Screening for Familial Hypercholesterolemia in Small Towns: Experience from 11 Brazilian Towns in the Hipercolbrasil Program.

BACKGROUND: Familial hypercholesterolemia (FH) is a genetic disease characterized by elevated serum levels of low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C), and it is associated with the occurrence of early cardiovascular disease. In Brazil, HipercolBrasil, which is currently the largest FH cascade screening program, has already identified more than 2000 individuals with causal genetic variants for FH. The standard approach is based on cascade screening of referred index cases, individuals with hypercholesterolemia and clinical suspicion of FH.
OBJECTIVES: To perform targeted screening of 11 small Brazilian cities with a suspected high prevalence of people with FH.
METHODS: The selection of cities occurred in 3 ways: 1) cities in which a founder effect was suspected (4 cities); 2) cities in a region with high rates of early myocardial infarction as described by the National Health System database (2 cities); and 3) cities that are geographically close to other cities with a high prevalence of individuals with FH (5 cities). Statistical significance was considered as p value < 0.05.
RESULTS: One hundred and five index cases and 409 first-degree relatives were enrolled. The yield of such approach of 4.67 relatives per index case was significantly better (p < 0.0001) than the general HipercolBrasil rate (1.59). We identified 36 IC with a pathogenic or likely pathogenic variant for FH and 240 affected first-degree relatives.
CONCLUSION: Our data suggest that, once detected, specific geographical regions warrant a target approach for identification of clusters of individuals with FH.

Introdução

Hipercolesterolemia familiar (HF) é uma doença autossômica dominante que se caracteriza clinicamente por níveis sanguíneos elevados de colesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL-C), e está associada à ocorrência de doença cardiovascular aterosclerótica (DCVA) precoce.[1,2]

A prevalência da HF no mundo é estimada em aproximadamente 1:250 na forma heterozigótica e 1:600.000 na forma homozigótica.[3] Um estudo realizado pela coorte ELSA-Brasil estimou que a prevalência de indivíduos com os critérios clínicos para a HF no Brasil seria de 1:263. Considerando essas estimativas, haveria aproximadamente 760.000 pessoas com HF no Brasil.[4]

Porém, embora seja relativamente frequente, a forma heterozigótica ainda é uma doença subdiagnosticada.[5] Para auxiliar na identificação de indivíduos com essa doença, tem sido utilizado o rastreamento genético em cascata em vários países, como a Holanda,[6] o Reino Unido[7] e a Espanha.[8] Este método já foi reconhecido como sendo de custo efetivo para a identificação e a prevenção de DCVA precoce em indivíduos com a HF.[9,10]

No Brasil, o HipercolBrasil, que é atualmente o maior programa de rastreamento genético em cascata, existe desde 2012[11] e já identificou mais de 2.000 indivíduos com variantes genéticas causadoras de HF. O programa atualmente realiza testes genéticos em qualquer indivíduo com LDL-C ≥ 230 mg/dL (caso índice [CI])[12] e nos familiares de primeiro grau daquelas com variantes patogênicas ou provavelmente patogênicas.

Entre julho de 2017 e julho de 2019, testamos uma nova metodologia para identificar novos indivíduos com mutações genéticas para HF, direcionada a pequenos municípios com prevalência potencialmente alta de HF.

O presente estudo descreve os primeiros resultados de triagem direcionada em 11 pequenos municípios brasileiros (até 60.000 habitantes) com suspeita de alta prevalência de pessoas com HF.

Métodos

O estudo foi realizado no Laboratório de Genética e Cardiologia Molecular do Instituto do Coração (InCor) da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, Brasil. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética Institucional (CAPPesq protocolo l00594212.0.1001.0068).

Amostra do estudo

A Figura 1 mostra os critérios de inclusão e o desenho do estudo. Cadastramos indivíduos de 11 municípios selecionados com até 60.000 habitantes em todo o território brasileiro. A seleção dos municípios ocorreu de 3 maneiras: 1) municípios em que houve suspeita de efeito fundador, ou seja, ocorrência de indivíduos homozigotos, mas sem histórico de qualquer grau de parentesco entre os pais (Major Vieira, Papanduva, Lagoa do Mato e Passagem Franca); 2) municípios em uma região com altas taxas de dislipidemia, conforme relatado por médicos locais (Bom Despacho e Moema);[13] e 3) municípios geograficamente próximos a outros municípios com alta prevalência de indivíduos com HF (Bambuí, Pimenta, Luz, Colinas e Buriti Bravo).

Figura 1

– Metodologia para selecionar municípios, identificar CIs e familiares e treinar profissionais de saúde para continuar o rastreamento genético em cascata.

Registro de casos índices e familiares

Em todos os municípios, foi feito um contato inicial com a secretaria saúde local de para explicar o projeto e estabelecer um acordo sobre a parceria. Foi feito contato por telefone antes de visitar cada município e realizado um acordo entre ambas as partes por e-mail. Já no município, a equipe foi atendida por um agente de saúde indicado pela secretaria de saúde. Nos municípios onde havia evidências de efeito fundador e naquelas onde havia relato de alta incidência de dislipidemia, a coleta de amostras começou com familiares de CIs previamente selecionados. Nesses municípios, também ocorreu uma busca ativa para novos CIs a partir de prontuários e exames de colesterol realizados nos laboratórios de análise clínica das unidades de saúde locais. Indivíduos foram considerados CIs quando apresentavam colesterol total > 300 mg/dL e/ou LDL-C ≥ 210 mg/dL com triglicerídeos < 300 mg/dL. Nestes casos, foi coletada uma amostra de sangue para realização de uma segunda dosagem do colesterol em nosso laboratório. Aqueles com LDL-C confirmado ≥ 210 mg/dL na segunda dosagem foram selecionados para o sequenciamento genético, enquanto os indivíduos que não atingiram este valor receberam laudo com os valores de colesterol total e as frações e foram excluídos do estudo.

Sequenciamento genético e rastreamento em cascata

Foram coletadas as amostras de sangue (10 ml de sangue periférico em tubos de EDTA) e enviadas ao Laboratório de Genética e Cardiologia Molecular do InCor/HCFMUSP para análise genética. Foi extraído o DNA genômico usando QIAamp DNA MiniKit (QIAGEN), seguindo as instruções do fabricante. Os CIs foram sequenciados por sequenciamento de próxima geração em um painel de genes incluindo os seguintes genes relacionados à dislipidemia: LDLR, APOB, PCSK9, LDLRAP1, STAP1, LIPA, APOE, ABCG5 e ABCG8. Foram realizadas as análises bioinformáticas em Varstation e CLC Genomic Workbench 9.0 (QIAGEN). A amplificação multiplex de sondas dependente de ligação (MLPA) em LDLR foi usada para rastrear variantes de número de cópias dos CIs sem qualquer tipo de variantes do tipo missense, nonsense ou frameshift identificadas no sequenciamento de próxima geração. Foi realizado o rastreamento de familiares com sequenciamento Sanger (para mutações pontuais ou pequenos indels) ou MLPA (para variantes de número de cópias). As variantes foram classificadas de acordo com as recomendações do American College of Medical Genetics and Genomics.[14]

Análise de dados

A análise visual da distribuição das variáveis foi realizada por meio de histogramas e foi verificada a normalidade dos dados. Para variáveis contínuas com distribuição normal, foram calculados a média e o desvio padrão. As variáveis categóricas são mostradas como frequências. As diferenças entre as frequências foram comparadas pelo teste de qui-quadrado. Foram comparadas as diferenças entre as médias com o teste t de Student não pareado ou ANOVA unilateral, se necessário. As variáveis testadas apresentaram distribuição normal e optamos pelo teste paramétrico. A significância estatística foi considerada como valor p < 0,05. As análises estatísticas foram realizadas com SPSS v19.0 (IBM).

Resultados

Inicialmente, coletamos 230 CIs com pelo menos uma medida de colesterol que atendia aos critérios propostos (veja os Métodos). Porém, 125 deles apresentaram valores de LDL-C abaixo do ponto de corte após a segunda medição e não foi realizado sequenciamento posterior. No total, foram incluídos 105 ICs e 490 familiares na análise. A Tabela 1 mostra as características dos 11 municípios visitados, estado da federação brasileira, número de habitantes e data de cada visita. O município com o menor número de habitantes totais foi Moema com 7.028 e a maior foi Bom Despacho com 45.624, ambas no estado de Minas Gerais. Os primeiros municípios a serem visitados foram Major Vieira e Papanduva (setembro de 2017) e as últimas foram Buriti Bravo e Colinas (fevereiro de 2019).

Tabela 1

– Características gerais dos municípios da amostra

Município	Estado do Brasil	Habitantes totais (Censo do IBGE)	Data da visita	Número de casos esperados (1:263)4	Número de casos positivos identificados
Bambuí	Minas Gerais	22.709	Dez 2018	86	2
Bom Despacho	Minas Gerais	45.624	Ago 2018	173	45
Buriti Bravo	Maranhão	23.827	Fev 2019	91	0
Colinas	Maranhão	42.196	Fev 2019	160	4
Lagoa do Mato	Maranhão	10.955	Abr 2018	42	32
Luz	Minas Gerais	17.492	Dez 2018	67	6
Major Vieira	Santa Catarina	8.103	Set 2017	31	47
Moema	Minas Gerais	7.028	Ago 2018	27	36
Papanduva	Santa Catarina	18.013	Set 2017	68	48
Passagem Franca	Maranhão	17.296	Abr 2018	66	50
Pimenta	Minas Gerais	8.236	Dez 2018	31	6

IBGE: Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística.

A Tabela 2 mostra o número de CIs e familiares sequenciados por região e seu genótipo em relação à presença de variantes patogênicas ou provavelmente patogênicas (positivos), sem variantes patogênicas (negativos) ou presença de uma variante de significado incerto (VSI), bem como o número de novos casos derivados de cada CI incluído.

Tabela 2

– CIs e familiares incluídos por região e seus genótipos para a presença de variantes genéticas de HF

Origem	CIs			Familiares			Número de familiares por CIs identificados	Número de indivíduos genotipados por município
	Negativo	Positivo	VSI	Negativo	Positivo	VSI
Bambuí	0	1	0	0	1	0	1	2
Bom Despacho	15	11	2	34	31	3	2,4	96
Buriti Bravo	4	0	0	0	0	0	0	4
Colinas	6	1	1	1	3	0	0,5	12
Lagoa do Mato	3	2	0	25	30	0	11	60
Luz	21	4	1	0	2	0	0,08	28
Major Vieira	1	3	0	48	44	0	23	96
Moema	1	4	0	36	32	0	13,6	73
Papanduva	4	2	1	50	46	0	13,7	103
Passagem Franca	3	5	0	55	45	0	12,5	108
Pimenta	6	2	1	0	4	0	0,4	13
Total	64	35	6	249	238	3	4,7	595

CI: caso índice; VSI: variante de significado incerto; HF: Hipercolesterolemia familiar.

A Tabela 3 mostra os três grupos de CIs (negativo, positivo ou VSI) e seus dados clínicos e bioquímicos. No total, foram sequenciados 105 CIs, sendo encontradas variantes patogênicas ou provavelmente patogênicas em 36 (37,8%) indivíduos e VSI em 5 (5,25%). A maioria dos CIs era do sexo feminino (67,6%) e quando as características clínicas e bioquímicas foram avaliadas entre os três grupos, houve, como esperado, uma diferença estatisticamente significativa em relação ao colesterol total e LDL-C basais (não tratados), com o grupo positivo apresentando os maiores valores de colesterol total e LDL-C, 382 ± 150 mg/dL e 287 ± 148 mg/dL, respectivamente. A Tabela 4 mostra as características clínicas e bioquímicas dos familiares.

Tabela 3

– Características clínicas e bioquímicas de CIs negativos, positivos e alterados por VSI

	CI negativo	(64)	CI positivo	(36)	CI com VSI	(5)	valor p
Mulheres %	45 (70,3)	64	21 (58,3)	36	5 (100)	5	0,134
Homens %	19 (29,7)	64	15 (41,7)	36	-	5
Idade (anos)	54±15	64	44±19	36	56±16	5	0,015
Uso de drogas hipolipemiantes	32 (50,0)	64	24 (66,7)	36	3 (60,0)	5	0,261
DAC precoce	2 (3,1)	64	4 (11,1)	36	-	5	0,297
Xantomas	3 (4,7)	64	3 (8,3)	36	1 (20,0)	5	0,365
Xantelasmas	4 (6,3)	64	1 (2,8)	36	-	5	0,696
Arco córneo	2 (3,1)	64	3 (8,3)	36	-	5	0,345
CT atual	279±65	62	316±107	36	302±28	5	0,102
LDL-C atual	195±56	64	234±104	36	207±35	5	0,051
CT basal	322±33	60	382±150	32	305±43	5	0,008
LDL-C basal	233±24	59	287±148	34	229±20	4	0,022

CI: caso índice; CT: colesterol total; DAC: doença arterial coronariana; LDL-C: colesterol de lipoproteína de baixa densidade; VSI: variante de significado incerto. DAC precoce definido como evento de doença cardiovascular aterosclerótica < 55 e 60 anos de idade em homens e mulheres, respectivamente; lipídios em mg/dL; lipídios basais = não tratados.

Tabela 4

– Características clínicas e bioquímicas dos familiares positivos e negativos

	Familiares negativos	N (249)	Familiares positivos	N (240)	valor p
Mulheres %	136 (54,6)	249	135 (56,3)	240	0,504
Homens %	113 (45,4)	249	105 (43,8)	240
Idade (anos)	40±21	249	38±21	240	0,710
Uso de drogas hipolipemiantes	31 (12,4)	249	93 (38,8)	240	0,001
DAC precoce	2 (0,8)	249	9 (3,8)	240	0,034
Xantomas	6 (2,4)	249	17 (7,1)	240	0,013
Xantelasmas	11 (4,4)	249	34 (14,2)	240	0,001
Arco córneo	1 (0,4)	249	9 (3,8)	240	0,009
CT atual	198±51	114	309±86	127	0,001
LDL-C atual	124±42	192	233±75	198	0,001
CT basal	220±191	97	318±97	130	0,001
LDL-C basal	126±41	169	243±82	178	0,001

DAC: doença arterial coronariana; LDL-C: colesterol de lipoproteína de baixa densidade; CT: colesterol total. DAC precoce definido como evento de doença cardiovascular aterosclerótica < 55 e 60 anos de idade em homens e mulheres, respectivamente; lipídios em mg/dL; lipídios basais = não tratados.

A Figura 2 mostra a distribuição geográfica dos 11 municípios localizados em 3 estados da federação brasileira, o número de casos registrados, o número de indivíduos genotipados e o número de indivíduos com uma variante patogênica.

Figura 2

– Distribuição geográfica dos casos, número de indivíduos genotipados e número de indivíduos com variante patogênica identificada (positivos).

Estados brasileiros, de cima para baixo: Maranhão, Minas Gerais e Santa Catarina

A Tabela 5 mostra todas as variantes encontradas e o local onde foram identificadas. No total, foram identificadas 21 variantes diferentes, com 3 variantes aparecendo com mais frequência. As frequências observadas para essas 3 variantes sugerem que elas têm efeitos fundadores nessas localidades. Foram encontrados 6 pacientes homozigotos e 1 heterozigoto composto em trans.

Tabela 5

– Variantes patogênicas, provavelmente patogênica e VSI de HF encontradas por município

Gene	Variante	Classificação da variantes	Bambuí	Bom Despacho	Luz	Pimenta	Moema	Buriti Bravo	Colinas	Lagoa do Mato	Passagem Franca	Major Vieira	Papanduva	Total
LDLR	Duplicação do exon 4 para 8 (b)	Patogênica	0	0	0	0	0	0	0	0	0	45b	41	86
LDLR	Duplicação do promoter para o exon 6	Patogênica	0	0	0	0	0	1	4	29	49a	0	0	83
LDLR	p.Asp224Asn	Patogênica	0	39	4	0	34	0	0	0	0	0	0	77
LDLR	p.Cys222*	Patogênica	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	5	5
LDLR	c.1359-1G >C	Patogênica	0	0	0	5	0	0	0	0	0	0	0	5
LDLR	p.Gly592Glu	Patogênica	0	0	0	0	0	0	0	0	0	2	0	2
LDLR	p.Ala771Val	Patogênica	0	0	1	0	0	0	0	0	0	0	0	1
LDLR	p.Pro699Leu	Patogênica	0	0	1	0	0	0	0	0	0	0	0	1
LDLR	p.Asp601His	Provavelmente patogênica	2	0	0	0	2	0	0	0	0	0	0	4
LDLR	p.Cys34Arg	Provavelmente patogênica	0	1	0	0	0	0	0	0	0	0	0	1
LDLR	p.Arg257Trp	Provavelmente patogênica	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	1	1
LDLR	p.Ser854Gly	Provavelmente patogênica	0	2	0	0	0	0	0	0	0	0	0	2
LDLR	c.-228G>C	VSI	0	0	0	0	0	0	1	0	0	0	0	1
LDLR	p.Ala30Gly	VSI	0	0	0	1	0	0	0	0	0	0	0	1
APOB	p.Ala2790Thr	VSI	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	1	1
APOB	p.Met499Val	VSI	0	1	0	0	0	0	0	0	0	0	0	1
PCSK9	p.Arg237Trp	VSI	0	4	0	0	0	0	0	0	0	0	0	4
PCSK9	p.Arg357Cys	VSI	0	0	1	0	0	0	0	0	0	0	0	1
STAP1	p.Pro176Ser	VSI	0	0	0	1	0	0	0	0	0	0	0	1
LDLR	p.Cys222*	Patogênica	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	1c	1c
LDLR	Duplicação do exon 4 para 8	Patogênica
PCSK9	p.Arg215Cys	Provavelmente patogênica	0	0	0	0	0	0	0	1	0	0	0	1c
APOB	p.Asp2213Asn	VSI
APOB	p.Val3290Ile	VSI
PCSK9	p.Arg215Cys	Provavelmente patogênica	0	0	0	0	0	0	0	1	0	0	0	1c
APOB	p.Val3293lle	VSI
PCSK9	p.Arg215Cys	Provavelmente patogênica	0	0	0	0	0	0	0	1	0	0	0	1c
APOB	p.Asp2213Asn	VSI

2 homozigotas (b) 4 homozigotas (c) heterozigota composta em trans. VSI: variante de significado incerto; HF: Hipercolesterolemia familiar.

Discussão

O presente estudo descreve os resultados da implementação de um sistema de rastreamento em cascata para HF em 11 pequenos municípios brasileiros.

Apesar dos benefícios de custo conhecidos do rastreamento em cascata para HF, a implementação mundial tem sido abaixo do ideal. Diversas barreiras locais e obstáculos à implementação devem ser identificados e superados. A implementação do rastreamento em cascata em pequenas localidades, por exemplo, tem sido maiormente desconsiderado. Esse desafio é maior em países de dimensões continentais, como o Brasil, onde, além das enormes distâncias geográficas, existem desigualdades no acesso aos serviços de saúde. Descrevemos a experiência do HipercolBrasil que realizou rastreamento em cascata abrangente em pequenos municípios brasileiros. Neste novo modelo, o rastreamento genético em cascata foi realizado em municípios que apresentavam evidências de maior prevalência de HF devido ao achado prévio de indivíduos com o fenótipo homozigoto no mesmo município, ou porque essas regiões relataram elevada frequência de infarto do miocárdio.

Os municípios que apresentaram evidências de efeito fundador foram os que apresentaram maior identificação de indivíduos afetados por cada CI analisado (em ordem decrescente Major Vieira, Papanduva, Lagoa do Mato e Passagem Franca). Nestas cidades, começamos com indivíduos homozigotos cujos pais não tinham parentesco e nasceram em regiões geográficas diferentes. Obviamente, sempre que essa situação for sinalizada por um programa de rastreamento em cascata, ela merece a implantação de uma abordagem que abranja todo o município, pois os custos-benefícios deste cenário são os mais vantajosos. A implementação da cascata genética em municípios de pequeno porte mostrou-se mais eficiente quando comparada à cascata genética realizada pelo HipercolBrasil[11] considerando que as taxas de familiares por CI foram de 4,7 e 1,6, respectivamente (p < 0,0001).

É importante notar que a taxa de familiares testados por CI também foi maior em municípios com suspeita de efeito fundador. Isso provavelmente ocorreu porque esses municípios possuíam um número pequeno de habitantes e a maioria dos familiares tinha algum grau de relação familiar. Isso não ocorreu em Bom Despacho, que é um município consideravelmente maior que os demais (45.624 habitantes) e, embora o número de familiares coletados tenha sido semelhante ao de outras cidades, houve maior número de CIs coletados (28), diminuindo a taxa de parentes/CI para 2,4. Essa situação exemplifica o equilíbrio tênue entre o tamanho do município e o sucesso da abordagem descrita.

Os municípios visitados que eram geograficamente próximos a municípios com suspeita de efeito fundador (Bambuí, Buriti Bravo, Colinas, Pimenta e Luz) apresentaram baixa captação de CIs e, consequentemente, baixo número de familiares identificados. Isso sugere que a concentração de esforços no município selecionado, ao invés de estender a abordagem para cidades próximas, deve ser priorizada e a captura de casos potenciais próximos deve ser deixada para o mecanismo usual de rastreamento em cascata.

Conclusão

Rastreamento em cascata em pequenos municípios (menos de 60.000 habitantes) com efeito fundador mostrou-se eficaz. Porém, alguns pontos podem ser de grande importância para que o rastreamento em cascata seja eficaz, podendo ser considerados os seguintes antes de decidir quais cidades rastrear: estabelecimento de uma parceria formal e interesse explícito por parte do departamento de saúde local em receber o programa e realizar o rastreamento em cascata; disponibilidade de conjuntos de dados laboratoriais de análises clínicas para a realização de levantamento retrospectivo dos testes de colesterol; e divulgação via rádios e redes sociais sobre a doença e o programa para maior adesão dos moradores.

O presente estudo é limitado pelo número relativo de municípios avaliados considerando o tamanho continental do Brasil. No entanto, sugere que a abordagem desenhada pode ser útil para detectar indivíduos com HF. Em conclusão, nossos dados sugerem que, uma vez detectadas, regiões geográficas específicas justificam uma abordagem direcionada para a identificação de aglomerações de indivíduos com HF.

Introduction

Familial hypercholesterolemia (FH) is an autosomal dominant disease that is clinically characterized by elevated blood levels of low density lipoprotein cholesterol (LDL-C), and it is associated with the occurrence of early atherosclerotic cardiovascular disease (ASCVD).[1,2]

The prevalence of FH in the world is estimated to be approximately 1:250 in the heterozygous form and 1:600,000 in the homozygous form..A study conducted by the ELSA-Brasil cohort estimated that the prevalence of individuals with clinical criteria for FH in Brazil is 1:263. Considering these estimates, there would be approximately 760,000 people with FH in Brazil.[4]

However, although relatively frequent, the heterozygous form is still an underdiagnosed disease.[5] To assist in the identification of individuals with this disease, cascade genetic screening has been used in several countries, such as the Netherlands,[6] the United Kingdom,[7] and Spain.[8] This method has already been recognized as cost-effective for identification as well as prevention of early ASCVD in individuals with FH.[9,10]

In Brazil, HipercolBrasil, which is currently the largest cascade screening program, has existed since 2012,[11] and it has already identified more than 2000 individuals with causal genetic variants for FH. The program currently performs genetic testing on any individual with LDL-C ≥ 230mg/dL (index-case [IC])[12] and in first-degree relatives of those with pathogenic or likely pathogenic variants.

Between July 2017 and July 2019 we tested a new methodology for identifying new individuals with genetic alterations for FH based on the targeting of small municipalities with potentially high FH prevalence.

Here we describe the first results of targeted screening in 11 small Brazilian cities (up to 60,000 inhabitants) with a suspected high prevalence of people with FH.

Methods

The study was conducted at the Genetics and Molecular Cardiology Laboratory of the Heart Institute (InCor), University of São Paulo Medical School, São Paulo, Brazil. The protocol received approval from the Institutional Ethics Committee (CAPPesq protocol l00594212.0.1001.0068).

Study sample

Figure 1 shows inclusion criteria and study design. We enrolled individuals from 11 selected cities with up to 60,000 inhabitants throughout the Brazilian territory. The selection of cities occurred in 3 ways: 1) cities in which a founder effect was suspected, i.e. occurrence of homozygous individuals, but with no history of any degree of relation between parents (Major Vieira, Papanduva, Lagoa do Mato, and Passagem Franca); 2) cities in a region with high rates of dyslipidemia as reported by local physicians (Bom Despacho and Moema);[13] and 3) cities that are geographically close to other cities with a high prevalence of individuals with FH (Bambuí, Pimenta, Luz, Colinas, and Buriti Bravo).

Figure 1

– Methodology for selecting cities, capturing ICs and relatives and training health care professionals to continue cascade genetic screening.

Enrolment of index cases and relatives

In all cities, initial contact was made with the local secretary of health to explain the project and establish an agreement on the partnership. Contact was made via telephone before visiting each city, and an agreement was established by both parties via e-mail. Once in the city, the team was assisted by a health agent appointed by the health secretary. In the cities where there was evidence of a founder effect and in the ones where there were reports of high incidence of dyslipidemia, the sample collection started from family members of previously selected ICs. In these cities, there was also an active search for new ICs from medical records and cholesterol tests carried out in the clinical analysis laboratories of the local healthcare units. Individuals were considered as ICs when they had total cholesterol > 300 mg/dL and/or LDL-C ≥ 210 mg/dL with triglycerides < 300 mg/dL. In these cases, a blood sample was collected to perform a second cholesterol measurement in our laboratory. Those with a confirmed LDL-C ≥ 210 mg/dl in the second measurement were selected for genetic sequencing, while individuals who did not reach this value received a report with the values of total cholesterol and fractions and were excluded from the study.

Genetic sequencing and cascade screening

Blood samples were collected (10 ml of peripheral blood in EDTA tubes) and sent to the Genetics and Molecular Cardiology Laboratory at InCor/HCFMUSP for genetic analysis. Genomic DNA was extracted using QIAamp DNA MiniKit (QIAGEN), following the manufacturer’s instructions. IC were sequenced by next generation sequencing in a gene panel comprising the following dyslipidemia-related genes: LDLR, APOB, PCSK9, LDLRAP1, STAP1, LIPA, APOE, ABCG5, and ABCG8. Bioinformatics analyses were performed in Varstation and CLC Genomic Workbench 9.0 (QIAGEN). Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) in LDLR was used to screen for copy-number variants in ICs without any missense, nonsense or frameshift variants identified in next generation sequencing. The screening of relatives was performed with Sanger sequencing (for point mutations or small indels) or MLPA (for copy-number variants). Variants were classified following the recommendations of the American College of Medical Genetics and Genomics.[14]

Data analysis

The visual analysis of variable distribution was performed using histograms, and the normality of the data was verified. For continuous variables with normal distribution, the mean and standard deviation were calculated. Categorical variables are shown as frequencies. The differences between frequencies were compared using the chi-square test. The differences between means were compared with unpaired Student’s t test or one-way ANOVA, if necessary. The tested variables were normally distributed, and we opted for a parametric test. Statistical significance was considered as p value < 0.05. Statistical analyses were performed with SPSS v19.0 (IBM).

Results

Initially, we collected 230 ICs with at least one cholesterol measure that met the proposed criteria (see Methods). However, 125 of them presented LDL-C values below the threshold after the second measurement and were not further sequenced. In total, 105 ICs and 490 relatives were included in the analysis. Table 1 shows characteristics of the 11 visited cities, Brazilian state, number of inhabitants, and date of each visit. The city with the lowest number of total inhabitants was Moema with 7,028, and the largest was Bom Despacho with 45,624 inhabitants, both in the state of Minas Gerais. The first cities to be visited were Major Vieira and Papanduva (September 2017) and the last were Buriti Bravo and Colinas (February 2019).

Table 1

– Overall characteristics of sampled municipalities

City	Brazilian state	Total inhabitants (IBGE Census)	Visit date	N of expected cases (1:263)4	N of positive cases identified
Bambuí	Minas Gerais	22,709	Dec 2018	86	2
Bom Despacho	Minas Gerais	45,624	Aug 2018	173	45
Buriti Bravo	Maranhão	23,827	Feb 2019	91	0
Colinas	Maranhão	42,196	Feb 2019	160	4
Lagoa do Mato	Maranhão	10,955	Apr 2018	42	32
Luz	Minas Gerais	17,492	Dec 2018	67	6
Major Vieira	Santa Catarina	8,103	Sep 2017	31	47
Moema	Minas Gerais	7,028	Aug 2018	27	36
Papanduva	Santa Catarina	18,013	Sep 2017	68	48
Passagem Franca	Maranhão	17,296	Apr 2018	66	50
Pimenta	Minas Gerais	8,236	Dec 2018	31	6

IBGE: Brazilian Institute of Geography and Statistics.

Table 2 shows the number of sequenced ICs and relatives per region and their genotype regarding the presence of pathogenic or likely pathogenic variants (positive), no pathogenic variants (negative) or presence of a variant of uncertain significance (VUS), as well as the number of new cases derived from each enrolled IC.

Table 2

– ICs and relatives collected per region and their genotypes for the presence of FH genetic variants

Origin	ICs			Relatives			Number of relatives per identified ICs	Number of genotyped individuals per city
	Negative	Positive	VUS	Negative	Positive	VUS
Bambuí	0	1	0	0	1	0	1	2
Bom Despacho	15	11	2	34	31	3	2.4	96
Buriti Bravo	4	0	0	0	0	0	0	4
Colinas	6	1	1	1	3	0	0.5	12
Lagoa do Mato	3	2	0	25	30	0	11	60
Luz	21	4	1	0	2	0	0.08	28
Major Vieira	1	3	0	48	44	0	23	96
Moema	1	4	0	36	32	0	13.6	73
Papanduva	4	2	1	50	46	0	13.7	103
Passagem Franca	3	5	0	55	45	0	12.5	108
Pimenta	6	2	1	0	4	0	0.4	13
Total	64	35	6	249	238	3	4.7	595

IC: index case; VUS: variant of uncertain significance; FH: Familial hypercholesterolemia.

Table 3 shows the three IC groups (negative, positive, or VUS) and their clinical and biochemical data. In total, 105 ICs were sequenced, and pathogenic or likely pathogenic variants were found in 36 (37.8%) individuals, and VUS in 5 (5.25%). Most ICs were female (67.6%), and when the clinical and biochemical characteristics were evaluated among the three groups, there was, as expected, a statistically significant difference regarding baseline (untreated) total cholesterol and LDL-C, with the positive group presenting the highest values of total cholesterol and LDL-C, 382 ± 150 mg/dL and 287 ± 148 mg/dL, respectively. Table 4 shows the clinical and biochemical characteristics of relatives.

Table 3

– Clinical and biochemical characteristics of negative, positive, and VUS-altered ICs

	Negative IC	(64)	Positive IC	(36)	IC VUS	(5)	p value
Females %	45 (70.3)	64	21 (58.3)	36	5 (100)	5	0.134
Males %	19 (29.7)	64	15 (41.7)	36	-	5
Age (years)	54±15	64	44±19	36	56±16	5	0.015
Use of lipid lowering drugs	32 (50.0)	64	24 (66.7)	36	3 (60.0)	5	0.261
Early CAD	2 (3.1)	64	4 (11.1)	36	-	5	0.297
Xanthomas	3 (4.7)	64	3 (8.3)	36	1 (20.0)	5	0.365
Xanthelasmas	4 (6.3)	64	1 (2.8)	36	-	5	0.696
Corneal arcus	2 (3.1)	64	3 (8.3)	36	-	5	0.345
Current TC	279±65	62	316±107	36	302±28	5	0.102
Current LDL-C	195±56	64	234±104	36	207±35	5	0.051
Baseline TC	322±33	60	382±150	32	305±43	5	0.008
Baseline LDL-C	233±24	59	287±148	34	229±20	4	0.022

CAD: coronary artery disease; IC: index case; LDL-C: low-density lipoprotein cholesterol; TC: total cholesterol; VUS: variant of uncertain significance. Early CAD defined as atherosclerotic cardiovascular disease event < 55 and 60 years of age in males and females, respectively; lipids in mg/dL; baseline lipids = untreated.

Table 4

– Clinical and biochemical characteristics of negative and positive relatives

	Negative relatives	N (249)	Positive relatives	N (240)	p value
Females %	136 (54.6)	249	135 (56.3)	240	0.504
Males %	113 (45.4)	249	105 (43.8)	240
Age (years)	40±21	249	38±21	240	0.710
In use of lipid lowering drugs	31 (12.4)	249	93 (38.8)	240	0.001
Early CAD	2 (0.8)	249	9 (3.8)	240	0.034
Xanthomas	6 (2.4)	249	17 (7.1)	240	0.013
Xanthelasmas	11 (4.4)	249	34 (14.2)	240	0.001
Corneal arcus	1 (0.4)	249	9 (3.8)	240	0.009
Current TC	198±51	114	309±86	127	0.001
Current LDL-C	124±42	192	233±75	198	0.001
Baseline TC	220±191	97	318±97	130	0.001
Baseline LDL-C	126±41	169	243±82	178	0.001

CAD: coronary artery disease; LDL-C: low-density lipoprotein cholesterol; TC: total cholesterol. Early CAD defined as atherosclerotic cardiovascular disease event < 55 and 60 years of age in males and females, respectively; lipids in mg/dL; baseline lipids = untreated.

Figure 2 shows the geographic distribution of the 11 cities located in 3 Brazilian states, the number of registered cases, the number of individuals genotyped, and the number of individuals with a pathogenic variant.

Figure 2

– Geographical distribution of cases, number of genotyped individuals, and number of individuals with an identified pathogenic variant (positive).

Brazilian states, from top to bottom: Maranhão, Minas Gerais, and Santa Catarina

Table 5 shows all the encountered variants and the location where they were identified. In total, 21 different variants were identified with 3 variants appearing more frequently. Observed frequencies for these 3 variants suggest that they have founder effects in these localities. Six homozygous patients and one compound heterozygous in trans were found.

Table 5

– FH pathogenic variants, likely pathogenic variants and VUS found per city

Gene	Variant	Variant Classification	Bambuí	Bom Despacho	Luz	Pimenta	Moema	Buriti Bravo	Colinas	Lagoa do Mato	Passagem Franca	Major Vieira	Papanduva	Total
LDLR	Duplication from exon 4 to 8 (b)	Pathogenic	0	0	0	0	0	0	0	0	0	45b	41	86
LDLR	Duplication from promoter to exon 6	Pathogenic	0	0	0	0	0	1	4	29	49a	0	0	83
LDLR	p.Asp224Asn	Pathogenic	0	39	4	0	34	0	0	0	0	0	0	77
LDLR	p.Cys222*	Pathogenic	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	5	5
LDLR	c.1359-1G >C	Pathogenic	0	0	0	5	0	0	0	0	0	0	0	5
LDLR	p.Gly592Glu	Pathogenic	0	0	0	0	0	0	0	0	0	2	0	2
LDLR	p.Ala771Val	Pathogenic	0	0	1	0	0	0	0	0	0	0	0	1
LDLR	p.Pro699Leu	Pathogenic	0	0	1	0	0	0	0	0	0	0	0	1
LDLR	p.Asp601His	Likely Pathogenic	2	0	0	0	2	0	0	0	0	0	0	4
LDLR	p.Cys34Arg	Likely Pathogenic	0	1	0	0	0	0	0	0	0	0	0	1
LDLR	p.Arg257Trp	Likely Pathogenic	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	1	1
LDLR	p.Ser854Gly	Likely Pathogenic	0	2	0	0	0	0	0	0	0	0	0	2
LDLR	c.-228G>C	VUS	0	0	0	0	0	0	1	0	0	0	0	1
LDLR	p.Ala30Gly	VUS	0	0	0	1	0	0	0	0	0	0	0	1
APOB	p.Ala2790Thr	VUS	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	1	1
APOB	p.Met499Val	VUS	0	1	0	0	0	0	0	0	0	0	0	1
PCSK9	p.Arg237Trp	VUS	0	4	0	0	0	0	0	0	0	0	0	4
PCSK9	p.Arg357Cys	VUS	0	0	1	0	0	0	0	0	0	0	0	1
STAP1	p.Pro176Ser	VUS	0	0	0	1	0	0	0	0	0	0	0	1
LDLR	p.Cys222*	Pathogenic	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	1c	1c
LDLR	Duplication from exon 4 to 8	Pathogenic
PCSK9	p.Arg215Cys	Likely Pathogenic	0	0	0	0	0	0	0	1	0	0	0	1c
APOB	p.Asp2213Asn	VUS
APOB	p.Val3290Ile	VUS
PCSK9	p.Arg215Cys	Likely Pathogenic	0	0	0	0	0	0	0	1	0	0	0	1c
APOB	p.Val3293lle	VUS
PCSK9	p.Arg215Cys	Likely Pathogenic	0	0	0	0	0	0	0	1	0	0	0	1c
APOB	p.Asp2213Asn	VUS

2 homozygotes (b) 4 homozygotes (c) compound heterozygous in trans. VUS: variant of uncertain significance ; FH: Familial hypercholesterolemia.

Discussion

This study describes the results of the implementation of a cascade screening system for FH in 11 small Brazilian cities.

Despite the known cost benefits of cascade screening for FH, worldwide implementation has been suboptimal. Different local barriers and implementation hurdles have to be identified and overcome. How to implement cascade screening in small localities, for example, has been mainly overlooked. This challenge is greater in a continent-sized country like Brazil, where, in addition to the enormous geographic distances, there is inequality in access to health services. We have described the experience of HipercolBrasil in conducting comprehensive cascade screening in small towns in Brazil. In this new model, cascade genetic screening was carried out in cities that showed evidence of a higher prevalence of FH due to previous finding of individuals with the homozygous phenotype from the same city, or because those regions had reported elevated frequency of myocardial infarction.

Cities that had evidence of a founder effect were the ones that presented a higher identification of individuals affected per each IC analyzed (in descending order Major Vieira, Papanduva, Lagoa do Mato, and Passagem Franca). In these cities, we started from homozygous individuals whose parents were non-related and were born in different geographic regions. Clearly, whenever this situation is flagged by a cascade screening program, it deserves the deployment of a city-wide approach, because the costs-benefits of this scenario are the most advantageous. Implementing the genetic cascade in small towns proved to be more efficient when compared to the genetic cascade performed by Hipercol Brasil[11] considering that the rates of family members per IC were 4.7 and 1.6, respectively (p < 0.0001).

It is important that the rate of tested family members per IC was also higher in cities with suspected founder effects. This probably occurred because these cities had a small number of inhabitants, and most relatives had some degree of familial relation. This did not occur in Bom Despacho, a city considerably larger than the others (45,624 inhabitants), and, although the number of family members collected was similar to that of other cities, there was a higher number of ICs collected (28) decreasing the rate of relatives/IC to 2,4. This situation exemplifies the tenuous equilibrium between city size and the success of the described approach.

Visited cities that were geographically close to cities with suspected founder effects (Bambuí, Buriti Bravo, Colinas, Pimenta, and Luz) had a low uptake of ICs and, consequently, a low number of identified relatives. This suggests that concentrating efforts in the selected municipality, as opposed to extending the approach to nearby towns, should be prioritized, and the capture of nearby potential cases should be left to the usual cascade screening mechanism.

Conclusion

Cascade screening in small cities (fewer than 60,000 inhabitants) with a founder effect proved to be effective. However, some points might be of great importance in order for the cascade screening to be effective, and the following might be considered before deciding which cities to track: establishment of a formal partnership and explicit interest on the part of the local health department in receiving the program and performing the cascade screening; availability of clinical analysis laboratory datasets to carry out a retrospective survey of cholesterol tests; and dissemination via radio stations and social media regarding the disease and the program for greater adherence by the inhabitants.

This study is limited by the relative number of cities evaluated considering the continental size of Brazil. However, it suggests that the designed approach may be useful for detecting individuals with FH. In conclusion, our data suggest that, once detected, specific geographical regions warrant a targeted approach for the identification of clusters of FH individuals.