Early Changes in Circulating Interleukins and Residual Inflammatory Risk After Acute Myocardial Infarction.

BACKGROUND: Patients with acute myocardial infarction may have a large infarcted area and ventricular dysfunction despite early thrombolysis and revascularization.
OBJECTIVE: To investigate the behavior of circulating cytokines in patients with ST-segment elevation myocardial infarction (STEMI) and their relationship with ventricular function.
METHODS: In the BATTLE-AMI (B and T Types of Lymphocytes Evaluation in Acute Myocardial Infarction) trial, patients with STEMI were treated with a pharmacoinvasive strategy. The plasma levels of cytokines (IL-1 β , IL-4, IL-6, IL-10, and IL-18) were tested using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) at baseline and after 30 days. Infarcted mass and left ventricular ejection fraction (LVEF) were examined by 3-T cardiac magnetic resonance imaging. All p-values < 0.05 were considered statistically significant.
RESULTS: Compared to baseline, lower levels were detected for IL-1 β (p = 0.028) and IL-18 (p < 0.0001) 30 days after STEMI, whereas higher levels were observed for IL-4 (p = 0.001) and IL-10 (p < 0.0001) at that time point. Conversely, no changes were detected for IL-6 levels (p = 0.63). The levels of high-sensitivity C-reactive protein and IL-6 correlated at baseline (rho = 0.45, p < 0.0001) and 30 days after STEMI (rho = 0.29, p = 0.009). At baseline, correlation between IL-6 levels and LVEF was also observed (rho = -0.50, p = 0.004).
CONCLUSIONS: During the first month post-MI, we observed a marked improvement in the balance of pro- and anti-inflammatory cytokines, except for IL-6. These findings suggest residual inflammatory risk. (Arq Bras Cardiol. 2020; [online].ahead print, PP.0-0).

Introdução

Após o infarto agudo do miocárdio (IAM), os pacientes apresentam maiores taxas de hospitalização e morte devido a insuficiência cardíaca associada a maiores níveis de proteína C-reativa de alta sensibilidade (PCRas), mas esses eventos cardiovasculares podem ser reduzidos pela terapia anti-inflamatória.[1] Foi descrito que a interleucina-6 (IL-6) tem um papel relevante na remodelação ventricular em modelos de sobrecarga de pressão[2] e na coordenação da resposta imune após o IAM.[3]

Além da IL-6, outras interleucinas como a IL-18[4] e a IL-1β[5 , 6] parecem contribuir para a remodelação ventricular adversa após o IAM. Curiosamente, a IL-4 parece contribuir para fibrose e disfunção ventricular na hipertensão arterial quando induzidas pela administração de angiotensina II.[7] Em contrapartida, a IL-10 atenuou acentuadamente o microambiente inflamatório após o IAM, melhorando, assim, a função ventricular.[8]

Dado o interesse crescente no papel da inflamação na remodelação ventricular pós-IAM, examinamos a resposta inflamatória mediada por citocinas durante a fase precoce do IAM e a sua relação com a remodelação ventricular através de ressonância magnética cardíaca (RMC).

Materiais e Métodos

População do estudo

Este relato faz parte do estudo BATTLE-AMI (Avaliação dos Linfócitos Tipos B e T no Infarto Agudo do Miocárdio, ClinicalTrials.gov, NCT02428374). O BATTLE-AMI é um ensaio clínico randomizado no qual são comparados os efeitos da combinação de estatina e terapias antiplaquetárias na massa infartada e na fração de ejeção ventricular (FEVE) em pacientes com infarto agudo do miocárdio com supradesnivelamento do segmento ST (IAMCSST) tratados com uma estratégia farmacoinvasiva.[9] Este estudo está em andamento e inclui pacientes com a primeira ocorrência de IAMCSST que foram submetidos a trombólise com tenecteplase nas primeiras 6 horas após o início dos sintomas e que foram transferidos para um hospital terciário (Hospital São Paulo) nas primeiras 24 horas para angiografia coronariana e procedimentos invasivos. Pacientes que tiveram eventos coronários prévios, revascularização da artéria coronária, contraindicações para RMC ou instabilidade hemodinâmica foram excluídos do estudo.

Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética local (Universidade Federal de São Paulo, Hospital São Paulo, IRB:0297/2014, CAAE: 38692514.1.1001.5505), e todos os pacientes forneceram consentimento por escrito antes da inclusão.

Exames laboratoriais

Amostras de sangue foram coletadas na manhã do primeiro dia e entre 27-33 dias após o IAMCSST. Todas as amostras foram testadas no Laboratório de Lípides, Aterosclerose e Biologia Vascular (Universidade Federal de São Paulo). Os níveis plasmáticos de citocinas foram testados através do ensaio imunoadsorção enzimática (ELISA). IL-4, IL-6 e IL-10 foram testadas com os kits da BD Pharmingen (BD Biosciences, San Diego, Califórnia, EUA), e IL-1β e IL-18 foram testadas com os kits da R&D (Minneapolis, Minnesota, EUA). Os resultados foram expressos em relação à absorbância usando o EnSpire Multimode Plate Reader (PerkinElmer) e/ou o iMark Microplate Absorbance Reader (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Califórnia, EUA), de acordo com as instruções dos fabricantes. A proteína C-reativa de alta sensibilidade (PCRas) foi medida através de imunonefelometria.

Ressonância Magnética Cardíaca

Todas as imagens de RMC foram realizadas no Hospital São Paulo ou no Instituto Dante Pazzanese de Cardiologia. A primeira avaliação foi feita nos primeiros 10 dias (início do estudo), normalmente após a alta hospitalar. A segunda avaliação foi realizada de 27 a 33 dias após o IAM.

A quantidade de massa infartada, FEVE e microcirculação foram determinadas pela RMC 3-T. Para a função ventricular esquerda, as imagens de RMC foram adquiridas através de um scanner 3-T, como descrito anteriormente.[9] Em resumo, a avaliação quantitativa foi realizada em uma estação de trabalho off-line , com o software Argus LV function (Siemens Healthineers). Para a quantificação da necrose miocárdica, a planimetria foi realizada com contorno manual das áreas com realce tardio de gadolínio, e o volume do tecido infartado foi calculado como a soma dessas áreas multiplicada pela espessura de cada corte.

A cine-RMC foi realizada com uma técnica de precessão livre no estado estacionário (imagens rápidas com uso de aquisição no estado estacionário). A isquemia foi detectada através de imagens de perfusão na primeira passagem apenas na orientação do eixo curto, com pelo menos três cortes (o número máximo de cortes é limitado pela frequência cardíaca). A detecção de infarto e a quantificação das imagens foram adquiridas através da técnica de realce tardio do miocárdio após a injeção de um agente de contraste à base de gadolínio (disponível comercialmente). As imagens com meio de contraste foram adquiridas nos mesmos planos que os usados para a cine-RMC, através de uma sequência segmentada com inversão da recuperação. Cada imagem de RMC foi revisada por dois especialistas cegados e independentes usando um software apropriado. A função do ventrículo esquerdo foi estimada com o uso de imagens de cine-RMC para medir os volumes de FEVE e de massa de acordo com métodos padrão. As imagens com realce tardio foram utilizadas para a caracterização do infarto. Em cada paciente, após o observador ter manualmente definido a região de interesse (RDI) em um território remoto e não infartado, o tecido miocárdico foi classificado como hiper-realçado (tecido fibroso) ou miocárdio realçado normalmente.

Análise estatística

Os dados são apresentados como média ± desvio padrão ou mediana e interquartis (IQ), de acordo com a normalidade dos dados. Variáveis contínuas foram analisadas sob o aspecto da normalidade através do teste de Kolmogorov-Smirnov. As amostras basais e de 30 dias foram comparados com o teste não paramétrico de postos de Wilcoxon. As comparações entre os grupos foram feitas através do teste de Kruskal-Wallis. Os títulos de interleucinas e os parâmetros de RMC foram correlacionados através da análise de correlação de Spearman. O tamanho amostral foi estimado com base em estudos anteriores envolvendo alterações precoces nos títulos de interleucinas.[10 , 11] O software SPSS, versão 18.0 (IBM, Armonk, Nova Iorque, EUA), foi utilizado para a análise estatística. Valores de p < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Resultados

Um total de 139 indivíduos consecutivos com IAMCSST foram incluídos no estudo. As principais características basais da população do estudo estão descritas na Tabela 1 .

Tabela 1

– Características basais da população do estudo

Parâmetros	N = 139
Idade, anos*	56 (50-63)
Gênero masculino, n (%)	92 (66)
Tabagismo, n (%)	28 (20)
Diabetes, n (%)	32 (24)
HbA1c, %**	6,4 ± 1,4
Hipertensão, n (%)	82 (60)
PAS (mmHg)**	128 ± 21
PAD (mmHg)**	80 ± 14
Peso, kg**	75 ± 13
IMC, km/m2**	27,2 ± 4,78
Colesterol, mg/dL**	208 ± 45
Colesterol LDL, mg/dL**	138 ± 41
Colesterol HDL, mg/dL**	41 ± 12
Triglicerídios, mg/dL*	124 (86-213)
PCRas, mg/L*	15 (7-63)
Localização do infarto
Anterior, n (%)	60 (43)
Inferior, n (%)	73 (53)
Lateral, n (%)	6 (4)

*mediana (intervalo interquartil); **média ± desvio padrão; HbA1c: hemoglobina glicada; HDL: lipoproteína de alta densidade; IMC: índice de massa corporal; LDL: lipoproteína de baixa densidade; PAD: pressão arterial diastólica; PAS: pressão arterial sistólica; PCRas: proteína C-reativa de alta sensibilidade.

Medição das citocinas circulantes

A Figura 1 mostra que, em comparação com o início do estudo, os níveis de IL-1β e IL-18 diminuíram 30 dias após o IAMCSST. Em contrapartida, foram observados aumentos nos níveis de IL-4 e IL-10 em 30 dias após o IAMCSST. Não foram observadas mudanças significativas nos níveis de IL-6 nesse período.

Figura 1

– Gráficos em caixa das concentrações de interleucina (IL) no basal e 30 dias após o IAMCSST. (A) IL-1β; (B) IL- 4; (C) IL-6; (D) IL-10; (E) IL-18. Alterações significativas foram observadas em todas as citocinas, exceto na IL-6. Títulos foram comparados pelo teste de Wilcoxon.

Relação entre citocinas e ressonância magnética cardíaca

No início do estudo, não foram observadas correlações significativas entre os níveis de IL-1β, IL-4, IL-10 e IL-18 e os parâmetros de RMC, como a quantidade de massa infartada ou a FEVE; no entanto, houve uma correlação negativa entre os níveis de IL-6 e a FEVE (rho de Spearman = -0,50, p = 0,004). Uma tendência de correlação entre os níveis de IL-6 e a porcentagem de massa infartada do ventrículo esquerdo também foi observada (rho = 0,41, p = 0,05) ( Tabela 2 ).

Tabela 2

– Correlações entre interleucinas basais (pg/mL) e parâmetros de ressonância magnética cardíaca na fase aguda do infarto do miocárdio

Variáveis	rho de Spearman	Valor de p
IL-1β e massa infartada*	0,16	0,43
IL-1β e massa infartada**	-0,05	0,84
IL-1β e FEVE	0,12	0,55
IL-4 e massa infartada*	-0,26	0,19
IL-4 e massa infartada**	-0,2	0,37
IL-4 e FEVE	0,15	0,44
IL-6 e massa infartada*	0,16	0,39
IL-6 e massa infartada**	0,41	0,05
IL-6 e FEVE	-0,5	0,004
IL-10 e massa infartada*	0,3	0,1
IL-10 e massa infartada**	0,24	0,28
IL-10 e FEVE	-0,31	0,09
IL-18 e massa infartada*	-0,11	0,57
IL-18 e massa infartada**	-0,24	0,28
IL-18 e FEVE	0,01	0,96

*gramas; **porcentagem de massa ventricular esquerda; FEVE: fração de ejeção ventricular esquerda; IL: interleucina.

Houve uma correlação positiva entre os níveis basais de IL-4 e a quantidade de massa infartada medida pela RMC (rho = 0,24; p = 0,03) em 30 dias ( Tabela 3 ). Nenhuma outra correlação entre os níveis de citocinas e os parâmetros de RMC foi encontrada na avaliação de 30 dias após o IAMCSST.

Tabela 3

– Correlações entre concentrações basais de interleucina (pg/mL) e parâmetros de ressonância magnética cardíaca 30 dias após o infarto do miocárdio

Variáveis	rho de Spearman	Valor de p
IL-1β e massa infartada*	-0,02	0,85
IL-1β e massa infartada**	-0,07	0,59
IL-1β e FEVE	0,19	0,1
IL-4 e massa infartada*	0,24	0,03
IL-4 e massa infartada**	0,14	0,2
IL-4 e FEVE	-0,14	0,19
IL-6 e massa infartada*	0,13	0,23
IL-6 e massa infartada**	0,13	0,22
IL-6 e FEVE	-0,17	0,1
IL-10 e massa infartada*	0,13	0,23
IL-10 e massa infartada**	0,07	0,55
IL-10 e FEVE	0,09	0,4
IL-18 e massa infartada*	0,14	0,31
IL-18 e massa infartada**	-0,12	0,38
IL-18 e FEVE	0,07	0,52

*gramas; **porcentagem de massa ventricular esquerda; FEVE: fração de ejeção ventricular esquerda; IL: interleucina.

Relação entre citocinas e proteína C-reativa de alta sensibilidade

Os níveis de PCRas se correlacionaram com os de IL-6 no início do estudo (rho = 0,45, p < 0,0001) e 30 dias após o IAMCSST (rho = 0,29, p = 0,009). Nenhuma outra citocina mostrou correlação com os níveis de PCRas tanto no início do estudo quanto 30 dias após o IAMCSST (dados não apresentados).

Relação entre IL-6 e artéria coronária culpada

A artéria coronária direita foi a artéria coronária mais comumente culpada pelo IAMCSST (46%), seguida pela artéria descendente anterior esquerda (42%) e pela artéria circunflexa esquerda (12%). Os níveis de IL-6 constatados no primeiro dia após o IAMCSST não foram diferentes entre as artérias culpadas (p = 0,063 no teste de Kruskal-Wallis), assim como 30 dias após o IAMCSST (p = 0,131 no teste de Kruskal-Wallis).

Ressonância magnética cardíaca

A Tabela 4 mostra os resultados da RMC de acordo com a artéria coronária culpada. Não foram observadas diferenças significativas para massa infartada (%), massa ventricular esquerda ou FEVE no início do estudo ou 30 dias após o IAMCSST.

Tabela 4

– Resultados da ressonância magnética cardíaca por artéria coronária culpada no início do estudo e 30 dias após infarto agudo do miocárdio

Artéria coronária culpada	Início	30 dias
Artéria descendente anterior esquerda
Tamanho do infarto, % VE	10,0 (5,5-19,0)	12,7 (8,0-21,0)
Massa do VE, gramas	117,3 (101,0-171,8)	90,5 (69,0-127,9)
FEVE, %	46,0 (43,3-59,0)	51,6 (40,5-59,3)
Artéria coronária direita
Tamanho do infarto, % VE	12,0 (10,0-18,5)	10,0 (6,0-17,9)
Massa do VE, gramas	96,0 (86,5-123,0)	99,0 (80,0-113,0)
FEVE, %	48,0 (42,0-50,5)	55,5 (50,0-60,0)
Artéria circunflexa esquerda
Tamanho do infarto, % VE	11,5 (5,0-18,0)	7,0 (4,0-8,7)
Massa do VE, gramas	103,0 (76,0-130,0)	103,0 (75,0-106)
FEVE, %	51,0 (50,0-52,0)	54,0 (51,0-58,0)

Dados apresentados como mediana (intervalo interquartil). FEVE: fração de ejeção ventricular esquerda; VE: ventrículo esquerdo. As imagens basais de ressonância magnética cardíaca foram obtidas em até 10 dias após o infarto do miocárdio. No início do estudo, nenhuma diferença foi observada no tamanho do infarto entre as artérias coronárias culpadas (p = 0,59), assim como na massa do VE (p = 0,08) ou na FEVE (p = 0,62) (teste de Kruskal-Wallis para todas as análises). Também não foram observadas diferenças entre as artérias coronárias culpadas depois de 30 dias no tamanho do infarto (p = 0,13), na massa do VE (p = 0,86) ou na FEVE (p = 0,10) (o teste de Kruskal-Wallis foi usado nessas comparações).

Discussão

Nosso estudo mostra o comportamento das concentrações de citocinas na fase precoce do IAMCSST em pacientes que foram tratados com uma estratégia farmacoinvasiva e receberam cuidado médico padrão. Nossos principais achados foram uma diminuição significativa nos títulos de citocinas pró-inflamatórias (IL-1β e IL-18), mas não nos de IL-6, e um aumento nos títulos de citocinas protetoras (IL-10 e IL-4). Curiosamente, a FEVE obtida pela RMC mostrou correlação com as concentrações basais de IL-6, mas não 30 dias após o IAMCSST. Além disso, a massa infartada quantificada pela RMC no período de 30 dias mostrou correlação com os níveis basais de IL-4. Em conjunto, esses dados apontam para um papel importante do perfil das interleucinas no primeiro dia após o IAM, que parece apresentar relação com a massa infartada e a remodelação ventricular. Além disso, a diminuição substancial de algumas citocinas inflamatórias juntamente com o aumento significativo da IL-10 parece atenuar, ao menos em parte, os efeitos prejudiciais da IL-6 na remodelação ventricular.[12]

A recanalização coronária precoce e o uso tanto de fármacos antitrombóticos quanto de hipolipemiantes altamente efetivos são estratégias bem estabelecidas no tratamento de pacientes com IAM. No entanto, um melhor conhecimento do risco inflamatório residual durante o acompanhamento inicial de IAM pode contribuir para novas oportunidades terapêuticas.[13]

No nosso estudo, as concentrações de IL-6 foram inversamente associadas à função ventricular esquerda. Estudos de randomização mendeliana sugeriram um papel causal da IL-6 na coronariopatia[14 , 15] e no desenvolvimento de aneurisma de aorta abdominal.[16] Dois grandes estudos prospectivos recentes envolvendo indivíduos após eventos coronários agudos mostraram uma associação independente entre maiores concentrações de IL-6 e desfechos cardiovasculares principais, incluindo morte cardiovascular, mesmo após múltiplos ajustes para os biomarcadores clássicos de doença cardiovascular.[17 , 18] A interação da IL-6 com seu receptor parece modular o microambiente inflamatório em doenças cardiovasculares tanto em relação à desestabilização da placa quanto ao prognóstico de longo prazo.

Esse microambiente inflamatório, que envolve os biomarcadores endoteliais e inflamatórios, pode ser modulado pela terapia antiplaquetária escolhida.[19 , 20] No entanto, no estudo DISPERSE-2 (Estudo de Confirmação de dose para Avaliação dos Efeitos Antiplaquetários de AZD6140 vs. Clopidogrel no IAMSSST 2),[21] ao comparar o uso de ticagrelor com clopidogrel após síndrome coronariana aguda recente, não foram encontradas diferenças nos biomarcadores inflamatórios no início do estudo, na alta hospitalar e após 4 semanas. É possível que a diminuição acentuada nos níveis de outros marcadores inflamatórios, como IL-1β e IL-18, e o aumento nos níveis de IL-10 protetora tenham contribuído para uma resposta inflamatória mais favorável, apesar dos níveis persistentemente elevados de IL-6. Além disso, esses pacientes receberam tratamento hipolipemiante efetivo de ação anti-inflamatória comprovada, com rosuvastatina[22] ou com uma combinação de sinvastatina e ezetimiba.[23] Curiosamente, apenas o nível de IL-6 não se alterou após o tratamento médico, o que sugere que o controle dessa citocina requer terapia adicional, como o uso de anticorpo monoclonal ou de um fármaco que reduza a atividade inflamatória desencadeada pela IL-6.[24 , 25]

A IL-4 tem diversas propriedades biológicas, incluindo a diferenciação dos linfócitos Th1 em células com atividade inflamatória menor (Th2).[25] Além disso, foi relatado que a IL-4 cronicamente elevada tem uma relação causal com a fibrose cardíaca e a remodelação cardíaca adversa.[26] Além disso, a cardiomiopatia dilatada induzida pela angiotensina II é modulada pelos níveis de IL-4.[27] Neste estudo, observamos uma associação entre os níveis basais de IL-4 e a quantidade de massa infartada depois de 30 dias do IAM. Esses achados sugerem um papel importante dessa citocina, que possivelmente atenua o processo inflamatório miocárdico através de maior diferenciação celular em fenótipos menos inflamatórios (macrófagos M2 e linfócitos Th2). Nesse cenário, a IL-4 pode influenciar todo o processo de remodelação ventricular. Este pode levar diversas semanas para ocorrer e parece depender da relação entre células inflamatórias e cardiomiócitos, determinando, assim, a eliminação de células necróticas e promovendo reposição celular e formação de tecido fibroso.[28]

Os inflamassomas são uma família do sistema imune inato que inclui o NLRP3, que foi reconhecido como um gatilho relevante para o efeito inflamatório em cascata relacionado à doença cardiovascular.[29] Essa plataforma pode ser ativada por diversos estímulos, incluindo a hipóxia, promovendo a liberação das citocinas altamente inflamatórias IL-1β e IL-18.[30] Além disso, a síndrome metabólica e o diabetes estão relacionados às concentrações de IL-18. Enquanto a IL-1β está relacionada ao efeito inflamatório em cascata da doença cardiovascular, a IL-18 parece estar associada a mecanismos inflamatórios, favorecendo o desenvolvimento de câncer e apresentando maiores concentrações em pacientes com diabetes e resistência à insulina.[31 , 32] Nosso estudo mostrou uma diminuição nas duas citocinas (IL-1β e IL-18), o que sugere uma diminuição nos estímulos para ativação do NLRP3 após 30 dias do IAMCSST.

Este estudo também reforça a importância do papel da IL-6, a única citocina não modificada após 30 dias do IAM, que apresentou uma correlação significativa com a PCRas basal e 30 dias após o IAMCSST, uma associação previamente relatada.[33] No nosso estudo, apenas pacientes com IAMCSST submetidos a trombólise nas primeiras 6 horas e encaminhados para angiografia coronariana nas primeiras 24 horas foram incluídos. Assim, esta é uma população altamente homogênea que recebeu cuidado médico padrão. Levando em consideração a associação de níveis cronicamente elevados de IL-6 e a recorrência de eventos coronários, insuficiência cardíaca, mortalidade cardiovascular e mortalidade por todas as causas, uma diminuição adicional no risco inflamatório residual parece ser um alvo promissor para a intervenção.[34 , 35]

Limitações do estudo

A população estudada recebeu terapia hipolipemiante e antiplaquetária, cujos efeitos anti-inflamatórios podem ter contribuído para os resultados do estudo. No entanto, esses tratamentos são parte do cuidado padrão desses pacientes. Algumas citocinas inflamatórias capazes de ativar a via inflamatória mediada pela IL-6, como o fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α) ou o IL-1R, não foram medidas e podem ter relevância nas respostas teciduais e na remodelação ventricular do paciente.[36 , 37] Na verdade, o IAM per se pode estar relacionado a um aumento na IL-6 como resposta a uma lesão. No entanto, os títulos de IL-6 permaneceram elevados enquanto outras citocinas alteraram seus níveis séricos após 30 dias do IAMCSST. Outro biomarcador inflamatório importante que não foi avaliado neste estudo é a IL-1α, que é liberada pelos cardiomiócitos necróticos e ativa as respostas imunes dos fibroblastos.[38] O bloqueio da IL-1α diminui a atividade quimiotática para diversas células mediadas por CCL2/ MCP-1 e IL-6.[38] Além disso, o recrutamento de monócitos e linfócitos na isquemia cardíaca pode ser estimulado por diversos quimiotáticos, como CCL2 e CCL5, influenciando, assim, a cura tecidual.[39] Por fim, o fator de transformação do crescimento beta (TGF-β), que é altamente expressado após o IAM, também não foi avaliado pelo nosso estudo, mas foi implicado na sobrevida de cardiomiócitos e na remodelação ventricular.[40] Os resultados apresentados aqui referem-se a um período relativamente precoce após o IAM, mas é quando os infiltrados inflamatórios parecem mais relevantes para a recuperação celular ou lesão de reperfusão.

Conclusões

Durante o primeiro mês pós-IAM, observamos uma melhora significativa no balanço das citocinas pró e anti-inflamatórias, exceto da IL-6. Esses achados sugerem risco inflamatório residual.

Destaques

Introduction

Following acute myocardial infarction (MI), patients are at risk of higher rates of hospitalization and death due to heart failure associated with higher levels of high-sensitivity C-reactive protein (hsCRP), but these cardiovascular events can be decreased by anti-inflammatory therapy.[1] Interleukin-6 (IL-6) has been described as having a relevant role in ventricular remodeling in pressure overload models[2] and orchestrating the immune response after acute MI.[3]

In addition to IL-6, other interleukins such as IL-18[4] and IL-1β[5 , 6] seem to contribute to adverse ventricular remodeling after MI. Interestingly, IL-4 appears to contribute to fibrosis and ventricular dysfunction in arterial hypertension when induced by angiotensin II administration.[7] Conversely, IL-10 markedly attenuates the inflammatory microenvironment after MI, thus improving ventricular function.[8]

Given the growing interest in the role of inflammation in ventricular remodeling after acute MI, we examined cytokine-mediated inflammatory response during the early phase of acute MI and its relationship with ventricular remodeling using cardiac magnetic resonance imaging (cMRI).

Materials and Methods

Study population

This report is part of the BATTLE-AMI (B And T Types of Lymphocytes Evaluation in Acute Myocardial Infarction) trial (ClinicalTrials.gov, NCT02428374). BATTLE-AMI is a randomized trial in which the effects of combined statin and antiplatelet therapies on infarcted mass and left ventricular ejection fraction (LVEF) in patients with ST-segment elevation myocardial infarction (STEMI) treated with a pharmacoinvasive strategy are compared.[9] The ongoing study includes patients with first STEMI who underwent thrombolysis with tenecteplase in the first 6 hours of onset of symptoms and were transferred to a tertiary care hospital in southeastern Brazil (Hospital São Paulo) in the first 24 hours for coronary angiography and invasive procedures. Patients with previous history of coronary events, coronary revascularization, contraindication to cMRI, or showing hemodynamic instability were excluded from the study.

The project was approved by the local Ethics Committee (Universidade Federal de São Paulo, Hospital São Paulo, IRB:0297/2014, CAAE: 38692514.1.1001.5505), and all patients provided written informed consent before inclusion.

Laboratory measurements

Blood samples were collected in the morning of the first day and between 27-33 days after STEMI. All samples were assayed in the Laboratory of Lipids, Atherosclerosis, and Vascular Biology (Universidade Federal de São Paulo). Cytokine levels in plasma were tested using the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). IL-4, IL-6, and IL-10 were assayed using the BD Pharmingen kits (BD Biosciences, San Diego, California, USA), and IL-1β and IL-18 were assayed using the R&D Systems kits (Minneapolis, Minnesota, USA). The results were expressed in terms of absorbance using the EnSpire Multimode Plate Reader (PerkinElmer) and/or the iMark Microplate Absorbance Reader (Bio-Rad Laboratories, Hercules, California, USA), according to the manufacturers’ instructions. HsCRP was measured by immunonephelometry.

Cardiac magnetic resonance imaging

All cMRI examinations were performed at Hospital São Paulo or Instituto Dante Pazzanese de Cardiologia. The first examination was done within the first 10 days (baseline), usually after hospital discharge. The second examination was performed after 27-33 days of acute MI.

The amount of infarcted mass, LVEF, and microcirculation were determined by 3-T cMRI. For left ventricular function, cMRI images were acquired using a 3-T scanner, as previously reported.[9] Briefly, quantitative assessment was performed in an offline workstation with the software Argus LV function (Siemens Healthineers). For quantification of myocardial necrosis, planimetry was performed manually by contouring late gadolinium enhancement areas, and infarcted tissue volume was calculated as the sum of those areas multiplied by the thickness of each slice.

Cine cMRI was performed using a steady-state free-precession technique (fast imaging employing steady-state acquisition). Ischemia was detected using first-pass perfusion imaging only in the short-axis orientation, with at least three slices (the maximum number of slices are limited by heart rate). Infarct detection and quantification images were acquired using the myocardial delayed enhancement technique after injection of a commercially available gadolinium-based contrast agent. Contrast-enhanced images were acquired in the same views as those used for cine cMRI, using a segmented inversion-recovery sequence. Each cMRI image was reviewed by two independent blinded readers using a dedicated software. Left ventricular function was estimated using cine cMRI images to measure LVEF volumes and mass according to standard methods. Delayed enhancement images were used for infarct characterization. In each patient, myocardial tissue was classified as hyperenhanced (scar tissue) or normally enhanced myocardium after the observer, who used manual interaction, defined a region of interest (ROI) within a remote non-infarcted territory.

Statistical analysis

Data are presented as mean ± standard deviation or median (interquartile range, IQR) according to data normality. Continuous variables were analyzed for normality using the Kolmogorov-Smirnov test. Baseline and 30-day samples were compared using the nonparametric Wilcoxon signed-rank test. Comparisons between groups were made using the Kruskal-Wallis test. Interleukin titers and cMRI parameters were correlated using the Spearman’s rank correlation analysis calculator. Sample size was estimated based on previous studies involving early changes in cytokine titers.[10 , 11] The software SPSS, version 18.0 (IBM, Armonk, New York, USA), was used for statistical analysis. All p-values < 0.05 were considered statistically significant.

Results

In total, 139 consecutive individuals with STEMI were included in the study. The main characteristics of the study population at baseline are described in Table 1 .

Table 1

– Baseline characteristics of the study population

Parameters	N = 139
Age, years*	56 (50-63)
Male gender, n (%)	92 (66)
Smoking, n (%)	28 (20)
Diabetes, n (%)	32 (24)
HbA1c, %**	6.4 ± 1.4
Hypertension, n (%)	82 (60)
SBP, mm Hg**	128 ± 21
DBP, mm Hg**	80 ± 14
Weight, kg**	75 ± 13
BMI, kg/m2**	27.2 ± 4.78
Cholesterol, mg/dL**	208 ± 45
LDL-C, mg/dL**	138 ± 41
HDL-C, mg/dL**	41 ± 12
Triglycerides, mg/dL*	124 (86-213)
hsCRP, mg/L*	15 (7-63)
Myocardial infarction location
Anterior, n (%)	60 (43)
Inferior, n (%)	73 (53)
Lateral, n (%)	6 (4)

*median (interquartile range); **mean ± standard deviation; BMI: body mass index; DBP: diastolic blood pressure; HbA1c: glycated hemoglobin; HDL-C: high-density lipoprotein cholesterol; hsCRP: high-sensitivity C-reactive protein; LDL-C: low-density lipoprotein cholesterol; SBP: systolic blood pressure.

Measurement of circulating cytokines

Figure 1 shows that, compared to baseline, levels of IL-1β and IL-18 decreased 30 days after STEMI. Conversely, increased levels of IL-4 and IL-10 were observed 30 days after STEMI. No significant changes were observed for IL-6 levels over time.

Figure 1

– Box-plots of interleukin (IL) concentrations at baseline and 30 days after STEMI. (A) IL-1ß; (B) IL-4; (C) IL-6; (D) IL-10; (E) IL-18. Significant changes were observed in all cytokines, except for IL-6. Titers were compared using the Wilcoxon test.

Relationship between cytokines and cardiac magnetic resonance imaging

At baseline, no significant correlations were observed between IL-1β, IL-4, IL-10, and IL-18 levels and cMRI parameters, such as the amount of infarcted mass or LVEF; however, there was a negative correlation between IL-6 levels and LVEF (Spearman’s rho = -0.50, p = 0.004). A trend for correlation between IL-6 levels and the percentage of infarcted left ventricular mass was also noted (rho = 0.41, p = 0.05) ( Table 2 ).

Table 2

– Correlations between baseline interleukin concentrations (pg/mL) and cardiac magnetic resonance imaging parameters in the acute phase of myocardial infarction

Variables	Spearman’s rho	P-value
IL-1β and infarcted mass*	0.16	0.43
IL-1β and infarcted mass**	-0.05	0.84
IL-1β and LVEF	0.12	0.55
IL-4 and infarcted mass*	-0.26	0.19
IL-4 and infarcted mass**	-0.20	0.37
IL-4 and LVEF	0.15	0.44
IL-6 and infarcted mass*	0.16	0.39
IL-6 and infarcted mass**	0.41	0.05
IL-6 and LVEF	-0.50	0.004
IL-10 and infarcted mass*	0.30	0.10
IL-10 and infarcted mass**	0.24	0.28
IL-10 and LVEF	-0.31	0.09
IL-18 and infarcted mass*	-0.11	0.57
IL-18 and infarcted mass**	-0.24	0.28
IL-18 and LVEF	0.01	0.96

*grams; **percentage of left ventricular mass; IL: interleukin; LVEF: left ventricular ejection fraction.

There was a positive correlation between baseline levels of IL-4 and the amount of infarcted mass as measured by cMRI (rho = 0.24; p = 0.03) at 30 days ( Table 3 ). No other correlations between cytokine levels and cMRI parameters were found when they were assessed 30 days after STEMI.

Table 3

– Correlations between baseline interleukin concentrations (pg/mL) and cardiac magnetic resonance imaging parameters after 30 days of myocardial infarction

Variables	Spearman’s rho	P-value
IL-1β and infarcted mass*	-0.02	0.85
IL-1β and infarcted mass**	-0.07	0.59
IL-1β and LVEF	0.19	0.10
IL-4 and infarcted mass*	0.24	0.03
IL-4 and infarcted mass**	0.14	0.20
IL-4 and LVEF	-0.14	0.19
IL-6 and infarcted mass*	0.13	0.23
IL-6 and infarcted mass**	0.13	0.22
IL-6 and LVEF	-0.17	0.10
IL-10 and infarcted mass*	0.13	0.23
IL-10 and infarcted mass**	0.07	0.55
IL-10 and LVEF	0.09	0.40
IL-18 and infarcted mass*	0.14	0.31
IL-18 and infarcted mass**	-0.12	0.38
IL-18 and LVEF	0.07	0.52

*grams; **percentage of left ventricular mass; IL: interleukin; LVEF: left ventricular ejection fraction.

Relationship between cytokines and high-sensitivity C-reactive protein

The levels of hsCRP correlated with those of IL-6 at baseline (rho = 0.45; p < 0.0001) and 30 days after STEMI (rho = 0.29, p = 0.009). No other cytokine showed correlation with hsCRP levels either at baseline or after 30 days of STEMI (data not shown).

Relationship between IL-6 and culprit coronary artery

Right coronary artery was the most common culprit coronary artery related to STEMI (46%), followed by left anterior descending artery (42%) and left circumflex artery (12%). IL-6 levels examined in the first day after STEMI did not differ between the culprit arteries (p = 0.063, Kruskal-Wallis test), as well as after 30 days of STEMI (p = 0.131, Kruskal-Wallis test).

Table 4 shows the results of cMRI according to the culprit coronary artery. No significant differences were seen for infarcted mass (%), left ventricular mass, or LVEF at baseline or 30 days after STEMI.

Table 4

– Cardiac magnetic resonance imaging results by culprit coronary artery at baseline and 30 days after acute myocardial infarction

Culprit coronary artery	Baseline	30 days
Left anterior descending artery
Infarct size, % LV	10.0 (5.5-19.0)	12.7 (8.0-21.0)
LV mass, grams	117.3 (101.0-171.8)	90.5 (69.0-127.9)
LVEF, %	46.0 (43.3-59.0)	51.6 (40.5-59.3)
Right coronary artery
Infarct size, % LV	12.0 (10.0-18.5)	10.0 (6.0-17.9)
LV mass, grams	96.0 (86.5-123.0)	99.0 (80.0-113.0)
LVEF, %	48.0 (42.0-50.5)	55.5 (50.0-60.0)
Left circumflex artery
Infarct size, % LV	11.5 (5.0-18.0)	7.0 (4.0-8.7)
LV mass, grams	103.0 (76.0-130.0)	103.0 (75.0-106)
LVEF, %	51.0 (50.0-52.0)	54.0 (51.0-58.0)

Data presented as median (interquartile range). LV: left ventricular; LVEF: left ventricular ejection fraction. Baseline cardiac magnetic resonance imaging was obtained within 10 days of myocardial infarction. At baseline, no differences were observed for infarct size between culprit coronary arteries (p = 0.59) as well as for LV mass (p = 0.08) or LVEF (p = 0.62) (Kruskal-Wallis test for all analyses). No differences were observed between culprit coronary arteries at 30-days for infarct size (p = 0.13), LV mass (p = 0.86), or LVEF (p = 0.10) (Kruskal-Wallis test was used for comparisons).

Discussion

Our study shows the behavior of cytokine concentrations in the early phase of STEMI in patients who were treated with a pharmacoinvasive strategy and received standard medical care. Our main findings were a marked decrease in the titers of proinflammatory cytokines (IL-1β and IL-18), but not IL-6, and an increase in the titers of protective cytokines (IL-10 and IL-4). Interestingly, LVEF obtained by cMRI showed a correlation with IL-6 concentrations at baseline, but not 30 days post-STEMI. In addition, the infarcted mass quantified by cMRI at 30 days showed a correlation with IL-4 levels at baseline. Together, these data suggest an important role of the interleukin profile on the first day after acute MI, which seems to have some relationship with the infarcted mass and ventricular remodeling. Moreover, the substantial decline in some inflammatory cytokines combined with the remarkable increase in IL-10 appears to attenuate, at least in part, the harmful effects of IL-6 on ventricular remodeling.[12]

Early coronary recanalization and use of both antithrombotic and highly effective lipid-lowering drugs are well-established strategies in the treatment of patients with MI. However, improved knowledge of the residual inflammatory risk during the early follow-up of MI may contribute to creating new therapeutic opportunities.[13]

In our study, IL-6 concentrations were inversely associated with left ventricular function. Mendelian randomization studies have suggested a causal role of IL-6 in coronary heart disease[14 , 15] and in the development of abdominal aortic aneurysm.[16] Two recent large prospective studies involving individuals after acute coronary events showed an independent association between higher concentrations of IL-6 and main cardiovascular outcomes, including cardiovascular death, even after multiple adjustments to classical biomarkers of cardiovascular disease.[17 , 18] The interaction of IL-6 with its receptor seems to modulate the inflammatory microenvironment in cardiovascular diseases related to both plaque destabilization and long-term prognosis.

This inflammatory microenvironment involving endothelial and inflammatory biomarkers may be modulated by the antiplatelet therapy chosen.[19 , 20] However, in the large DISPERSE-2 (Dose Confirmation Study Assessing Anti-Platelet Effects of AZD6140 vs Clopidogrel in NSTEMI 2) study,[21] comparing ticagrelor with clopidogrel after recent acute coronary syndrome, no differences were found in inflammatory biomarkers at baseline, at discharge, and after 4 weeks. The marked decrease in the levels of other inflammatory markers, such as IL-1β and IL-18, and the increase in the levels of protective IL-10 may have contributed to a more favorable inflammatory response, despite persistently high levels of IL-6. Furthermore, these patients received an effective lipid-lowering treatment of proven anti-inflammatory action, with either rosuvastatin[22] or simvastatin/ezetimibe combination.[23] Interestingly, only the level of IL-6 showed no change after the medical treatment, suggesting that the control of this cytokine requires additional therapy, such as the use of a monoclonal antibody or a drug that can reduce IL-6-triggered inflammatory activity.[24 , 25]

IL-4 has several biological properties, including differentiation of Th1 lymphocytes into cells with less inflammatory activity (Th2).[25] In addition, chronically elevated IL-4 was reported to have a causal relationship with cardiac fibrosis and adverse cardiac remodeling.[26] Furthermore, dilated cardiomyopathy induced by angiotensin II is modulated by IL-4 levels.[27] In our study, we observed an association between baseline IL-4 levels and the amount of infarcted mass after 30 days of MI. These findings suggest an important role for this cytokine, possibly by attenuating the myocardial inflammatory process through greater cell differentiation into less inflammatory phenotypes (M2 macrophages and Th2 lymphocytes). In this setting, IL-4 may influence the entire ventricular remodeling process. It may take several weeks to occur and seems to depend on the crosstalk between inflammatory cells and cardiomyocytes, thus determining elimination of necrotic cells and promoting cell replacement and formation of the fibrotic scar.[28]

Inflammasomes are a family of the innate immune system that includes NLRP3, which has been recognized as a relevant trigger for the inflammatory cascade related to cardiovascular disease.[29] This platform can be activated by many stimuli, including hypoxia, promoting the release of the highly inflammatory cytokines IL-1β and IL-18.[30] Furthermore, metabolic syndrome and diabetes are related to IL-18 concentrations. Whereas IL-1β is related to the inflammatory cascade of cardiovascular disease, IL-18 seems to be associated with inflammatory mechanisms, favoring cancer development and showing higher concentrations in subjects with diabetes and insulin resistance.[31 , 32] Our study showed a decrease in both cytokines (IL-1ß and IL-18), suggesting a decrease in the stimuli for NLRP3 activation after 30 days of STEMI.

Our study also reinforces the important role of IL-6, the only unmodified cytokine 30 days after MI, showing a significant correlation with hsCRP at baseline and 30 days after STEMI, a previously reported association.[33] In our study, only patients with STEMI undergoing thrombolysis in the first 6 hours and referred to coronary angiography in the first 24 hours were included. Thus, this is a highly homogeneous population receiving standard medical care. Taking into account the association of chronically elevated levels of IL-6 with the recurrence of coronary events, heart failure, cardiovascular mortality, and all-cause mortality, an additional decrease in the residual inflammatory risk seems to be a promising target for intervention.[34 , 35]

Study limitations

The study population received lipid-lowering and antiplatelet therapies whose anti-inflammatory effects may have contributed to the study results. However, these treatments are part of the standard of care for these subjects. Some inflammatory cytokines capable of activating the inflammatory pathway mediated by IL-6, such as tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) or IL-1R, were not measured and may have relevance in host tissue responses and ventricular remodeling.[36 , 37] In fact, MI per se could be related to an increase in IL-6 as a response to injury. However, IL-6 titers remained elevated while other cytokines changed their serum levels after 30 days of STEMI. Another important inflammatory biomarker not evaluated in the study was IL-1α, which is released from necrotic cardiomyocytes and activates the immune responses from fibroblasts.[38] IL-1α blockade decreases chemoattractant activity for many cells mediated by CCL2/MCP-1 and IL-6.[38] In addition, monocyte and lymphocyte recruitment in ischemic heart can be stimulated by several chemoattractants such as CCL2 and CCL5, thus influencing tissue healing.[39] Finally, the transforming growth factor beta (TGF-β), which is highly expressed after acute MI, was not evaluated in our study as well but has been implicated in cardiomyocyte survival and ventricular remodeling.[40]

The results presented herein refer to a relatively early period after acute MI, but this is the time when inflammatory infiltrate seems to be more relevant to cell recovery or reperfusion injury.

Conclusions

During the first month post-MI, we observed a marked improvement in the balance of pro- and anti-inflammatory cytokines, except for IL-6. These findings suggest residual inflammatory risk.

Highlights

As estratégias atuais de cuidado de pacientes com infarto agudo do miocárdio parecem insuficientes para modificar a via inflamatória mediada pela interleucina-6. Maiores concentrações dessa citocina parecem estar associadas a menor fração de ejeção ventricular. As terapias direcionadas à interleucina-6 parecem promissoras para diminuição adicional do risco inflamatório residual em sujeitos com infarto agudo do miocárdio. O grande desafio de reduzir o risco inflamatório residual está em desenvolver terapias seguras e acessíveis.

Current strategies in the care of patients with acute myocardial infarction seem to be insufficient to modify the inflammatory pathway mediated by interleukin-6. Higher concentrations of this cytokine appear to be associated with decreased left ventricular ejection fraction. Therapies targeting interleukin-6 seem promising for their additional decrease in residual inflammatory risk in subjects with acute myocardial infarction. The great challenge for reducing residual inflammatory risk lies in the development of safe and affordable therapies.