[Chromosomal large fragment deletion induced by CRISPR/Cas9 gene editing system].

Objective: Using CRISPR-Cas9 gene editing technology to achieve a number of genes co-deletion on the same chromosome.
Methods: CRISPR-Cas9 lentiviral plasmid that could induce deletion of Aloxe3-Alox12b-Alox8 cluster genes located on mouse 11B3 chromosome was constructed via molecular clone. HEK293T cells were transfected to package lentivirus of CRISPR or Cas9 cDNA, then mouse NIH3T3 cells were infected by lentivirus and genomic DNA of these cells was extracted. The deleted fragment was amplified by PCR, TA clone, Sanger sequencing and other techniques were used to confirm the deletion of Aloxe3-Alox12b-Alox8 cluster genes.
Results: The CRISPR-Cas9 lentiviral plasmid, which could induce deletion of Aloxe3-Alox12b-Alox8 cluster genes, was successfully constructed. Deletion of target chromosome fragment (Aloxe3-Alox12b-Alox8 cluster genes) was verified by PCR. The deletion of Aloxe3-Alox12b-Alox8 cluster genes was affirmed by TA clone, Sanger sequencing, and the breakpoint junctions of the CRISPR-Cas9 system mediate cutting events were accurately recombined, insertion mutation did not occur between two cleavage sites at all.
Conclusion: Large fragment deletion of Aloxe3-Alox12b-Alox8 cluster genes located on mouse chromosome 11B3 was successfully induced by CRISPR-Cas9 gene editing system.

染色体大片段缺失是肿瘤基因组的一个特点[1]。染色体大片段缺失常涉及众多基因，使得研究复杂化。过去常通过研究单个基因来反映多个基因的缺失在肿瘤发生、发展中的机制，然而这种方法忽略了多个基因间的相互作用[2]。而CRISPR-Cas9基因编辑技术可实现染色体大片段缺失，设计靶向同一条染色体上两个不同位点的小向导RNA（small guide, sgRNA），Cas9核酸内切酶在sgRNA与目标DNA序列通过碱基互补配对结合的引导下对靶位点进行切割，导致DNA双链断裂，断裂后的DNA双链通过非同源重组末端连接来修复DNA，从而产生染色体大片段的缺失[3]–[4]。本研究我们运用CRISPR-Cas9基因编辑技术来实现染色体大片段的缺失，为研究染色体大片段缺失在血液系统肿瘤发生、发展中的机制提供新的技术选择。

材料与方法

1．仪器与试剂：T7E1核酸内切酶购自北京唯尚立德生物科技有限公司；DMEM培养基购自美国Life技术公司；胎牛血清购自新西兰VisTech公司；DNA纯化试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；质粒提取试剂盒购自美国OMEGA公司；Go-taq Master Mix购自美国Promega公司；限制性内切酶购自美国NEB公司；PCR@2.1载体购自美国Invitrogen公司；lentiCRISPRv2质粒购自美国麻省理工学院张峰教授实验室。

2．计算机设计sgRNA和PCR引物：选择小鼠染色体11B3上Aloxe3-Alox12b-Alox8（与人染色体17p13.1区域的ALOXE3-ALOX12B-ALOX8基因同源）基因簇作为实现染色体缺失的目标片段。sgRNA1靶向Aloxe3、Hes7基因之间的一段非编码序列，不影响Aloxe3、Hes7基因的功能；sgRNA2靶向Alox8和Gucy2e基因之间的一段非编码序列，不影响Alox8和Gucy2e基因的功能，当sgRNA1和sgRNA2引导Cas9切割靶向基因位点后，则可导致11B3染色体上Aloxe3-Alox12b-Alox8基因簇的缺失。所有sgRNA序列均在http://crispr.mit.edu/网站中设计。sgRNA1F：caccGTGCCTAGACCAGCCA CGCG，sgRNA1R：aaacCGCGTGGCTGGTCTAGG CAC；sgRNA2F：caccGCAACACCCGACAGTGAT GT，sgRNA2R：aaacACATCACTGTCGGGTGTT GC。PCR反应的引物位置设计于sgRNA1/2靶向位点的前后约1 kb基因片段处，引物在IDT-PrimerQuest Input网站（http://sg.idtdna.com/PrimerQuest/Home/Index）中设计，pr sgRNA1F序列为TGCTGTTCCCTCTTCTGATTG；pr sgRNA2R序列为GACCACACAGAGAAACCTAGTC。所有的DNA引物均由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。

3．构建CRISPR-Cas9慢病毒质粒：将sgRNA1、sgRNA2分别连入lentiCRISPRv2质粒，得到lentiCRISPRv2-sgRNA 1/2（v2-sgRNA1/2）质粒，方法参照文献[5]–[6]。ClaI和EcoRΙ酶切v2-sgRNA1作为载体，BstBI和EcoRI酶切v2-sgRNA2作为插入片段。将插入片段和载体连接后得到质粒lentiCRISPRv2-sgRNA 1-2（v2-sgRNA1-2），通过此方法可连入多个sgRNA。

4．细胞培养：HEK293T细胞培养于含1×链霉素/青霉素、10%胎牛血清的DMEM培养基中，NIH3T3细胞培养于含1×链霉素/青霉素、10%胎牛血清的DMEM培养基中，并提供37 °C、5%CO2的培养条件。两种细胞均隔天换液、传代培养。实验时取对数增长期生长状态良好的细胞。

5．转染HEK293T细胞：慢病毒质粒转染HEK293T细胞包装病毒时分为两组：细胞转染lentiCRISPRv2质粒组和转染lentiCRISPRv2-sgRNA1-sgRNA2质粒组。取生长状态良好的HEK293T细胞，转染前12 h接种在直径为10 cm培养皿中，转染前更换培养基为预热新鲜培养基，用磷酸钙共沉淀的方法转染HEK293T细胞包装病毒，方法参照文献[7]。溶液A：含目的质粒20 µg、psPAX2质粒10 µg、pMD2.G 5 µg、2 mol/L CaCl2 62.5 µl，水补足体积到500 µl；溶液B：2×HBS 500 µl。溶液B以1 200 r/min涡旋，将溶液A逐滴加入溶液B中，涡旋15 s，将混合后的液体均匀滴入HEK293T细胞中，置于37 °C、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养24 h换液，于30、36、40、48 h收集含丰富病毒的细胞培养上清。

6．病毒感染NIH3T3细胞：实验组：感染lentiCRISPRv2-sgRNA1-sgRNA2病毒的NIH3T3细胞；对照组：感染lentiCRISPRv2病毒的NIH3T3细胞。感染前12 h将NIH3T3细胞接种到10 cm培养皿中。感染时实验组加5 ml lentiCRISPRv2-sgRNA1-sgRNA2病毒、0.1% polebrene，对照组加5 ml lentiCRISPRv2病毒、0.1% polebrene。

7．PCR及Sanger测序鉴定染色体大片段缺失：NIH3T3细胞感染病毒72 h后，利用SNET裂解缓冲液（20 mmol/L Tris-Cl、5 mmol/L EDTA、400 mmol/L NaCl、1% SDS，pH 8.0）的操作步骤提取细胞全基因组，PCR引物为Aloxe3基因前的pr sgRNA 1F和Alox8基因后的pr sgRNA 2R，根据Go-taq Master Mix试剂盒说明书，PCR扩增sgRNA1和sgRNA2靶位点前后的基因片段（约75 kb）。PCR条件：94 °C预变性2 min，94 °C变性30 s，58 °C退火20 s，72 °C延伸1 min，34个循环，72 °C终止5 min。若发生了目标染色体（Aloxe3-Alox12b-Alox8基因簇）的大片段缺失则可通过PCR扩增出一段融合基因片段，若未发生染色体大片段缺失则由于PCR扩增的目的片段过大，不能扩增出任何片段。将一部分PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，分析扩增后得到的产物，将另一部分PCR产物送成都擎科梓熙生物技术有限公司进行Sanger测序。

8．TA克隆：根据DNA纯化试剂盒说明书，用DNA纯化试剂盒回收得到的PCR产物，将其连入PCR@2.1载体，连接反应条件：新鲜PCR产物3 µl、PCR@2.1载体1 µl、10×T4连接酶缓冲液1 µl、T4连接酶0.5 µl、水4.5 µl，25 °C连接1 h，将连接产物转化到Stabl3感受态细胞。连接成功后的质粒送成都擎科梓熙生物技术有限公司进行Sanger测序。

结果

1．成功构建CRISPR-Cas9慢病毒质粒：图1为构建成功质粒的简化示意图。该质粒为慢病毒载体，其转染包装细胞后产生的慢病毒可携带外源sgRNA和Cas9基因整合到目的细胞中，从而实现对目的基因的有效编辑。

图1

v2-sgRNA1-2质粒构建示意图

2．PCR鉴定染色体大片段缺失：设计的sgRNA1靶向Aloxe3和Hes7基因之间的一段非编码序列，sgRNA2靶向Alox8和Gucy2e基因之间的一段非编码序列，sgRNA1和sgRNA2之间的基因片段大小为75 kb，sgRNA1和sgRNA2引导Cas9切割靶向基因位点后，可导致小鼠染色体11B3上Aloxe3-Alox12b-Alox8基因簇发生大片段缺失，原理如图2所示。

图2

染色体大片段缺失示意图

提取实验组、对照组NIH3T3细胞的基因组后，通过PCR扩增Aloxe3-Alox12b-Alox8基因簇缺失后形成的融合片段，PCR产物行琼脂糖凝胶电泳，发现实验组通过PCR可以扩增出一条近1 kb的片段，对照组未扩增出任何片段。这表明sgRNA1、sgRNA2成功靶向了目的基因的位置，并且引导Cas9核酸内切酶对靶位点进行切割，导致染色体大片段（Aloxe3-Alox12b-Alox8基因簇）发生了缺失（图3）。

图3

PCR鉴定染色体大片段缺失

3．Sanger测序检测染色体达片段缺失情况：提取实验组NIH3T3细胞全基因组后，通过PCR扩增Aloxe3-Alox12b-Alox8基因簇缺失后形成的融合片段。将PCR产物直接进行Sanger测序，测序结果在Ensembl数据库（http://asia.ensembl.org）中进行匹配，结果显示Aloxe3-Alox12b-Alox8基因簇发生了缺失，Aloxe3基因前的片段和Alox8基因后的片段发生了融合（图4）。表明在sgRNA1和sgRNA2结合到小鼠11B3染色体上的靶位点后，Cas9核酸内切酶对靶位点进行切割，断裂后的DNA双链通过非同源重组末端连接修复了断裂的染色体，从而产生染色体大片段缺失。

图4

Sanger测序结果

4．TA克隆鉴定染色体大片段缺失的具体情况：提取实验组NIH3T3细胞全基因组后，通过PCR扩增Aloxe3-Alox12b-Alox8基因簇缺失后形成的融合基因片段。将PCR产物连入PCR@2.1载体，对TA克隆成功的质粒进行Sanger测序，结果表明在sgRNA1、sgRNA2之间的Aloxe3-Alox12b-Alox8基因簇发生了丢失，断裂的染色体片段发生了准确的重组，并且连接处未发生任何碱基插入突变（图5）。

图5

TA克隆产物测序结果

红色碱基：sgRNA位置；蓝色碱基：共同序列；—：缺失突变；WT：野生型；1、2、3：TA克隆成功的质粒

讨论

过去的研究主要关注单核苷酸多态性在肿瘤发生中的机制，然而在人类肿瘤中，有25%的肿瘤患者存在染色体的大片段缺失[8]，在18.3%的慢性淋巴细胞白血病患者中存在染色体17p13.1缺失，这部分患者的2年总体生存率、无进展生存率较低（53.8%对89.7%，23.1%对82.8%）[9]；存在染色体17p缺失的多发性骨髓瘤患者的中位无进展生存时间为1.3年，中位总生存期为2.7年，这些患者预后明显变差[10]，这表明染色体的缺失与血液系统肿瘤的发生、发展及预后间有密切联系。如果能对正常细胞或者肿瘤细胞进行基因编辑实现染色体大片段缺失，建立血液系统肿瘤模型，可以使我们更好地理解染色体大片段缺失与血液系统肿瘤发生发展间的关系。

目前，Cre/loxP重组酶系统、锌指核酸酶技术（ZFN）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）等技术均被用于基因编辑，然而Cre/loxP主要用于对胚胎干细胞进行基因编辑且花费巨大[11]。ZFN和TALEN基因编辑效率低、设计合成DNA结合结构域较麻烦且成本高而使其应用受限[12]–[13]。与这些技术相比，CRISPR-Cas9的设计简单、成本低廉（仅需设计合成20 bp的sgRNA）、操作灵活、基因编辑效率高、脱靶效率低，且能同时编辑多个基因、实现染色体大片段的缺失，为研究染色体缺失在血液系统肿瘤发生发展中的作用提供了新的技术选择[14]–[15]。

我们的研究证实了CRISPR-Cas9基因编辑技术能有效的实现小鼠11B3染色体上Aloxe3-Alox12b-Alox8基因簇的大片段缺失。虽然ZFN和TALEN基因编辑技术也能实现染色体的大片段缺失，但在基因断裂连接点处常发生小的插入突变[16]，而我们的研究发现CRISPR-Cas9基因编辑技术在切割靶位点后，断裂的染色体片段发生了准确的重组，并且未发生任何碱基的插入突变，这表明CRISPR-Cas9基因编辑技术可使染色体大片段的缺失更加准确。因此CRISPR-Cas9基因编辑技术可用于实现染色体大片段缺失，为我们提供了从分子水平研究血液系统疾病发生、发展机制的方法。