Susceptibility to thiopurine toxicity by TPMT and NUDT15 variants in Colombian children with acute lymphoblastic leukemia.

Objective: This study aimed to correlate the genetic profile of the NUDT15 and TPMT genes with the side effects of the treatment of pediatric patients with acute lymphoid leukemia who were undergoing maintenance therapy at a tertiary care hospital in 2017.
Methods: This was an analytical, longitudinal, observational study in which the genotypes of the genes of interest were determined by PCR allelic discrimination with TaqMan® probes in patients receiving chemotherapy during the maintenance phase in the Pediatric Hematology and Oncology Unit in 2017. Sociodemographic and clinical data corresponding to the first six months of their maintenance chemotherapy were collected, and the correlation between the genotypes obtained and the development of side effects during the maintenance phase of chemotherapy in these patients was evaluated.
Results: Seventy pediatric patients were included in the study. Genetic analyses were carried out of these for NUDT15 and TPMT (rs1800462 and rs1800460) on 68 patients, while for the rs1142345 polymorphism, typing was achieved in 42 patients. 4/68 patients were heterozygous for NUDT15, and the same number of patients were heterozygous for rs1800462 and rs1142345, while for rs1800460, 6 heterozygous patients were identified. No statistically significant association was identified between the genetic variants and the outcomes of interest.
Conclusion: Studies with a larger population size are needed and the evaluation of other genetic variants that may influence the development of side effects during maintenance chemotherapy.

Remark

Introduction

Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most common malignancy in childhood, accounting for 25% of all malignancies in children under 15 years of age . It is classified into two large groups, according to the cell of origin. 85% of the cases correspond to ALL with B cell precursors and 15% with T cell , . It occurs more frequently in children with Hispanic and Caucasian ancestry than in those of African ancestry , . A few environmental risk factors have been associated with ALL in children (exposure to radiation and certain chemicals); however, these associations explain only a minority of cases .

One of the major milestones in the therapy of children with ALL was the development of an intensive regimen of 8 drugs, eight weeks of induction and consolidation, which formed the basis of the BFM (Berlin-Frankfurt-Münster) regimen, which is the backbone of current therapies for ALL. In addition, the chemotherapy strategy also includes intensification and maintenance therapy . Since the introduction of this therapeutic regimen, multiple collaborative clinical trials have been developed that have resulted in important advances on the survival of patients with ALL, reaching overall survival rates up to 90% , .

Despite the improvements in the survival rate for most pediatric patients, relapses occur between 15% and 20% and are an important cause of morbidity and mortality in pediatric patients with ALL , . At the same time, in the majority of multicenter trials of first-line treatment for ALL in children, up to 5% die due to the treatment toxic side effects , . Treatment-related deaths occur during recurrent and prolonged episodes of neutropenia and lymphopenia due to cytotoxic and immunosuppressive drugs or because leukemia itself could inhibit bone marrow recovery after induction therapy, especially in those patients classified as slow responders , .

Technological progress has allowed the identification of genomic variations that determine characteristic pharmacogenomic patterns, responsible for the individual differences observed in response to treatment in terms of effectiveness or toxicity. Currently, the TPMT genotype is the main pharmacogenetic pattern with implications for treatment protocols for patients with ALL with treatment based on thiopurines . 6- mercaptopurine (6-MP) is specifically important in therapy maintenance, the longest phase during treatment. In patients with homozygous variants in TPMT, an 85%-90% dose reduction is required - . Other genes involved in thiopurine metabolism have been evaluated for their behavior in ALL ; Among these, the NUDT15 gene has recently emerged as an important prediction candidate for toxicity .

Yang et al. , through a study of GWAS and its respective replication cohort, identified two loci related to the dose intensity of 6-MP: rs1142345 in the TPMT gene and rs116855232 in NUDT15. This last variant was common among Asians and Hispanics but infrequent among Europeans, and not observed in Africans, thus contributing to differences in mercaptopurine tolerance related to ancestry. Also, this study showed that heterozygous patients for TPMT or NUDT15 variants required a 50% decrease in the 6-MP dose compared to those with wild type genotype . Based on these results, the same group of researchers, subsequently replicated these results in cohorts in Guatemala, Singapore, and Japan, adding functional genomics studies where they concluded that the presence of SNPs resulted in a loss of nucleotide diphosphatase activity, and patients with these defective NUDT15 alleles exhibited high levels of active thiopurine metabolites, thus increasing their toxicity . Scientific interest in this gene has increased in recent years. It has led to its association with age related reductions in mercaptopurine dose , association with myelosuppression , development of severe toxicity , and 6-MP intolerance in specific population groups , making it an important candidate for evaluation in pharmacogenetic studies related to 6-MP tolerance, although with less support in the literature than the TPMT.

To date, there are no published reports of pharmacogenomic approaches to the treatment response and chemotherapy toxicity for ALL in the pediatric population of Colombia. This becomes even more important when pharmacogenetic differences related to ancestry have been described - . It has been suggested that pharmacogenetic studies should be carried out independently or collaboratively in different Latin American countries to better understand these relationships . This study aimed to evaluate the association between the genetic profile of the NUDT15 and TPMT genes and the side effects during maintenance phase of treatment in a sample of Colombian pediatric patients with acute lymphoid leukemia.

Materials and Methods

Design

This was an observational, longitudinal study carried out at a university-affiliated pediatric cancer center in Bogota, Colombia, that receives patients from rural and urban areas, and it is a national referral hospital for childhood cancer care.

Patients and data collection

Patients from 1 to 18 years of age diagnosed with acute lymphoblastic leukemia who were admitted to the Pediatric Hematology and Oncology Unit and who were in the maintenance therapy of BFM ALLIC 2009 chemotherapy protocol during 2017 were enrolled in this study. Patients younger than 1-year-old or those with Down syndrome as comorbidity were excluded from this study. For this study, a convenience sampling was carried out, including consecutively all the patients who met the selection criteria and agreed to participate. The characteristics and clinical results obtained with this protocol in our setting have been previously published . The study was conducted in accordance with the national policy for clinical research and followed the Declaration of Helsinki Ethical Principles for Medical Research Involving Human Subjects. This research protocol was approved by the ethics committees of the participating university and hospital. (Act 015-184-16 of 08/25/16 and CEI-38-16 of 08/11/16). Patients' blood samples and clinical data were collected after obtaining parental consent. Additionally, for each patient from 14 years of age, their assent to participate in this study was obtained.

The surplus of the whole blood sample taken as part of the usual controls was used for DNA extraction. In addition, patients were followed up monthly for six months in order to identify the occurrence of adverse effects due to treatment (myelosuppression, liver toxicity, or toxic death). During this follow-up, information regarding laboratory (white blood cell (WBC) count and liver function) and clinical data related to adjustments in treatment and the development of complications were collected. For this study, follow-up was carried out in conjunction with follow-up visits during maintenance, which for these patients are carried out on a monthly basis.

Outcomes

The outcomes of interest were side effects as myelotoxicity and liver toxicity and the dose reduction or interruption of 6-MP. As an exploratory analysis, we evaluated other outcomes as febrile neutropenia, relapse and deaths.

DNA extraction

The DNA extraction was carried out using the QIamp DNA Blood Mini Kit™, following the manufacturer's specifications and as previously reported , . Briefly, 200 μL of whole blood was subjected to the series of steps described in the manufacturer's guide, using the technique of column filtration by microcentrifugation. The DNA quantification was carried out by spectrophotometry in a Nanodrop2000™, and this same equipment was used to measure the 260/280 nm ratio to determine the purity of the genetic material. The genetic material obtained was stored in 1.5 mL Eppendorf™ tubes at a temperature of -20° C until its use in polymerase chain reaction (PCR) assays.

TaqMan® 5' nuclease real-time PCR

The determination of the genotypes of the SNPs (rs1800462, rs1800460, rs1142345, and rs116855232) in the TPMT and NUDT15 genes was carried out in real-time PCR for allelic discrimination by 5' nuclease using commercially available TaqMan® SNP Genotyping Assays (Assay ID: C__12091552_30, C__30634116_20, C_____19567_20 and C_154823200_10, Thermo Fisher Scientific, USA), following the recommendations described in the "TaqMan® Allelic Discrimination Guide". For this, we used a PCR mixture containing 15 ng DNA (3 μL), 1.25 μL of the corresponding TaqMan® probe (20X), 12.5 μL TaqMan® Gene Expression Master Mix and 8.25 μL of nuclease-free ultrapure water for a final volume per reaction of 25 μL. All the tests were carried out in duplicate. The tests were carried out using the CFX96 Touch ™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad), following the operating conditions suggested by the manufacturer for each probe.

Data analysis

Data are presented as median plus interquartile ranges for the quantitative variables, while their respective frequencies are shown for the qualitative data. The allelic and genotypic frequencies, as well as the Hardy-Weinberg equilibrium, were evaluated using snpReady. TPMT typing was carried out following the standards of the Clinical Pharmacogenetic Implementation Consortium . Briefly, TPMT haplotypes were determined based on the combinations of SNPs rs1800462, rs1800460 and rs1142345 as follows: CCT = * 1, GCT = * 2, CTC = * 3A, CTT = * 3B and CCC = * 3C. To determine the association between the genetic variants and the outcome of interest (some type of toxicity), the Chi-square statistic was used. The statistical analyses were performed using SPSS for Mac, version 2.0, and a value of p <0.05 was considered statistically significant.

Results

General characteristics of study subjects

A total of 73 patients with ALL diagnosis that were in maintenance phase during 2017 in our institution. Of these, 70 patients agreed to participate in the project. From these patients, in two cases, it was not possible to extract DNA for genetic studies, so the statistical analyzes were based on the 68 patients in whom genetic studies were performed. Figure 1 presents a flow diagram showing the selection of patients included in the analysis.

Figure 1

Patients' inclusion flowchart. This diagram shows how the inclusion of patients in the study was carried out and the details of the performance of the genetic studies.

Table 1 summarizes the general characteristics of the study population. A total of 70 patients were included in the study, with a male-to-female ratio of 1:1. The median age was six years when entering the maintenance therapy (IQR: 7 years). More than 50% of the study population was from Bogota, close to 42% were from small towns and rural areas. Regarding the outcomes evaluated, myelotoxicity in 25% Liver toxicity in 27% and reduction of 6-MP during follow-up was documented in 32.9% of patients. It is important to highlight that in our 6-month follow-up, there were no loss of patients.

Table 1

General characteristics and clinical follow-up of study population.

Characteristic		Measure
		n or median	% or IQR
Gender	Female	35	50%
Age (Years old)		6	7
Lineage	B	65	92.9%
	T	5	7.1%
Risk	Standard	7	10.0%
	Intermediate	34	48.6%
	High	29	41.4%
6-MP Reduction		23	32.9%
6-MP Interruption		20	28.6%
Febrile Neutropenia		8	11.4%
Relapse		11	15.7%
Death		2	2.9%
Follow-up 1	ALT (IU/L)	48.7	91.3
	AST (IU/L)	37.0	25.3
	WBC/mm3	3,315	1,370
	Neutrophils/mm3	1,820	1,137.5
	Lymphocytes/mm3	780	690
	Total Bilirubin (mg/dL)	0.5	0.3
Follow-up 2	ALT (IU/L)	42.5	97.5
	AST (IU/L)	33.55	31.13
	WBC/mm3	3,060	2,160
	Neutrophils/mm3	1,721	1,682.5
	Lymphocytes/mm3	630	675
	Total Bilirubin (mg/dL)	0.5	0.3
Follow-up 3	ALT (IU/L)	47.00	98.48
	AST (IU/L)	34	37
	WBC/mm3	3,095	14,87.5
	Neutrophils/mm3	1,615	1,196.5
	Lymphocytes/mm3	742	546
	Total Bilirubin (mg/dL)	0.5	0.4
Follow-up 4	ALT (IU/L)	50.35	76.43
	AST (IU/L)	32.55	23.31
	WBC/mm3	3,400	1,640
	Neutrophils/mm3	1,940	1,276.75
	Lymphocytes/mm3	760	565
	Total Bilirubin (mg/dL)	0.6	0.425
Follow-up 5	ALT (IU/L)	50.8	116.9
	AST (IU/L)	37	42.1
	WBC/mm3	3,360	1700
	Neutrophils/mm3	1,850	1,707.5
	Lymphocytes/mm3	840	465
	Total Bilirubin (mg/dL)	0.6	0.465
Follow-up 6	ALT (IU/L)	65.1	101.9
	AST (IU/L)	39.8	36.2
	WBC/mm3	3370	1,920
	Neutrophils/mm3	1,830	1,674.5
	Lymphocytes/mm3	910	636
	Total Bilirubin (mg/dL)	0.6	0.5

This table resumes the general clinical characteristics and follow-up data of the patients included in the study. For each laboratory data, the measurement system used has been noted. The data presented in the "Measure" columns corresponds to the n or medians (subcolumn n or median) and in the other subcolumn its percentage or interquartile range (IQR) is evidenced.

Allele and genotype frequencies

Of the 70 patients included in the study, genetic material with adequate quality and quantity was obtained in 68 cases (concentrations from 10 to 129 ng/µL and an average 260/280nm ratio of 1.87; optimal values between 1.8 and 2.0- , ). Although DNA extraction was carried out twice for the other two cases, no genetic material was obtained with the quality conditions required to carrying out the polymerase chain reaction assays. A total of 14 patients carried a susceptibility allele: 4 for NUDT15, 4 for rs1800462 (TPMT), 6 for rs1800460 (TPMT), and 4 for rs1142345 of TPMT. Figure 2 shown representative allelic discrimination.

Figure 2

Representative allelic discrimination plots for TaqMan genotyping assays. There were no homozygous patients for the mutated alleles of any of the polymorphisms studied. The graphs represent the groups of samples with the wild type allele aligned towards the X or Y axes according to the probe used for their recognition. The non-aligned dots correspond to the mutated allele.

Table 2 shows the summary of allelic and genotype frequencies for each of the SNP's tested. All variants were found to be in Hardy-Weinberg equilibrium (HWE). Table 3 summarizes the typing of TPMT following the standards of the Clinical Pharmacogenetic Implementation Consortium" in the 42 patients in which the typing of the 3 SNPs was controlled . Briefly, TPMT haplotypes were determined based on the combinations of SNPs rs1800462, rs1800460 and rs1142345 as follows: CCT = * 1, GCT = * 2, CTC = * 3A, CTT = * 3B and CCC = * 3C.

Table 2

Allelic and genotypic frequencies of the polymorphisms of interest.

Gene		Annotation	n	Frequency	HWE (p Value)	LatinAmerica1	LatinAmerica2
NUDT15	Alleles	rs116855232	68		0.802	n= 804	n= 974
		C	132	0.97		0.994	0.953
		T	4	0.03		0.006	0.047
	Genotypes	C/C	64	0.94
		C/T	4	0.06
		T/T	0	0
TPMT	Alleles	rs1800462	68		0.802	n= 500	n= 628
		C	132	0.970		0.992	0.997
		G	4	0.03		0.008	0.003
	Genotypes	C/C	64	0.94
		C/G	4	0.06
		G/G	0	0
	Alleles	rs1800460	68		0.703	n= 1,430	n= 7,010
		T	6	0.044		0.026	0.045
		C	130	0.956		0.974	0.955
	Genotypes	T/T	0	0
		T/C	6	0.09
		C/C	62	0.91
	Alleles	rs1142345	42		0.746	n= 1,232	n= 5,254
		C	4	0.0476		0.041	0.052
		T	80	0.9524		0.959	0.948
	Genotypes	C/C	0	0
		C/T	4	0.10
		T/T	38	0.90

This table shows the allelic and genotypic frequencies of the polymorphisms studied. All variants were found to be in Hardy-Weinberg equilibrium (column HWE). Additionally, the allelic frequencies identified in our study were compared with those reported in Latin American population noted in the ALFA project. There were no statistically significant differences between our frequencies and those reported in the ALFA project.

Table 3

TPMT typing

	Frequencies
Haplotypes	*1	78
	*2	2
	*3A	4
Types	*1/*1	36
	*1/*2	2
	*1/*3A	4

Frequencies of TPMT haplotypes based on the standards of the "Clinical Pharmacogenetic Implementation Consortium" are listed. Given that genotyping of rs1142345 was only possible in 42 subjects and that to carry out these classifications, it is necessary to have genotyping of the 3 TPMT loci. These data correspond only to the 42 patients in whom genotyping was completed.

The allele frequencies obtained in the present study were compared to the frequencies reported in the dbSNP databases for Latin American populations obtained from the ALFA (Allele Frequency aggregator) (Table 3). The database frequency of genotypes and phenotypes (dbGap) was developed to archive and distribute the data and results from studies that have investigated the interaction of genotype and phenotype in humans . The results obtained for each SNP analyzed did not show a statistically significant difference from the frequencies obtained in the ALFA project.

Genetics associations

Table 4 summarizes the results of the bivariate analyzes in which the correlation between the genetic variants of the SNPs of interest in NUDT15 and TPMT and the side effects of interest. No association was found between the outcomes of interest and the genetic variant of NUDT15 or any TPMT polymorphisms evaluated individually. Similar analyses were carried out about the typing of TPMT, using the homozygosity variable for allele *1 versus carrying *2 or *3A as heterozygous, without evidence of any statistically significant association (supplementary table 1S).

Table 4

Association analysis between genotypes and outcomes.

OUTCOMES	NUDT15			TPMT
				rs1800462			rs1800460	rs1142345
	C/C	C/T	C/C	C/G	T/C	C/C	C/T	T/T
6-MP Reduction
Yes	21	2	22	1	3	20	2	8
No	43	2	42	3	3	42	2	30
6-MP Interruption
Yes	19	1	18	2	1	19	0	10
No	45	3	46	2	5	43	4	28
Neutropenia
Yes	7	1	6	2	0	8	0	5
No	57	3	58	2	6	54	4	33
Relapse
Yes	8	1	8	1	0	9	0	5
No	56	3	56	3	6	53	4	33
Death
Yes	1	1	2	0	0	2	0	2
No	63	3	62	4	6	60	4	36

Data are presented as absolute frequency values for each outcome evaluated. No statistically significant association was found between any of the polymorphisms studied and the outcomes of interest.

Table 2S

Comparison of laboratory follow-up according to genotypes.

Follow-up		NUDT15		TPMT
				rs1800462		rs1800460		rs1142345
		C/C	C/T	C/C	C/G	T/C	C/C	C/T	T/T
1st	ALT (IU/L)	46.20	50.50	49	36	45.15	48.60	49.30	53
	AST (IU/L)	34.20	41.80	36.90	30.30	42.90	35.35	42.90	38.55
	WBC/mm3	3,315	3,780	3,315	3,610	2,200	3,380	2,030	3,310
	Neutrophils/mm3	1,820	1,995	1,820	1,737	980	1,910	1,020	1,980
	Lymphocytes/mm3	783	409	780	773	630	783	600	725
	Total Bilirubin (mg/dL)	0.50	0.60	0.51	0.40	0.60	0.50	0.45	0.52
2nd	ALT (IU/L)	45	74.50	55.40	28.80	26	46	53.15	45
	AST (IU/L)	33.55	33.70	33.55	33.15	37	32.70	42.80	38.25
	WBC/mm3	3,135	2,170	3,020	3,980	2,160	3,225	2,305	3,245
	Neutrophils/mm3	1,835	655	1,691	2,515.50	1,295	1,835	1,440	1,835
	Lymphocytes/mm3	630	1,290	640	475	727	630	583.50	746.50
	Total Bilirubin (mg/dL)	0.50	0.23	0.50	0.45	0.40	0.50	0.40	0.59
3rd	ALT (IU/L)	40	59.10	39.50	89.45	37	54	80.20	54
	AST (IU/L)	34.50	33.10	33.30	38.65	42.20	33.65	42.20	35
	WBC/mm3	3,070	2,865	3,100	2,085	3,100	3,050	3,130	3,055
	Neutrophils/mm3	1,635	1,430	1,645	1,175	1,440	1,635	2,680	1,540
	Lymphocytes/mm3	734	1010	753	470	1030	712	875	768
	Total Bilirubin (mg/dL)	0.50	0.30	0.50	0.60	0.50	0.50	0.50	0.50
4th	ALT (IU/L)	52.40	18.10	52.40	33.70	41.60	52.40	138.30	63
	AST (IU/L)	31.10	32.10	31.20	36.30	47.21	31.20	89.90	30.40
	WBC/mm3	3,400	3,135	3,400	2,980	2,570	3,510	2,615	3,635
	Neutrophils/mm3	1,940	1,720	1,955	860	1,700	1,970	1,735	1,955
	Lymphocytes/mm3	760	740	760	1,305	535	800	535	800
	Total Bilirubin (mg/dL)	0.70	0.40	0.60	0.70	0.45	0.70	0.40	0.70
5th	ALT (IU/L)	54	23.40	55	24	29.10	54	67.10	60.75
	AST (IU/L)	40.70	35.40	42.10	25.50	42.10	38.15	55.10	47.30
	WBC/mm3	3,470	3,060	3,430	3,435	2,615	3,470	2,615	3,740
	Neutrophils/mm3	1,930	1,410	1,905	1,764	1,360	1,930	1,360	1,800
	Lymphocytes/mm3	845	560	830	900	793	850	845	870
	Total Bilirubin (mg/dL)	0.50	0.45	0.50	0.80	0.30	0.60	0.40	0.65
6th	ALT (IU/L)	68.55	38	70.30	35.45	71	66.05	71	70.10
	AST (IU/L)	41.50	30.90	43.95	31.35	53.80	40	63	44.90
	WBC/mm3	3,385	2,655	3,385	3,145	3,200	3,370	2,755	3,650
	Neutrophils/mm3	1,820	1,415	1,790	1,790	1,515	1,800	1,185	1,750
	Lymphocytes/mm3	905	1,060	910	810	681	915.50	680	921
	Total Bilirubin (mg/dL)	0.60	0.50	0.60	0.71	0.56	0.60	0.38	0.60

Although no statistically significant associations were identified, two of the four patients heterozygous for NUDT15 required a decrease in 6-MP during the follow-up period. Concerning the genetic variants of TPMT, for rs1800462, two of the four heterozygous patients presented febrile neutropenia, and the same patients also required discontinuation 6-MP during the first six months of maintenance therapy. In the case of rs1800460, of the six heterozygous patients, three required a dosage decrease, and two were also heterozygous for rs1142345. Additionally, differences in the median for the lab values taken in the first 6 months of maintenance treatment were evaluated: aminotransferases, total bilirubin, leukocytes, and differential cell counts; based on genetic variants, no statistically significant differences were found (Supplementary table 2S).

Table 1S

Association analysis between TPMT diplotypes and outcomes.

OUTCOMES	TPMT diplotypes		p Value
	*1/*1	*1/another
6-MP Reduction
Yes	8	2	0.616
No	28	4
6-MP Interruption
Yes	10	0	0.308
No	26	6
Neutropenia
Yes	5	0	1.000
No	31	6
Relapse
Yes	4	1	0.557
No	32	5
Death
Yes	2	0	1.000
No	34	6

Discussion

To our knowledge, this is the first study in Colombia that evaluated the the NUDT15 and TPMT genes polymorphisms and their correlation with the side effects of chemotherapy in pediatric patients with acute lymphoblastic leukemia. Although we are considered as a Latino population, different degrees of Caucasian, Amerindian and African ancestry are found in different regions of Colombia. Although, our findings vary significantly from previous reports regarding the association between variants and outcomes , , , , those studies were carried out in non-Latino population.

The allelic frequency for the NUDT15 mutation identified in our study (0.03) is lower than previously reported , , , , a possible explanation for this finding is that most studies on this polymorphism were done in populations of Asian origin, finding allelic frequencies of up to 0.27. In the sample tested in our study, originated from the central Andean region of Colombia, the caucasian component (European ancestry) could account for near 50-60% of the genetic ancestry . Another reason could be related to our sample size , . For the particular case of TPMT polymorphisms, only one study has previously been conducted in the Colombian population, in which Isaza et al. , describe frequencies for allele *2 and *3A of 0.004 and 0.035, respectively, which are lower than those found by us (0.02 and 0.05, respectively). When compared to other Latin American results, we found that our frequencies are also slightly different from those described by Garrido et al. , in pediatric patients with acute lymphoblastic leukemia in Guatemala. They identified a frequency of 0.005 for *2 and 0.0375 for *3A. However, our *2 frequency is similar to that found in Brazil by Boson et al. , who describe a frequency of 0.022 but a much lower frequency for *3A (0.015). More recently, in Uruguayan pediatric patients who have acute lymphoblastic leukemia, a *3A frequency of 0.05, which is similar to ours, has been described, but with a lower frequency of *2 .

Increasing evidence highlights the role of genetic variants of NUDT15 in the development of side effects of 6-MP toxicity , , , . However, when evaluating the possible associations in our study population, we failed to identify any statistical significance, possibly because of the sample size. Concerning TPMT, evidence supports its role in both the pharmacokinetics and the toxic effects of mercaptopurine , . Our study did not find any association between the allelic frequencies of each polymorphism or in those 42 cases in which we had the complete typing of TPMT. Among the possible reasons that would explain this results, for the case of NUDT15, could be that the original studies describing such associations were based on GWAS approach , in which the representation of the Latino population was low, and this may be due to an effect related to the specific ancestry of the Colombian population . On the other hand, in the case of TPMT, an explanation could be that the alleles found in our population (*2 and *3A) correspond to intermediate metabolizers, which usually do not require many adjustments in therapy .

In exploratory analyses, we evaluated whether there was an association between the genetic variants studied and the outcomes: relapses or death, reviewed as of October 2018, without showing any correlation, which is consistent with what is described by Lennard et al. , who, after genotyping TPMT in 2,387 patients with acute lymphoblastic leukemia, found no association with event-free survival. Within the limitations of the present study, there are the sample size and selection bias since it is a captive sample. However, patients were included prospectively and consecutively, which allowed better follow-up of the development of the adverse events of interest. On the other hand, a great strength of the present study is the translational approach, based on previous clinical observations and the evaluation of basic biomedical aspects that could answer the search for predictive factors for the development of toxicity in the treatment of pediatric patients with oncological conditions.

Conclusions

In summary, the allelic frequencies of the genes of interest were different from those previously described, even when compared with Latin American studies. We did not find any statistical association with toxicity events for any of the polymorphisms studied. These findings highlight the need for future studies with a larger sample size; either through a multicenter study with pediatric ALL patients or even including other pediatric populations receiving management with thiopurines, such as patients with inflammatory bowel disease or juvenile idiopathic arthritis, which may allow us to have an adecuate sample size on which to identify better inferences of associations with toxicity outcomes, as well as, to evaluate the possibility that other genes may be influencing toxicity and side effects and to examine the effect that ancestry could have on these interactions in populations with a genetic admixture like our population.

Contribución del estudio

Introducción

La Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) es el cáncer más frecuente en la edad pediátrica, representando el 25% de todas las neoplasias en niños menores de 15 años . Esta se clasifica en dos grupos acorde a su origen celular con 85% de los casos correspondientes a LLA de precursores B y 15% de células T ,. La LLA es más frecuente en niños de ancestría hispana y caucásica comparados con los de ancestría africana (,. Aunque algunos factores ambientales han sido identificados como factores de riesgo para LLA en niños ( exposición a radiación y a algunos químicos), estas asociaciones solo explican un pequeño grupo de casos (.

Uno de los grandes hitos en la terapia de niños con LLA fue el desarrollo del régimen intensivo de 8 drogas, 8 semanas de inducción y consolidación, el mismo que fue la base del régimen BFM (Berlín-Frankfurt-Münster) y que es el núcleo de las terapias contemporáneas para LLA, esta estrategia quimioterapéutica incluye además terapias de intensificación y mantenimiento . Desde la introducción de este régimen terapéutico, se han venido desarrollando múltiples ensayos clínicos colaborativos que han logrado importantes avances en la supervivencia de los pacientes con LLA, alcanzando tasas de supervivencia total de hasta 90% ,.

Pese a las mejoras alcanzadas en supervivencia para la mayoría de pacientes pediátricos, las recaídas ocurren entre el 15-20% y son una causa importante de morbimortalidad en pacientes pediátricos con LLA ,. En línea con esto, en la mayoría de los ensayos multicéntricos de tratamiento de primera línea en LLA en niños, hasta el 5% fallecen debido a los efectos tóxicos secundarios del tratamiento ,. Las muertes relacionadas al tratamiento ocurren durante episodios recurrentes y prolongados de neutropenia y linfopenia debidas a drogas citotóxicas e inmunosupresoras o porque la leucemia, por sí misma, inhibe la recuperación de la médula ósea durante la terapia de inducción, especialmente en pacientes catalogados como respondedores lentos ,.

El avance tecnológico ha permitido la identificación de variaciones genómicas que determinan patrones farmacogenómicos característicos, responsables de las diferencias individuales observadas en la respuesta al tratamiento en términos de efectividad o de toxicidad. Actualmente, el genotipo de TPMT es el principal patrón farmacogenético con implicaciones para los protocolos de tratamiento de los pacientes con LLA con tratamiento basado en tiopurinas (. La 6-mercaptopurina (6-MP) es esencial en el tratamiento de la LLA principalmente en la fase de mantenimiento, la cual es la fase más larga del tratamiento. Se ha descrito que entre el 85-90% de los pacientes con variantes homocigotas en TPMT se requieren reducciones de dosis de 6-MP -. Otros genes involucrados en el metabolismo de las tiopurinas han sido evaluados con respecto a su comportamiento en LLA ; dentro de estos, recientemente ha surgido el gen NUDT15 como un candidato importante en la predicción de toxicidad .

Yang et al. , mediante un estudio de GWAS y su respectiva cohorte de replicación, identificaron dos loci relacionados con la intensidad de dosificación de mercaptopurina: rs1142345 en el gen TPMT y rs116855232 en NUDT15. Esta última variante fue común entre asiáticos e hispanos pero infrecuente entre europeos y no observada en africanos, contribuyendo así a las diferencias en la tolerancia a mercaptopurina relacionada con la ancestría (. En este mismo estudio, evidenciaron que los pacientes heterocigotos para las variantes de TPMT o NUDT15, requirieron una disminución del 50% de la dosis de mercaptopurina comparados con los de genotipo silvestre (. El mismo grupo de investigadores, replicó estos resultados en cohortes de Guatemala, Singapur y Japón, adicionando estudios de genómica funcional, con los que evidenciaron que la presencia de los SNPs resulta en una pérdida de la actividad nucleótido difosfatasa, por lo que los pacientes con estos alelos defectivos de NUDT15, presentan niveles elevados de metabolitos activos de tiopurina aumentando así su toxicidad (. El interés científico en este gen es creciente en los últimos años y ha llevado a que se le asocie con reducciones de dosis de mercaptopurina en relación con la edad (, mielosupresión , desarrollo de toxicidad severa , e intolerancia a 6-MP poblaciones específicas , convirtiéndolo en un candidato importante a evaluar en estudios de farmacogenética relacionados con tolerancia a 6-MP; aunque con menor soporte en la evidencia que TPMT.

A la fecha, no existen publicaciones sobre enfoques farmacogenómicos relacionados con la respuesta al tratamiento y la toxicidad de la quimioterapia para la LLA en la población pediátrica de Colombia. Esto cobra aún más importancia, cuando se han descrito diferencias farmacogenéticas relacionadas con la ancestría -. Adicionalmente, se ha sugerido que estudios de corte farmacogenético deben ser realizados de manera independiente o colaborativa en distintos países latinoamericanos para un mejor entendimiento de estas relaciones . Este estudio tuvo como objetivo evaluar la asociación entre el perfil genético de los genes NUDT15 y TPMT y los efectos secundarios durante la fase de mantenimiento del tratamiento en una muestra de pacientes pediátricos colombianos con leucemia linfoide aguda.

Materiales y Métodos

Diseño

Este fue un estudio observacional analítico, de corte longitudinal, llevado a cabo en un hospital universitario que además es centro de cáncer infantil en Bogotá, que recibe pacientes de áreas rurales y urbanas, siendo un centro nacional de referencia para el cuidado de niños con cáncer.

Pacientes y recolección de información

Se incluyó a pacientes entre 1 y menos de 18 años diagnosticados con LLA que fueron admitidos a la Unidad de Oncohematología y quienes se encontraban recibiendo quimioterapia de mantenimiento del protocolo BFM ALLIC 2009 durante el 2017. Los pacientes menores de un año así como aquellos que presentaban Síndrome de Down como comorbilidad fueron excluidos de este estudio. Para los fines de este estudio, se llevó a cabo un muestreo por conveniencia en el que se incluyó de forma consecutiva a todos los pacientes que cumplían los criterios de selección y aceptaron participar. Las características y resultados clínicos logrados con este protocolo de quimioterapia en este centro, han sido previamente publicados (. Este estudio se llevó a cabo siguiendo las políticas nacionales para investigación clínica y sujeto a los principios éticos de la Declaración de Helsinki. El protocolo de investigación fue aprobado por los comités de ética de las instituciones involucradas en su ejecución (Acta 015-184-16 del 25/08/16 y CEI-38-16 del 11/08/16). Las muestras de sangre y los datos clínicos fueron obtenidos solo bajo consentimiento de los padres o cuidadores y para cada paciente de 14 años en adelante también se consiguió su asentimiento para participación en el estudio.

El excedente de las muestras de sangre total que son tomadas como parte habitual del control de los pacientes con LLA fue usado para la extracción de ADN. Los pacientes fueron seguidos hasta por seis meses para identificar la aparición de efectos adversos debidos al tratamiento (mielo-supresión, toxicidad hepática, muerte tóxica). Durante este seguimiento, información clínica y paraclínica (hemograma, pruebas de función hepática) así como datos relacionados con ajustes en el tratamiento y el desarrollo de complicaciones fueron colectados. Para este estudio el seguimiento de los pacientes se llevó a cabo de forma paralela con los controles clínicos realizados durante la fase de mantenimiento, que en este centro es llevado a cabo de forma mensual.

Desenlaces

Los desenlaces de interés fueron efectos secundarios como mielotoxicidad y toxicidad hepática, así como la reducción o interrupción de la dosis de 6-MP. Como análisis exploratorio, evaluamos otros resultados como neutropenia febril, recaída y muertes.

Extracción de ADN

Para la extracción de ADN de las muestras de interés se empleó el estuche comercial QIamp DNA Blood Mini Kit™, siguiendo las especificaciones del fabricante y como ha sido previamente descrito (,. En breve, 200 μL de sangre total fueron sometidos a la serie de pasos descritos en la guía del fabricante, mediante el empleo de la técnica de filtración en columna mediante microcentrifugación. La cuantificación del ADN se llevó a cabo mediante espectrofotometría en un equipo Nanodrop2000™ y en este mismo equipo se realizaron las mediciones de la razón 260/280 nm para determinar la pureza del material genético. El ADN obtenido se almacenó en tubos eppendorf™ de 1.5 mL a una temperatura de -20° C hasta su empleo en los ensayos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

PCR de discriminación alélica

La determinación de los genotipos de los SNP (rs1800462, rs1800460, rs1142345 y rs116855232) en los genes TPMT y NUDT15 se llevó a cabo mediante PCR en tiempo real de discriminación alélica por 5’ nucleasa usando los ensayos comercialmente disponibles TaqMan® SNP Genotyping Assays (Identificadores de ensayos: C__12091552_30, C__30634116_20, C_____19567_20 and C_154823200_10, Thermo Fisher Scientific, USA), siguiendo las recomendaciones descritas en “TaqMan® Allelic Discrimination Guide” y protocolos previos. Para esto, se empleó una mezcla de PCR que contenía: 15 ng ADN (3 μL), 1.25 μL de la sonda TaqMan®(20X) correspondiente, 12.5 μL TaqMan® Gene Expression Master Mix y 8.25 μL de agua ultrapura libre de nucleasas para un volumen final por reacción de 25 μL, las muestras se corrieron por duplicado. Los ensayos fueron llevados a cabo empleado el CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad), siguiendo las condiciones de corrido sugeridas para cada sonda por el fabricante.

Análisis de los datos

Los datos son presentados como medianas más rangos interquartiles para las variables cuantitativas, en tanto que para los datos cualitativos se muestras sus frecuencias respectivas.

Las frecuencias alélicas y genotípicas, así como el equilibrio de Hardy-Weinberg fueron evaluados usando el programa snpReady. La tipificación de TPMT se llevó a cabo siguiendo los estándares del Consorcio de Implementación de Farmacogenética Clínica . Con base en esto, los haplotipos de TPMT fueron determinados acorde a las combinaciones de los SNPs rs1800462, rs1800460 and rs1142345 siguiendo esta regla: CCT = * 1, GCT = * 2, CTC = * 3A, CTT = * 3B and CCC = * 3C. Para la determinación de la asociación entre las variantes genéticas y los desenlaces de interés, se empleó el estadístico Ji 2. Los análisis estadísticos fueron realizados usando SPSS para Mac, Versión 2.0, se consideró como estadísticamente significante un valor de p <0.05.

Resultados

Características generales de los sujetos de estudio

Un total de 73 pacientes con diagnóstico de LLA se encontraban en mantenimiento durante el 2017 en nuestra institución, de estos, 70 pacientes consintieron y/o asintieron su participación en el proyecto. De los pacientes incluidos, no se logró extraer ADN para los estudios de genotipifcación en 2 pacientes, por lo que los análisis fueron basados en los 68 pacientes en quienes se logró realizar estudios genéticos. La Figura 1 muestra el diagrama de flujo de selección e inclusión de los pacientes en el estudio.

Figura 1

Diagrama de inclusión de pacientes. Este diagrama muestra cómo se llevo a cabo la inclusión de pacientes en el estudio, así cómo los detalles relacionados con la realización de estudios genéticos.

La Tabla 1 resume las características generales de la población de estudio. Un total de 70 pacientes fueron incluidos con una razón hombre a mujer de 1:1. La mediana de edad al inicio de la terapia de mantenimiento fue seis años (RIC: 7 años). Más del 50% de la población de estudio fue de Bogotá y cerca del 42% correspondió a procedentes de zona rural. Con relación a los desenlaces evaluados, se documentó mielotoxicidad en 25%, toxicidad hepática en 27% y 32.9% de los pacientes requirió reducción de su dosis de 6-MP durante el seguimiento. Es importante resaltar que durante el periodo de estudio no se presentó ninguna pérdida de seguimiento.

Tabla 1

Características Generales y seguimiento clínico de la población de estudio.

Característica		Medición
		n o mediana	% o RIQ
Género	Femenino	35	50%
Edad (Años cumplidos)		6	7
Linaje	B	65	92.9%
	T	5	7.1%
Riesgo	Estándar	7	10%
	Intermedio	34	48.6%
	Alto	29	41.4%
Reducción dosis 6-MP		23	32.9%
Interacción 6-MP		20	28.6%
Neutropenia Febril		8	11.4%
Recaída		11	15.7%
Muerte		2	2.9%
Seguimiento 1	ALT (IU/L)	48.7	91.25
	AST (IU/L)	37	25.3
	Leucocitos/mm3	3,315	1,370
	Neutrófilos/mm3	1,820	1,137.5
	Linfocitos/mm3	780	690
	Bilirubina total (mg/dL)	0.5	0.3
Seguimiento 2	ALT (IU/L)	42.5	97.5
	AST (IU/L)	33.55	31.125
	Leucocitos/mm3	3,060	2,160
	Neutrófilos/mm3	1,721	1,682.5
	Linfocitos/mm3	630	675
	Bilirubina total (mg/dL)	0.5	0.3
Seguimiento 3	ALT (IU/L)	47	98.475
	AST (IU/L)	34	37
	Leucocitos/mm3	3,095	1,487.5
	Neutrófilos/mm3	1,615	1,196.5
	Linfocitos/mm3	742	546
	Bilirubina total (mg/dL)	0.5	0.4
Seguimiento 4	ALT (IU/L)	50.35	76.425
	AST (IU/L)	32.55	23.308
	Leucocitos/mm3	3,400	1,640
	Neutrófilos/mm3	1,940	1,276.75
	Linfocitos/mm3	760	565
	Bilirubina total (mg/dL)	0.6	0.425
Seguimiento 5	ALT (IU/L)	50.8	116.9
	AST (IU/L)	37	42.1
	Leucocitos/mm3	3,360	1,700
	Neutrófilos/mm3	1,850	1,707.5
	Linfocitos/mm3	840	465
	Bilirubina total (mg/dL)	0.6	0.465
Seguimiento 6	ALT (IU/L)	65.1	101.9
	AST (IU/L)	39.8	36.2
	Leucocitos/mm3	3,370	1,920
	Neutrófilos/mm3	1,830	1,674.5
	Linfocitos/mm3	910	636
Bilirubina total (mg/dL)	0.6	0.5

Esta tabla resume las características clínicas generales y de seguimiento de los pacientes incluidos en el estudio. Para cada valor de laboratorio se ha anotado el sistema de medición empleado. Los datos presentada en las columnas de “Medición” corresponden al n o las medianas (subcolumna n o mediana) y la otra subcolumna corresponde a su porcentaje o rango intercuartil

Frecuencias alélicas y genotípicas

Del total de 70 pacientes incluidos en el estudio, se obtuvo material genético con calidad y cantidad adecuadas en 68 casos (concentraciones de 10 a 129 ng/µL y un valor promedio de razón 260/280nm de 1.87; valores óptimos entre 1.8 y 2.0 ,. Para los otros dos casos, aunque la extracción de ADN se realizó en dos oportunidades adicionales, no se obtuvo material genético con las condiciones de calidad necesarias para realizar los ensayos de reacción en cadena de la polimerasa. Un total de 14 pacientes portaban un alelo de susceptibilidad: 4 para NUDT15, 4 para rs1800462 (TPMT), 6 para rs1800460 (TPMT) y 4 para rs1142345 de TPMT (Figura 2).

Figura 2

Imagen representativa de las gráficas de discriminación alélica obtenidos por los ensayos de genotipificiación. No hubo pacientes homocigotos para los alelos mutados en ninguno de los polimorfismos estudiados. Los gráficos representan los grupos de muestras con el alelo de tipo salvaje alineado hacia los ejes X o Y según la sonda utilizada para su reconocimiento. Los puntos no alineados corresponden al alelo mutado.

La Tabla 2 muestra el resumen de frecuencias alélicas y genotípicas de cada uno de los SNPs de interés. Se encontró que todas las variantes estaban en equilibrio de Hardy-Weinberg. La Tabla 3 resume la tipificación de TPMT siguiendo los estándares del “Clinical Pharmacogenetic Implementation Consortium” en los 42 pacientes en los que se logró la tipificación de los 3 SNPs . Según estos estándares, los haplotipos de TPMT fueron determinados con base a las combinaciones de los SNPs rs1800462, rs1800460 y rs1142345 así: CCT = * 1, GCT = * 2, CTC = * 3ª, CTT = * 3B and CCC = * 3C.

Tabla

Frecuencias alélicas y genotípicas de los polimorfismos de interés.

Gen		Anotación	n	Frecuencia	HW (p Value)	Latinoamérica1	Latinoamérica2
NUDT15		rs116855232	68		0.802	n= 804	n= 974
	Alelos	C	132	0.97		0.994	0.953
		T	4	0.03		0.006	0.047
	Genotipos	C/C	64	0.94
		C/T	4	0.06
		T/T	0	0
TPMT		rs1800462	68		0.802	n= 500	n= 628
	Alelos	C	132	0.970		0.992	0.997
		G	4	0.03		0.008	0.003
	Genotipos	C/C	64	0.94
		C/G	4	0.06
		G/G	0	0
		rs1800460	68		0.703	n= 1,430	n= 7,010
	Alelos	T	6	0.044		0.026	0.045
		C	130	0.956		0.974	0.955
	Genotipos	T/T	0	0
		T/C	6	0.09
		C/C	62	0.91
		rs1142345	42		0.746	n= 1,232	n= 5,254
	Alelos	C	4	0.0476		0.041	0.052
		T	80	0.9524		0.959	0.948
	Genotipos	C/C	0	0
		C/T	4	0.10
		T/T	38	0.90

Esta tabla muestra las frecuencias alélicas y genotípicas de los polimorfismos estudiados. Se encontró que todas las variantes estaban en equilibrio de Hardy-Weinberg (columna HW). Además, las frecuencias alélicas identificadas en nuestro estudio se compararon con en la población latinoamericana anotadas en el proyecto ALFA. No hubo diferencias estadísticamente significantes entre nuestras frecuencias y las reportadas en el proyecto ALFA.

Tabla 3

Tipificación de TPMT.

	Frequencias
Haplotipos	*1	78
	*2	2
	*3A	4
Tipos	*1/*1	36
	*1/*2	2
	*1/*3A	4

Se listan las frecuencias de los tipos de TPMT basadas en los estándares del “Consorcio de implementación de farmacogenética clínica”. Dado que la genotipificación de rs1142345 solo fue posible en 42 sujetos y que para realizar estas clasificaciones es necesario tener genotipificación de los 3 loci de TPMT, estos datos corresponden solo a los 42 pacientes en los que se completó la genotipificación.

Las frecuencias alélicas obtenidas en el presente estudio se compararon con las frecuencias reportadas en las bases de datos dbSNP para poblaciones latinoamericanas descritas en el proyecto ALFA (agregador de frecuencias alélicas) (Tabla 2); La base de datos de frecuencias de genotipos y fenotipos (dbGap) se desarrolló para archivar y distribuir los datos y los resultados de estudios que han investigado la interacción del genotipo y el fenotipo en humanos . Los resultados obtenidos para cada SNP analizado por nosotros, no mostraron una diferencia estadísticamente significativa de las frecuencias obtenidas en el proyecto ALFA.

Asociaciones genéticas

La Tabla 4 resume los resultados de los análisis bivariados en los que se muestra la correlación entre las variantes genéticas de los SNPs en NUDT15 y TPMT y los efectos secundarios de interés. No se encontró asociación entre los resultados de interés y la variante genética de NUDT15 o cualquier polimorfismo de TPMT evaluado individualmente. Se llevaron a cabo análisis similares en relación con la tipificación de TPMT, utilizando la variable de homocigosidad para el alelo *1 versus portador *2 o *3ª como heterocigoto, sin evidencia de ninguna asociación estadísticamente significativa (Tabla suplementaria 1S).

Tabla 4

Análisis de asociación entre genotipos y desenlaces.

Desenlaces	NUDT15			TPMT
				rs1800462			rs1800460	rs1142345
	C/C	C/T	C/C	C/G	T/C	C/C	C/T	T/T
Reducción 6-MP
Si	21	2	22	1	3	20	2	8
No	43	2	42	3	3	42	2	30
Interrupción 6-MP
Si	19	1	18	2	1	19	0	10
No	45	3	46	2	5	43	4	28
Neutropenia
Si	7	1	6	2	0	8	0	5
No	57	3	58	2	6	54	4	33
Recaída
Si	8	1	8	1	0	9	0	5
No	56	3	56	3	6	53	4	33
Muerte
Si	1	1	2	0	0	2	0	2
No	63	3	62	4	6	60	4	36

Los datos se presentan como valores de frecuencia absoluta para cada desenlace evaluado. No se encontró asociación estadísticamente significativa entre ninguno de los polimorfismos estudiados y los resultados de interés.

Tabla 1S

Análisis de asociación entre diplotipos de TPMT y desenlaces.

Desenlaces	Diplotipos TPMT		Valor p
	*1/*1	*1/otro
Reducción 6-MP
Si	8	2	0.616
No	28	4
Interrupción 6-MP
Si	10	0	0.308
No	26	6
Neutropenia
Si	5	0	1.000
No	31	6
Recaída
Si	4	1	0.557
No	32	5
Muerte
Si	2	0	1.000
No	34	6

Aunque no se identificaron asociaciones estadísticamente significativas, dos de los cuatro pacientes heterocigotos para NUDT15 requirieron una disminución en 6-MP durante el período de seguimiento. En relación con las variantes genéticas de TPMT, para rs1800462, dos de los cuatro pacientes heterocigotos presentaron neutropenia febril, y estos mismos pacientes requirieron adicionalmente la suspensión de 6-MP durante los primeros seis meses de la terapia de mantenimiento. En el caso de rs1800460, de los seis pacientes que eran heterocigotos, tres requirieron una disminución de la dosis, y de estos, dos también fueron heterocigotos para rs1142345. Además, se evaluaron las diferencias en la mediana de los valores de laboratorio tomados en los primeros 6 meses de tratamiento de mantenimiento: transaminasas, bilirrubina total, leucocitos y recuento celular diferencial; con relación a las variantes genéticas y no se encontraron diferencias estadísticamente significativas (Tabla suplementaria 2S).

Tabla 2S

Comparación del seguimiento de laboratorios en relación con los genotipos.

Seguimiento		NUDT15		TPMT
				rs1800462		rs1800460		rs1142345
		C/C	C/T	C/C	C/G	T/C	C/C	C/T	T/T
1	ALT (IU/L)	46.20	50.50	49	36	45.15	48.60	49.30	53
	AST (IU/L)	34.20	41.80	36.90	30.30	42.90	35.35	42.90	38.55
	Leucocitos/mm3	3,315	3,780	3,315	3,610	2,200	3,380	2,030	3,310
	Neutrófilos/mm3	1,820	1,995	1,820	1,737	980	1,910	1,020	1,980
	Linfocitos/mm3	783	409	780	773	630	783	600	725
	Bilirubina total (mg/dL)	0.50	0.60	0.51	0.40	0.60	0.50	0.45	0.52
2	ALT (IU/L)	45	74.50	55.40	28.80	26	46	53.15	45
	AST (IU/L)	33.55	33.70	33.55	33.15	37	32.70	42.80	38.25
	Leucocitos/mm3	3,135	2,170	3,020	3,980	2,160	3,225	2,305	3,245
	Neutrófilos/mm3	1,835	655	1,691	2,515.50	1,295	1,835	1,440	1,835
	Linfocitos/mm3	630	1,290	640	475	727	630	583.50	746.50
	Bilirubina total (mg/dL)	0.50	0.23	0.50	0.45	0.40	0.50	0.40	0.59
3	ALT (IU/L)	40	59.10	39.50	89.45	37	54	80.20	54
	AST (IU/L)	34.50	33.10	33.30	38.65	42.20	33.65	42.20	35
	Leucocitos/mm3	3,070	2,865	3,100	2,085	3,100	3,050	3,130	3,055
	Neutrófilos/mm3	1,635	1,430	1,645	1,175	1,440	1,635	2,680	1,540
	Linfocitos/mm3	734	1,010	753	470	1,030	712	875	768
	Bilirubina total (mg/dL)	0.50	0.30	0.50	0.60	0.50	0.50	0.50	0.50
4	ALT (IU/L)	52.40	18.10	52.40	33.70	41.60	52.40	138.30	63
	AST (IU/L)	31.10	32.10	31.20	36.30	47.21	31.20	89.90	30.40
	Leucocitos/mm3	3,400	3,135	3,400	2,980	2,570	3,510	2,615	3,635
	Neutrófilos/mm3	1,940	1,720	1,955	860	1,700	1,970	1,735	1,955
	Linfocitos/mm3	760	740	760	1,305	535	800	535	800
	Bilirubina total (mg/dL)	0.70	0.40	0.60	0.70	0.45	0.70	0.40	0.70
5	ALT (IU/L)	54	23.40	55	24	29.10	54	67.10	60.75
	AST (IU/L)	40.70	35.40	42.10	25.50	42.10	38.15	55.10	47.30
	Leucocitos/mm3	3,470	3,060	3,430	3,435	2,615	3,470	2,615	3,740
	Neutrófilos/mm3	1,930	1,410	1,905	1,764	1,360	1,930	1,360	1,800
	Linfocitos/mm3	845	560	830	900	793	850	845	870
	Bilirubina total (mg/dL)	0.50	0.45	0.50	0.80	0.30	0.60	0.40	0.65
6	ALT (IU/L)	68.55	38	70.30	35.45	71	66.05	71	70.10
	AST (IU/L)	41.50	30.90	43.95	31.35	53.80	40	63	44.90
	Leucocitos/mm3	3,385	2,655	3,385	3,145	3,200	3,370	2,755	3,650
	Neutrófilos/mm3	1,820	1,415	1,790	1,790	1,515	1,800	1,185	1,750
	Linfocitos/mm3	905	1,060	910	810	681	915.50	680	921
	Bilirubina total (mg/dL)	0.60	0.50	0.60	0.71	0.56	0.60	0.38	0.60

Discusión

En nuestro conocimiento, este es el primer estudio en el país, que ha evaluado los polimorfismos de los genes NUDT15 y TPMT y su correlación con los efectos secundarios de la quimioterapia en pacientes pediátricos con leucemia linfoblástica aguda. Aunque nuestra población es considerada como población Latina, diferentes grados de ancestrías Caucásica, Amerindia y Africana han sido descritos en diferentes regiones de Colombia. Nuestros hallazgos varían significativamente de informes anteriores con respecto a la asociación entre variantes y resultados ,,,; sin embargo, estos estudios han sido realizados principalmente en poblaciones con poca representatividad latina.

La frecuencia alélica de la mutación NUDT15 identificada en nuestro estudio (0.03) fue menor que la informada anteriormente ,,,, una posible explicación para este hallazgo es que la mayoría de los estudios sobre este polimorfismo han sido realizados en poblaciones de origen asiático, encontrando frecuencias alélicas de hasta 0.27. La muestra evaluada en este estudio, es originada en la recion andina central de Colombia, en la que el componente caucásico (ancestría Europea) representa entre el 50 y 60% de la ancestría genética . Otra posible razón puede ser nuestro tamaño de muestra ,. Para el caso particular de los polimorfismos en TPMT, previamente solo se ha realizado un estudio en la población colombiana, en el que Isaza y col. (, describieron frecuencias para el alelo *2 y *3A de 0.004 y 0.035, respectivamente, las cuales son inferiores a las identificadas por nosotros (0.02 y 0.05, respectivamente). En comparación con otros resultados latinoamericanos, encontramos que nuestras frecuencias también son ligeramente diferentes a las descritas por Garrido y col. en pacientes pediátricos con leucemia linfoblástica aguda en Guatemala, identificaron una frecuencia de 0.005 para *2 y 0.0375 para *3A . Sin embargo, nuestra frecuencia de *2 es similar a la encontrada en Brasil por Boson y col., Quienes describen una frecuencia de 0.022 pero una frecuencia mucho menor para *3A (0.015) . Más recientemente, en pacientes pediátricos uruguayos con LLA se ha descrito una frecuencia de *3A de 0.05, similar a la nuestra, pero con una frecuencia menor de *2 (.

Cada vez hay más evidencia que destaca el papel de las variantes genéticas de NUDT15 en el desarrollo de efectos secundarios de la toxicidad del 6-MP (,,,. Sin embargo, al evaluar las posibles asociaciones en nuestra población de estudio, no pudimos identificar ninguna asociación con significación estadística, posiblemente debido al tamaño de la muestra. En relación con TPMT, existe evidencia que respalda su papel tanto en la farmacocinética como en los efectos tóxicos de la mercaptopurina (,. En nuestro estudio no encontramos asociación entre las frecuencias alélicas de cada polimorfismo ni en esos 42 casos en los que tuvimos la tipificación completa de TPMT. Entre las posibles razones que explicarían esto podría estar, para el caso de NUDT15, que los estudios originales que describen tales asociaciones se basaron en enfoques GWAS , en el que la representación de la población latina fue baja, y esto puede deberse a un efecto relacionado con la ascendencia específica de la población colombiana . Por otro lado, en el caso de TPMT, una explicación podría ser que los alelos encontrados en nuestra población (*2 y *3A) corresponden a metabolizadores intermedios, que no suelen requerir muchos ajustes en la terapia .

En análisis exploratorios se evaluó si existía asociación entre las variantes genéticas estudiadas y los desenlaces: recaídas o muerte, revisados a octubre de 2018, sin mostrar correlación alguna, lo cual es consistente con lo descrito por Lennard y col., quienes, después de genotipificar TPMT en 2,387 pacientes con leucemia linfoblástica aguda, no identificaron asociaciones con la supervivencia libre de eventos. Dentro de las limitaciones del presente estudio, se encuentran el tamaño de la muestra y el sesgo de selección, por tratarse de una muestra cautiva. Sin embargo, los pacientes fueron incluidos de forma prospectiva y consecutiva, lo que permitió un mejor seguimiento de la evolución de los eventos adversos de interés. Por otro lado, una gran fortaleza del presente estudio es el abordaje traslacional, basado en observaciones clínicas previas y la evaluación de aspectos biomédicos básicos que podrían dar respuesta a la búsqueda de factores predictivos para el desarrollo de toxicidad en el tratamiento de pacientes pediátrico con enfermedades oncológicas.

Conclusiones

En resumen, las frecuencias alélicas de las variantes de interés fueron diferentes a las descritas anteriormente, incluso al compararlas con estudios latinoamericanos. No encontramos asociación estadística con eventos de toxicidad para ninguno de los polimorfismos estudiados. Estos hallazgos destacan la necesidad de realizar estudios futuros con una mayor muestra de pacientes; ya sea a través de un estudio multicéntrico con pacientes pediátricos con LLA o incluyendo otras poblaciones pediátricas que reciben manejo con tiopurinas, tales como: pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal o artritis idiopática juvenil, que nos permitan tener un adecuado tamaño de muestra a partir del cual identificar mejores inferencias de asociaciones con desenlaces de toxicidad. Además, estos hallazgos plantean la posibilidad de que otros genes puedan estar influyendo en la toxicidad y los efectos secundarios y por otro lado examinar el efecto que la ascendencia podría tener en estas interacciones en poblaciones con una mezcla ancestral diversa como nuestra población.

1) Why was this study conducted?

Several studies carried out mainly in the United States and Asia have shown associations between the variants of the TPMT and NUDT15 genes with the toxicity outcomes in patients with acute lymphoid leukemia, the information referring to this topic is scarce in our country, so we decided to evaluate this association in our population which represents a sample with genetic admixture and in whom pharmacogenetic differences related to ancestry have been described.

2) What were the most relevant results of the study?

No statistically significant associations were identified between genetic variants in TPMT and NUDT15 with toxicity outcomes evaluated (myelotoxicity and liver toxicity, as well as the dose reduction or interruption of 6-MP).

3) What do these results contribute?

Our results point to the need to carry out national studies aimed at the search for “autochthonous biomarkers” that allow the identification of pediatric cancer patients who present a higher risk of developing toxicity outcomes during their treatments.

1) ¿Por qué se realizó este estudio?

Diversos estudios realizados principalmente en Estados Unidos y Asia han mostrado asociaciones entre las variantes de los genes TPMT y NUDT15 con los resultados de toxicidad en pacientes con leucemia linfoide aguda, la información referente a este tema es escasa en nuestro país, por lo que decidimos evaluar esta asociación en nuestra población la cual representa una muestra con mezcla genética y en la que se han descrito diferencias farmacogenéticas relacionadas con la ancestría.

2) ¿Cuáles fueron los resultados más relevantes del estudio?

No se identificaron asociaciones estadísticamente significativas entre las variantes genéticas en TPMT y NUDT15 con los resultados de toxicidad evaluados (mielotoxicidad y toxicidad hepática, así como la reducción o interrupción de la dosis de 6-MP).

3) ¿Qué aportan estos resultados?

Nuestros resultados apuntan a la necesidad de realizar estudios nacionales dirigidos a la búsqueda de “biomarcadores autóctonos” que permitan identificar a los pacientes pediátricos oncológicos que presentan mayor riesgo de desarrollar resultados de toxicidad durante sus tratamientos de quimioterapia.