible for the cardiotoxicity of DOX.[3 , 41]

In our research, neonatal cells treated with DOX exhibited an increase in oxidative DNA damage, evaluated by the activities of FPG and EndoIII enzymes, which was correlated with the increase in oxidative stress production generated by DOX. However, neonatal cells from supplemented mothers showed a reduction in DNA strand-breaks through EndoIII or FPG evaluation. This cardioprotection provided by resveratrol may well be due to its antioxidant profile, as mentioned above, since it is able to cross the placental barrier. However additional mechanisms can be involved, such as a regulation of DNA damage repair enzymes.

In line with this, Sirt6 is a histone deacetylase (HDAC) with a key role in DNA repair.[42 , 43] Our results demonstrated that neonatal cardiomyocytes, from supplemented rats exposed to DOX, showed an increase in Sirt6 expression, which can justify the protective action of resveratrol on the DNA damage induced in our model. Sirt6 is a scaffold protein that, following DNA damage, is attracted to strand break sites, activating DNA damage repair agents toward an efficient repair.[42 , 44] Moreover, Sirt6 binds to PARP-1, an enzyme with an important function in the regulation of cellular and subcellular processes, including DNA repair, cell cycle, gene expression, and cell death.[45 , 46]

Similarly to other class III HDACs, the activity of Sirt6 is dependent of NAD+- a coenzyme with a core role in the metabolic redox reactions.[47] This relationship between NAD+and Sirt6 in the heart is confirmed during a cardiac hypertrophy situation, where NAD+levels decrease and Sirt6 is inactivated.[44] The cardioprotection given by resveratrol in this model may well be due to the increase in NAD+levels, since the resveratrol inhibits mitochondrial ATP synthase activity by binding to its G-subunit, hindering mitochondrial ATP phosphorylation.[48] Consequently, resveratrol raises the ratio AMP/ATP, activating the energy-sensing AMPK (AMP-activated protein kinase),[49] and increases NAD+, which act as a metabolic sensor to Sirt6 activation. It was also shown that resveratrol protects mouse embryonic fibroblasts against DOX-induced cardiotoxicity through the activation of AMPK and through a decrease in ROS production.[50]

However, Sirt6 expression was not changed in neonatal cardiomyocytes from the control group, which exhibited an increase in DOX-induced oxidative DNA-damage and oxidative stress production, suggesting that the lack of cardioprotection is dependent on Sirt6 expression. Notably, Sirt6 expression was not changed in the cardiomyocytes that were not exposed to DOX, regardless of maternal supplementation with resveratrol. As Sirt6 is viewed as a defense protein, which activates its defense pathways to survive under stressful situations, such as hypoxic damage to heart or cardiac hypertrophy,[44 , 51] it is possible that the DOX-induced toxicity on cardiomyocytes was the missing trigger.

Therefore, in this study, the beneficial effects of resveratrol on toxicity induced by DOX on the hearts of rat pups was demonstrated, for the first time through the supplementation of mothers during pregnancy. Regarding the antioxidant properties of resveratrol observed in this research, most of its cardioprotective effects were mediated by the overexpression of Sirt6 and the increase in DNA damage response, preserving the DNA integrity. These effects together with the modulation of antioxidant enzymes and the reduction in cellular oxidative stress, contribute to cardiomyocyte survival under DOX toxicity. However, additional studies are necessary to define the role of Sirt6 deacetylation targets, and epigenetics in the cardioprotective phenotype generated by resveratrol in offspring in this model of DOX cardiotoxicity.

Limitations

The main limitations of this study were the impossibility of using methods to quantify the dosage of resveratrol in the blood of the offspring, which could evidence or rule out the direct effect of resveratrol. In addition, the evaluation of Sirt6 deacetylation targets could clarify the role of epigenetic modulation in this model.

Conclusion

Our study demonstrates, for the first time, that supplementation of rats with low doses of resveratrol during pregnancy is able to protect the cardiomyocytes of pups against DOX-induced toxicity. This protection occurred through the regulation of oxidative stress by the antioxidant defense system and the increase in the DNA damage repair response, mediated by Sirt6 overexpression. Taken together, these results denote an important involvement of the maternal environment in the responses to stressful agents of progeny throughout life.