Effects of Copaiba Oil in Peripheral Markers of Oxidative Stress in a Model of Cor Pulmonale in Rats.

BACKGROUND: To date, copaiba oil's systemic effects have never documented in Cor pulmonale induced by monocrotaline.
OBJECTIVES: To investigate copaiba oil's effects in peripheral markers of oxidative stress in rats with Cor pulmonale.
METHODS: Male Wistar rats (170±20g, n=7/group) were divided into four groups: control (CO), monocrotaline (MCT), copaiba oil (O), and monocrotaline+copaiba oil (MCT-O). MCT (60 mg/kg i.p.) was administered, and after one week, treatment with copaiba oil (400 mg/kg/day-gavage-14 days) was begun. Echocardiography was performed and, later, trunk blood collection was performed for oxidative stress evaluations. Statistical analysis: two-way ANOVA with Student-Newman-Keuls post-hoc test. P values<0.05 were considered significant.
RESULTS: Copaiba oil reduced pulmonary vascular resistance and right ventricle (RV) hypertrophy (Fulton index (mg/mg): MCT-O=0.39±0.03; MCT=0.49±0.01), and improved RV systolic function (RV shortening fraction, %) in the MCT-O group (17.8±8.2) as compared to the MCT group (9.4±3.1; p<0.05). Moreover, in the MCT-O group, reactive oxygen species and carbonyl levels were reduced, and antioxidant parameters were increased in the peripheral blood (p<0.05). Conclusions: Our results suggest that copaiba oil has an interesting systemic antioxidant effect, which is reflected in the improvements in function and RV morphometry in this Cor pulmonale model. Cor pulmonale attenuation promoted by copaiba oil coincided with a reduction in systemic oxidative stress.

Introdução

A Floresta Amazônica poderia ser considerada um laboratório natural, por tem uma ampla diversidade de plantas com propriedades medicinais. A maioria dessas plantas ainda não foram estudadas, como é o caso da copaíba.[1] A copaíba é uma árvore grande que cresce abundantemente na região norte do Brasil. Desde o século XVI, o óleo de copaíba tem sido usado pelos indígenas nativos do país para tratar várias doenças. Esses usos tradicionais motivaram alguns pesquisadores a estudarem esse óleo.[2]

De acordo com alguns relatos, o óleo de copaíba apresenta propriedades antioxidantes e antilipoperoxidativas.[3 , 4] As propriedades antioxidantes do óleo de copaíba poderiam ser muito úteis no tratamento de algumas doenças cardiovasculares associadas ao stress oxidativo. Entretanto, há apenas dois estudos na literatura demonstrando os efeitos benéficos do óleo de copaíba em doenças cardiovasculares, como a hipertensão arterial pulmonar (HAP).[5 , 6]

A HAP é uma doença crônica e fatal que está associada a aumentos progressivos da pressão e da resistência vascular pulmonar. Essas alterações prejudicam o desempenho do ventrículo direito (VD) e resultam em insuficiência do VD, e, em última instância, em morte.[7] Para se estudar os mecanismos fisiopatológicos envolvidos da disfunção do VD e no desenvolvimento da HAP, foi utilizado o modelo de monocrotalina (MCT).[8] O metabólito ativo da MCT causa danos ao endotélio pulmonar, levando à HAP.[9]

O modelo MCT mimetiza aspectos da HAP humana, incluindo o Cor pulmonale, que é um termo usado para descrever a hipertrofia patológica do VD induzida por disfunção pulmonar.[10] Na verdade, vários estudos em modelos animais e pacientes implicam o stress oxidativo no desenvolvimento do Cor pulmonale e da HAP.[11 - 13] O stress oxidativo pode causar danos às células endoteliais[14] além de contribuir para a disfunção e insuficiência do VD.[11] Entretanto, nenhum estudo explorou o impacto da HAP nos marcadores de stress oxidativo no sangue periférico, ao analisar os efeitos do óleo de copaíba. Relatou-se que o stress oxidativo medido no sangue de pacientes com doença neurodegenerativa poderia representar um reflexo do dano oxidativo cerebral nesses pacientes.[15] Dessa forma, a avaliação dos marcadores periféricos de stress oxidativo poderia ter uma aplicabilidade clínica, já que a obtenção de uma amostra de sangue representa um procedimento minimamente invasivo.[16] Essa abordagem poderia ser útil em caso de doenças cardiopulmonares, tais como a HAP, para monitorar o avanço da doença, além da necessidade e da eficácia da terapia antioxidante, como o óleo de copaíba.

Portanto, o objetivo deste estudo foi investigar se os marcadores periféricos de stress oxidativo refletem as alterações estruturais e funcionais promovidas no VD pela HAP e os efeitos do óleo de copaíba sobre esses marcadores.

Métodos

Animais, indução do Cor pulmonale e grupos:

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal institucional (número de protocolo: 31765). No total, foram estudados 28 ratos Wistar machos (pesando 170±20g) do Centro de Reprodução e Experimentação de Animais de Laboratório (CREAL) da Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Eles foram mantidos em uma temperatura de 20-22°C, com um fotoperíodo de 12:12h escuro/claro. Todos os animais tinham acesso ad libitum a ração para ratos comum e água, e os experimentos foram realizados de acordo com o Guia para o cuidado e uso de animais de laboratório) (Departamento de Serviços de Saúde e Humanos, Publicação NIH nº 86-23), e com diretrizes institucionais.

O número de animais por grupo foi estimado com base em estudos anteriores de nosso grupo de pequisa,[6 , 7] considerando a diferença mínima entre os grupos de dois desvios padrão, uma probabilidade mínima de erro tipo I de 5% (a = 0,05) e uma probabilidade de erro tipo II de 20% (b = 0,2). Esse cálculo foi realizado utilizando-se o software Computer Programs for Epidemiologists (PEPI - Versão 4.04x)

Os animais foram divididos em quatro grupos experimentais (N=7/grupo): controle (CO), monocrotalina (MCT), óleo de copaíba (O), e monocrotalina + óleo de copaíba (MCT-O). No primeiro dia, a HAP foi induzida por uma injeção única de MCT in bolus (60mg/kg i.p.), conforme descrito em outro local.[10] Uma semana depois da indução de HAP, os animais no grupo O e MCT-O receberam óleo de copaíba (400mg/kg) por gavagem, uma vez ao dia, durante 14 dias.[5] Essa dose corresponde a um volume de 0,63 mL/kg de óleo de copaíba. Durante esse período, os animais dos grupos CO e MCT receberam o mesmo volume de água por gavagem.

Análise ecocardiográfica

O fluxo pela artéria pulmonar e a função contrátil do VD foram avaliados por ecocardiografia após o final do tratamento para estimar o efeito do óleo de copaíba na função cardiovascular. Os animais foram anestesiados (cetamina, 90 mg/kg; xilazina, 20 mg/kg, intraperitoneal) e colocados na posição decúbito lateral esquerdo para se obter as imagens cardíacas. Foi utilizado um sistema EnVisor Philips (Andover, MA, EUA), com um transdutor de 12–13MHz, por um operador treinado e com experiência em ecocardiografia de pequenos animais. Foram medidos a fração de encurtamento do VD (FEVD), que estima a função contrátil do VD, e o tempo de aceleração (TA) e o tempo de ejeção (TE) dos traços da velocidade do fluxo da artéria pulmonar, que estimam a resistência vascular pulmonar.[17]

Análise morfométrica

Depois do final do tratamento, os ratos foram sacrificados por decapitação. O VD e o VE foram retirados para medição morfométrica, e foi coletado sangue do tronco venoso para análise de stress oxidativo. VD e VE + septo (S) foram pesados para determinar a hipertrofia cardíaca pelo Índice de Fulton (peso do VD/peso de VE+S).[18]

Preparação da amostra de sangue:

Defesas antioxidantes sistêmicas e espécies reativas do oxigênio (ERO) totais foram avaliadas nas hemácias e as carbonilas forma medidas no plasma. Amostras de sangue heparinizadas foram lavadas três vezes em uma solução de cloreto de sódio (9g/L) e centrifugadas a 3.000 g por 10 minutos em temperatura ambiente. Eritrócitos lavados foram diluídos na proporção de 1/10 em uma solução de ácido acético (1mmol/L) e sulfato de magnésio (4mmol/L). A solução final foi centrifugada a 4.200 g por 20 minutos. O sobrenadante foi armazenado em freezer a -80 °C para medições de stress oxidativo futuras.[15]

Concentração de proteína

A concentração de proteína foi quantificada pelo método estabelecido por Lowry et al.,[19] utilizando albumina bovina como solução padrão na concentração de 1mg/mL. Todos os resultados de stress oxidativo foram normalizados pela quantidade de proteína.[19]

Determinação dos níveis totais de ERO

A geração de ERO foi medida por emissão de fluorescência DCFH-DA (Sigma-Aldrich, USA). O diacetato de diclorofluoresceína é uma membrana permeável e é rapidamente oxidada para a altamente fluorescente 2’, 7’-diclorofluoresceína (DCF) na presença de ERO. A amostra foi excitada a 488 nm, e a emissão foi coletada com um filtro de passagem longa de 525 nm. As ERO foram expressas como nmol por miligrama de proteína.[20]

Ensaio de carbonila

Essa técnica se baseia na reação de proteínas oxidadas com 2,4-dinitrofenil-hidrazina (DNPH). Em resumo, estas proteínas foram adicionadas a DNPH 10mmol/L em 2,5mol/L solução de HCl, por 1 h, no escuro em temperatura ambiente, com agitação a cada 15 minutos. Em seguida, uma solução de ácido tricloroacético a 20% (p/v) foi adicionada às amostras de plasma, que foram centrifugadas (1.000 por 5 minutos) para coletar precipitados de proteína. Daí em diante, a pelota foi dissolvida com etanol:acetato de etila (1:1) (v/v) e incubada por 10 minutos a 37 °C com 6mol/L de solução de cloreto de guanidina. A absorbância foi medida em um espectrofotômetro a 360nm e os resultados foram expressos em nmol de DNPH derivativos/mg de proteína.[21]

Determinação de atividades de enzimas antioxidantes:

A atividade de superóxido dismutase (SOD) foi determinada pela medição da velocidade da formação de pirogalol oxidado, e expressa em unidades por miligrama de proteína, conforme Marklund.[22] A atividade de catalase (CAT) foi determinada acompanhando a diminuição na absorção de peróxido de hidrogênio de 240 nm. Ela foi expressa em nmol de peróxido de hidrogênio reduzido por minuto por miligrama de proteína.[23]

A atividade de glutationa peroxidase (GPx), expressa em nmol de peróxido de hidrogênio por minuto por mg de proteína, foi medida após a oxidação de NADPH a 340 nm em um meio de reação contendo 0,17 mmol/L de glutationa reduzida, 0,2 U/mL de glutationa redutase, e 0,5 mmol/L de hidroperóxido de terc-butil.[24]

Níveis totais de glutationa

Os níveis totais de glutationa (GSH) foram determinados conforme descrito por Akerboom e Sies,[25] com modificações. O GSH foi medido nos eritrócitos após a precipitação de proteína com 10% de ácido tricloroacético. Uma alíquota da amostra foi adicionada ao tampão de fosfato com 500 μmol/L DTNB. O desenvolvimento de cor, resultante da reação entre DTNB e os tióis, atingiu o máximo em 5 minutos e ficou estável por mais 30 minutos. A absorbância foi medida a 412 nm após 10 minutos. Uma curva padrão de glutationa reduzida foi utilizada para calcular os níveis de GSH nas amostras.[25]

Análise estatística

Para a análise estatística, foi usado o software SigmaPlot. Os dados são mostrados como média ± desvio padrão. O teste de normalidade (Shapiro-Wilks) foi conduzido para determinar a distribuição de dados. Como nossos resultados apresentaram distribuição normal, a análise estatística foi realizada usando ANOVA de duas vias, seguida do teste Student-Newman-Keuls post hoc. A correlação de Pearson foi utilizada para estudar a associação entre variáveis. P-valores menores que 0,05 foram considerados significativos.

Resultados

Avaliações ecocardiográfica

Observou-se uma diminuição significativa no TA no grupo MCT, ao mesmo tempo em que houve um aumento no grupo O, em comparação ao CO. Entretanto, o óleo de copaíba recuperou esse parâmetro para controlar os níveis no grupo MCT-O. Por outro lado, não houve diferenças entre os grupos no parâmetro TE. A FEVD, que estima a função sistólica do VD, diminuiu no grupo MCT, e o óleo de copaíba evitou essa alteração nos animais do grupo MCT-O ( Tabela 1 ).

Tabela 1

– Resultados ecocardiográficos e morfométricos

	CO	MCT	O	MCT-O
TA (s)	0,029±0,005	0,018±0,001a	0,034±0,001a	0,025±0,003b
TE (s)	0,099±0,01	0,106±0,007	0,098±0,01	0,11±0,001
FEVD (%)	21,2±2,4	9,4±3,1a	18,8±2,4	17,8±8,2b
Índice de Fulton (mg/mg)	0,29±0,02	0,49±0,01a	0,29±0,01	0,39±0,03b

Os dados são expressos como média ± DP. a p <0,05 vs. CO; b p <0,05 vs. MCT. CO: controle; O: óleo de copaíba; MCT: monocrotalina; MCT-O: monocrotalina + óleo; TA: tempo de aceleração; TE: tempo de ejeção; VD: ventrículo direito; FEVD: fração de encurtamento do ventrículo direito. Índice de Fulton = peso do VD/peso do VE + septo; N= 7 animais por grupo.

Avaliação morfométrica

O índice de hipertrofia do ventrículo direito (VD/VE + peso de S), mostrado na Tabela 1 , foi significativamente aumentado no grupo MCT em comparação ao grupo CO. Esse parâmetro diminuiu significativamente nos animais do grupo MCT-O.

Análise de stress oxidativo

Houve um aumento significativo nas ERO e nos níveis de carbonila ( Figura 1A e 1B , respectivamente) no grupo MCT em comparação ao CO. Não houve diferença significativa entre o grupo MCT e o MCT-O, ou entre o MCT-O e o O, em relação aos níveis de ERO. Entretanto, os níveis de carbonila, que aumentaram no grupo MCT, foram reduzidos no grupo MCT-O.

Figura 1

– Stress oxidativo A) Concentração total de espécies reativas do oxigênio; B) Níveis de carbonila. Os dados são expressos como média ± DP. a p <0,05 vs. CO; b p <0,05 vs. MCT. Grupo de controle: CO; grupo monocrotalina: MCT, grupo óleo de copaíba: O, grupo monocrotalina + óleo de copaíba: MCT-O.

Análise de antioxidantes

As atividades de enzimas antioxidantes (SOD, CAT e GPx), e concentração de GSH foram significativamente mais baixas no grupo MCT, em comparação com o grupo CO. O tratamento com óleo de copaíba recuperou esses parâmetros significativamente nos animais do grupo MCT-O. ( Figura 2A, 2B, 2C, 2D , respectivamente).

Figura 2

– Medições de antioxidantes. A) Atividade de superóxido dismutase; B) Atividade de catalase; C) Atividade de glutationa peroxidase; D) Níveis totais de glutationa. Os dados são expressos como média ± DP. a p <0,05 vs. CO; b p <0,05 vs. MCT. Grupo de controle: CO; grupo monocrotalina: MCT, grupo óleo de copaíba: O, grupo monocrotalina + óleo de copaíba: MCT-O

Correlações

Observou-se uma correlação positiva (R=0,688; p<0,05) entre ERO total e a relação peso de VD/ peso de VE + S ( Figura 3A ), em comparação com uma correlação negativa (R=0,614; p<0,05) entre a concentração de GSH e a relação entre peso de VD/peso de VE + S ( Figura 3B ).

Figura 3

– Correlações entre peso do VD/peso do VE + S e (A) ERO (P <0,05); e (B) GSH (P<0,05). VD: ventrículo direito, VE: ventrículo esquerdo, ERO: espécies reativas de oxigênio, GSH: níveis totais de glutationa.

Discussão

Os principais achados do presente estudo foram que o MCT modulado por óleo de copaíba induziu o Cor pulmonale , uma vez que promoveu a redução da resistência arterial pulmonar, além de resultar em disfunção e hipertrofia do VD. Paralelamente a essas alterações, identificou-se que o tratamento com o óleo de copaíba reverteu o stress oxidativo sistêmico aumentado pelo MCT, que foi observado pela melhoria dos níveis de ERO e carbonila, e pela redução das defesas antioxidantes.

De acordo com a literatura, a elevação da resistência pulmonar arterial é acompanhada de hipertrofia do VD, o que caracteriza o Cor pulmonale. [10] Na verdade, neste estudo observou-se uma diminuição do tempo de aceleração pela artéria pulmonar (TA), o que indica um aumento da resistência da artéria pulmonar, e um aumento da hipertrofia do VD em animais do grupo MCT. Por outro lado, o tratamento com óleo de copaíba conseguiu mitigar esses efeitos. A redução da resistência na artéria pulmonar que contribuiu para o aumento na remodelagem do VD poderia contribuir para melhorar a função do VD. Investigações anteriores em pacientes com HAP indicam que uma deficiência na função do VD está relacionada a resultados clínicos adversos e sobrevida reduzida,[26] o que destaca a importância de um tratamento, tais como o óleo de copaíba, que ameniza o dano ao VD. Além disso, detectou-se uma diminuição da fração de encurtamento do VD (FEVD) no grupo MCT, o que indica deficiência da função contrátil do VD. Esse resultado está em conformidade com outros,[27 , 28] que estudaram essa doença. Em contrapartida, conforme descrito no trabalho anterior, o óleo de copaíba conseguiu aumentar esse parâmetro, o que indica que este óleo poderia melhorar a função do VD.[6]

Conforme Jim et al.,[29] há um aumento na produção de ERO sistêmicas em um modelo de ratos de hipertensão pulmonar. Além disso, Mohammadi[30] também observou uma redução nas atividades de CAT, SOD, GPx, e na concentração de GSH medida no sangue em HAP induzida por MCT. Esses dados estimularam a investigação dos efeitos antioxidantes do óleo de copaíba sobre a HAP. Os dados deste estudo mostraram que o óleo de copaíba reverteu os danos oxidativos elevando as defesas antioxidantes sistêmicas e reduzindo a carbonila a níveis próximos dos observados nos ratos do grupo de controle, sugerindo que esse óleo tenha aumentado a reserva de antioxidante.

Em um estudo prévio deste grupo, foi avaliada a composição do óleo de copaíba.[5] A análise química desse óleo foi realizada utilizando cromatografia gasosa com espectrometria de massa. Detectou-se que o óleo de copaíba é composto de terpenos com a predominância do β-cariofileno. Esse composto tem atividade antioxidante, levando à redução das ERO devido a seu efeito de sequestro de radicais livres contra ânions superóxidos, ânions hidroxila, e peróxidos lipídicos.[31]

Portanto, é razoável acreditar que os efeitos antioxidantes observados após o tratamento com óleo de copaíba se devem ao β-cariofileno presente nesse óleo. Por outro lado, os efeitos antioxidantes do óleo de copaíba também podem se dever a uma interação entre seus vários componentes. Conforme relatado em um estudo anterior, o óleo de copaíba é composto de uma grande variedade e outros sesquiterpenos e diterpenos, que também têm propriedades antioxidantes.[5]

O stress oxidativo está envolvido no desenvolvimento da hipertrofia cardíaca patológica e em um prognóstico ruim.[32] A redução da hipertrofia do VD encontrada pelo presente estudo poderia estar associada ao efeito antioxidante do óleo de copaíba. Na verdade, foi encontrada uma correlação positiva entre os níveis de ERO e a hipertrofia cardíaca neste estudo. Por outro lado, níveis aumentados de GSH, um antioxidante não enzimático endógeno, foram correlacionados a índices mais baixos de hipertrofia cardíaca. Portanto, sugere-se que o óleo de copaíba possa proteger o VD contra a hipertrofia cardíaca por suas propriedades antioxidantes. Esse achado tem enorme importância, pois, de acordo com Rosca et al., a hipertrofia do VD está correlacionada a um risco mais alto de morte súbita cardíaca.[33] Como essa era uma associação entre stress oxidativo sistêmico e alteração morfométrica cardíaca, esses marcadores podem ser um reflexo das alterações no VD promovidas pela HAP.

O presente estudo foi o primeiro a testar o efeito sistêmico do óleo de copaíba em um modelo de Cor pulmonale . Alguns marcadores periféricos de stress oxidativo foram avaliados para se detectar mudanças no estado redox sistêmico. Avaliações do sangue periférico são importantes e úteis, pois refletem o estado de saúde geral do organismo. Amostras de sangue são facilmente acessíveis, disponíveis em grande quantidade, e sua coleta é menos invasiva que uma biópsia de tecido, por exemplo. Portanto, a avaliação dos marcadores de stress oxidativo no sangue de pacientes com HAP poderia ser útil para se monitorar o desenvolvimento do Cor pulmonale e o tratamento utilizado, como foi realizado com os animais usados no presente estudo.

Conclusões

Os resultados obtidos sugerem que o óleo de copaíba tem um efeito antioxidante sistêmico interessante, que se reflete na melhoria da função e na morfometria do VD nesse modelo de Cor pulmonale . Esses resultados destacam a importância do óleo de copaíba como possível tratamento adjuvante da HAP.

Introduction

The Amazon forest could be considered a natural laboratory, since it has a wide diversity of plants with medicinal properties. The great majority of these plants have not yet been fully studied, as it is the case of copaiba.[1] Copaiba is a large tree that grows abundantly in the northern region of Brazil. Since the 16th century, copaiba oil has been used by the native indigenous people of the country in the treatment of various diseases. These traditional uses have motivated some researchers to study this oil.[2]

According to some reports, copaiba oil presents antioxidant and anti-lipoperoxidative properties.[3 , 4] The antioxidant properties of copaiba oil could be very useful in the treatment of some cardiovascular diseases associated with oxidative stress. However, only two studies were found in the literature demonstrating the beneficial effects of copaiba oil on cardiovascular diseases, such as pulmonary arterial hypertension (PAH).[5 , 6]

PAH is a chronic and fatal disease that is associated with progressive increases in pulmonary vascular resistance and pressure. These changes impair the performance of the right ventricle (RV) and result in RV failure, and ultimately death.[7] To study the physiopathological mechanisms involved in RV dysfunction and PAH development, a monocrotaline (MCT) model was used.[8] The active metabolite of MCT causes damage in the pulmonary endothelium, leading to PAH.[9]

The MCT model mimics aspects of human PAH, including Cor pulmonale, which is a term used to describe pathological RV hypertrophy induced by lung dysfunction.[10] In fact, multiple studies in animal models and patients implicate oxidative stress in the development of Cor pulmonale and PAH.[11 - 13] Oxidative stress can cause damage to pulmonary endothelial cells,[14] as well as contribute to RV dysfunction and failure.[11] However, no study has explored the impact of PAH on oxidative stress markers in peripheral blood by analyzing copaiba oil’s effects. It was reported that oxidative stress measured in the blood of patients with a neurodegenerative disease could represent a reflection of the oxidative brain damage in those patients.[15] In this sense, evaluating peripheral markers of oxidative stress could have clinical applicability, since obtaining a blood sample represents a minimally invasive procedure.[16] This approach could be useful to cardiopulmonary diseases, such as PAH, in order to monitor the disease’s progression, together with the need and efficacy of antioxidant therapy, such as copaiba oil.

Thus, the aim of this study was to investigate whether peripheral markers of oxidative stress reflect the structural and functional changes promoted in RV by PAH and the effects of copaiba oil under these markers.

Methods

Animals, induction of cor pulmonale, and groups:

All procedures were approved by the institutional Animal Ethics Committee (protocol number: 31765). In total, 28 male Wistar rats (weighing 170±20g) from the Center for Reproduction and Experimentation of Laboratory Animals (CREAL) of Universidade Federal do Rio Grande do Sul were studied. These were kept at 20-22°C and with a 12:12h dark/light photoperiod. All animals had ad libitum access to regular rodent chow and water, and the experiments were conducted in accordance with the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 86-23) and with institutional guidelines.

The number of animals per group was estimated based on previous studies from our research group,[6 , 7] considering the minimum difference between the groups of two standard deviations, a minimum probability of type I error of 5% (a = 0.05), and a probability of type II error of 20% (b = 0.2). This calculation was performed using the Computer Programs for Epidemiologists (PEPI - Version 4.04x) software.

Animals were divided into four experimental groups (N=7/group): control (CO), copaiba oil (O), monocrotaline (MCT), and monocrotaline+copaiba oil (MCT-O). On the first day, PAH was induced by a single in bolus MCT injection (60mg/kg i.p.), as described elsewhere.[10] One week after PAH induction, animals in the O and MCT-O groups received copaiba oil (400mg/kg) by gavage, once a day, for 14 days.[5] This dose corresponds to a volume of 0.63mL/kg of copaiba oil. During this period, animals from the CO and MCT groups received the same volume of water by gavage.

Echocardiographic analysis

The flow through the pulmonary artery and RV contractile function were evaluated by echocardiography after the end of treatment to estimate the effect of copaiba oil on the cardiovascular function. Animals were anesthetized (ketamine, 90mg/kg; xylazine, 20mg/kg, intraperitoneal) and placed in the left lateral decubitus position to obtain cardiac images. An EnVisor Philips system (Andover, MA) was used, with a 12–13MHz transducer, by a trained operator with experience in small animal echocardiography. The RV shortening fraction (RVSF), which estimates RV contractile function, as well as the acceleration time (AT) and the ejection time (ET) of pulmonary artery flow velocity tracings were measured, which estimates pulmonary vascular resistance.[17]

Morphometric analysis

After the end of treatment, rats were killed by decapitation. RV and left ventricle (LV) were harvested for morphometric measurement, and blood was collected from the venous trunk for oxidative stress analysis. RV and LV+septum (S) were weighed to determine cardiac hypertrophy through the Fulton index (RV weight/LV+S weight).[18]

Blood sample preparation:

Systemic antioxidant defenses and total reactive oxygen species (ROS) were evaluated in red blood cells, and carbonyls were measured in plasma. Heparinized blood samples were washed three times in a solution of sodium chloride (9g/L) and centrifuged at 3,000g for 10min. at room temperature. Washed erythrocytes were diluted 1/10 in a solution of acetic acid (1mmol/L) and magnesium sulphate (4mmol/L). The final solution was centrifuged at 4,200g for 20 min. The supernatant was stored in freezers at -80ºC for later oxidative stress measurements.[15]

Protein concentration

Protein concentration was quantified by the method established by Lowry et al.,[19] using bovine albumin as a standard solution at a concentration of 1mg/mL. All oxidative stress results were normalized by the amount of protein.[19]

Determination of total ROS levels

ROS generation was measured by DCFH-DA fluorescence emission (Sigma-Aldrich, USA). Dichlorofluorescein diacetate is a permeable membrane and is rapidly oxidized to the highly fluorescent 2,7-dichlorofluorescein (DCF) in the presence of ROS. The samples were excited at 488 nm and emission was collected with a 525nm long pass filter. ROS was expressed as nmol per milligram of protein.[20]

Carbonyl assay

This technique is based on the reaction of oxidized proteins with 2,4-dinitro-phenyl hydrazine (DNPH). Briefly, these proteins were added to a DNPH 10mmol/L in 2.5mol/L HCl solution for 1 h in the dark at room temperature, with shaking every 15 min. A 20% trichloroacetic acid (w/v) solution was then added to the plasma samples, which were centrifuged (1,000g for 5 min) to collect protein precipitates. Thereafter, the pellet was dissolved with ethanol:ethyl acetate (1:1) (v/v) and incubated for 10 min at 37ºC with 6mol/L guanidine hydrochloride solution. The absorbance was measured in a spectrophotometer at 360nm and results were expressed as nmol DNPH derivatives/mg protein.[21]

Determination of antioxidant enzyme activities:

Superoxide dismutase (SOD) activity was determined by measuring the velocity of oxidized pyrogalol formation, and expressed as units per milligram of protein, according to Marklund.[22] Catalase (CAT) activity was determined by following the decrease in 240nm absorption of hydrogen peroxide. This was expressed as ɳmol of hydrogen peroxide reduced per minute per milligram of protein.[23]

Glutathione peroxidase (GPx) activity, expressed as nmol of hydroperoxide reduced per min per mg protein, was measured following NADPH oxidation at 340nm in a reaction medium containing 0.17mmol/L reduced glutathione, 0.2U/mL glutathione reductase, and 0.5mmol/L tert-butyl hydroperoxide.[24]

Total glutathione levels

Total glutathione (GSH) levels were determined as described by Akerboom and Sies,[25] with modifications. GSH was measured in erythrocytes after protein precipitation with 10% trichloroacetic acid. An aliquot of the sample was added to phosphate buffer with 500μmol/L DTNB. Color development, resulting from the reaction between DTNB and the thiols, reached a maximum in 5 min and was stable for more than 30 min. Absorbance was read at 412nm after 10 min. A standard curve of reduced glutathione was used to calculate the GSH levels in the samples.[25]

Statistical Analysis

For statistical analysis, the SigmaPlot software was used. Data are shown as mean±standard deviation. The normality test (Shapiro-Wilks) was performed to determine the data distribution. As our results presented normal distribution, statistical analysis was performed using two-way ANOVA, followed by the Student-Newman-Keuls post-hoc test. Pearson correlation was used to study the association between variables. P values less than 0.05 were considered significant.

Results

Echocardiographic evaluations

A significant decrease was observed in the AT in the MCT group, while it was increased in the O group, as compared to CO. However, copaiba oil recovered this parameter to control levels in the MCT-O group. By contrast, no difference was found among groups in the ET parameter. RVSF, which estimates RV systolic function, decreased in the MCT group, and copaiba oil prevented this change in the MCT-O animals ( Table 1 ).

Table 1

– Echocardiographic and morphometric results

	CO	MCT	O	MCT-O
AT (s)	0.029±0.005	0.018±0.001a	0.034±0.001a	0.025±0.003b
ET (s)	0.099±0.01	0.106±0.007	0.098±0.01	0.11±0.001
RVSF (%)	21.2±2.4	9.4±3.1a	18.8±2.4	17.8±8.2b
Fulton index (mg/mg)	0.29±0.02	0.49±0.01a	0.29±0.01	0.39±0.03b

Data are expressed as mean±SD. a P<0.05 vs CO; b P<0.05 vs MCT. CO:control; O: Copaiba oil; MCT: Monocrotaline; MCT-O: Monocrotaline+Oil; AT: acceleration time; ET: ejection time; RV: right ventricle; RVSF: right ventricle shortening fraction. Fulton index: RV weight/LV+Septum weight; N: 7 animals per group.

Morphometric evaluation

The right ventricular hypertrophy index (RV/LV+S weight), shown in Table 1 , was significantly increased in the MCT group in comparison to the CO group. This parameter decreased significantly in the animals from the MCT-O group.

Oxidative stress analysis

There was a significant increase in the ROS and carbonyl levels ( Figure 1A and 1B , respectively) in the MCT group in comparison with CO. No significant difference was found between the MCT group and the MCT-O, or between the MCT-O and the O group in ROS levels. However, carbonyl levels, which increased in the MCT group, were reduced in MCT-O.

Figure 1

– Oxidative stress A) Total reactive oxygen species concentration; B) Carbonyl levels. Data are expressed as mean±SD. a P<0.05 vs CO; b P<0.05 vs MCT. Control group: CO; Monocrotaline group: MCT, Copaiba oil group: O, Monocrotaline+Copaiba oil group: MCT-O.

Antioxidant analysis

Antioxidant enzyme activities (SOD, CAT, and GPx), and GSH concentration were significantly lower in the MCT group, when compared to the CO group. Treatment with copaiba oil significantly recovered these parameters in the animals from the MCT-O group ( Figure 2A, 2B, 2C, 2D , respectively).

Figure 2

– Antioxidant measurements. A) Superoxide dismutase activity; B) Catalase activity; C) Glutathione peroxidase activity; D) Total glutathione levels. Data are expressed as mean±SD. a P<0.05 vs CO; b P<0.05 vs MCT. Control group: CO; Monocrotaline group: MCT; Copaiba oil group: O; Monocrotaline+Copaiba oil group: MCT-O.

Correlations

A positive correlation (R=0.688; p<0.05) was observed between total ROS and the RV weight/LV+S weight ratio ( Figure 3A ), as compared to a negative correlation (R=0.614; p<0.05) between GSH concentration and the RV weight/LV+S weight ratio ( Figure 3B ).

Figure 3

– Correlations between RV weight/LV+S weight and (A) ROS (p < 0.05); and (B) GSH (p<0.05). RV: right ventricle; LV: left ventricle; ROS: reactive oxygen species; GSH:Total glutathione levels.

Discussion

The main findings of the present study where that copaiba oil modulated MCT-induced Cor pulmonale , since it promoted reduction in the pulmonary artery resistance, as well as in RV hypertrophy and dysfunction. In parallel with these changes, it was found that: copaiba oil treatment reversed the systemic oxidative stress increased by MCT, which was observed by enhanced ROS and carbonyl levels, and a reduction in antioxidant defenses.

According to the literature, the elevation in the pulmonary artery resistance is accompanied by RV hypertrophy, which characterizes Cor pulmonale. [10] In fact, in this study, a decrease in the acceleration time through pulmonary artery (AT) was observed, which indicates an increase in pulmonary artery resistance and an increase in RV hypertrophy in animals from the MCT group. On the other hand, copaiba oil treatment was able to mitigate these effects. The reduction of resistance in the pulmonary artery, which contributed to an improvement in RV remodeling, could contribute to improving the RV function. Previous investigations in patients with PAH indicate that a RV function impairment is related to adverse clinical outcomes and reduced survival,[26] which highlights the importance of a treatment, such as copaiba oil, which softens this harmful damage in the RV. Moreover, a decrease was found in the RV shortening fraction (RVSF) in the MCT group, which indicates impairment of the RV contractile function. This result is in accordance with others[27 , 28] that have studied this disease. Conversely, as described in a previous work, copaiba oil was able to increase this parameter, which indicates that this oil could improve the RV function.[6]

According to Jim et al.,[29] there is an increase in systemic ROS production in a rat model of pulmonary hypertension. Moreover, Mohammadi[30] also observed a decrease in the CAT, SOD, GPx activities, and GSH concentration measured in the blood in an MCT-induced PAH. Those data encouraged us to investigate the antioxidant effects of copaiba oil on PAH. Our data have shown that copaiba oil reversed oxidative damage by elevating the systemic antioxidant defenses and reducing carbonyl to levels close to that observed in control rats, suggesting that this oil has enlarged the antioxidant reserve.

In a previous study from our group, copaiba oil composition was evaluated.[5] Chemical analysis of this oil was carried out using gas chromatography – mass spectroscopy. It was found that copaiba oil is composed of terpenes with the predominance of β-caryophyllene. This compound has antioxidant activity, leading to a reduction in ROS due to its free radical-scavenging effect against superoxide anions, hydroxyl anions, and lipid peroxides.[31]

Thus, it is reasonable to believe that the antioxidant effects observed after treatment with copaiba oil are due to the β-caryophyllene present in this oil. On the other hand, the antioxidant effects of copaiba oil may also be due to an interaction between its various components. As reported in a previous study, copaiba oil is composed of a large variety of other sesquiterpenes and diterpenes, which also have antioxidant properties.[5]

Oxidative stress is involved in the development of pathologic cardiac hypertrophy and in a bad prognosis.[32] The reduction in RV hypertrophy found in the present study could be associated with the copaiba oil antioxidant effect. In fact, a positive correlation was found between ROS levels and cardiac hypertrophy in this study. On the other hand, increased levels of GSH, an endogenous non-enzymatic antioxidant, were correlated with lower rates of cardiac hypertrophy. Thus, it is suggested that copaiba oil can protect RV against cardiac hypertrophy through its antioxidant proprieties. This finding is of tremendous importance because, according to Rosca et al., RV hypertrophy is correlated with an increased risk of sudden cardiac death.[33] Since there was an association between systemic oxidative stress and a cardiac morphometric alteration, these markers may be a reflection of the changes in the RV promoted by PAH.

The present study was the first to test the systemic effect of copaiba oil in a Cor pulmonale model. Some oxidative stress peripheral markers to detect changes in the systemic redox state were evaluated. Evaluations in the peripheral blood are important and useful because they reflect the organism’s general state of health. Blood samples are easily accessible, available in large quantity, and its collection is less invasive than a tissue biopsy, for example. Thus, the evaluation of oxidative stress markers in the blood of patients with PAH could be useful to monitor the development of Cor pulmonale and the applied treatment, as performed in the animals used in the present study.

Conclusions

The results obtained suggest that copaiba oil has an interesting systemic antioxidant effect, which is reflected in the RV morphometric and function improvement in this Cor pulmonale model. These results highlight the importance of copaiba oil as a potential adjuvant treatment for PAH.