[Polymorphisms in Plasmodium falciparum parasites and mutations in the resistance genes Pfcrt and Pfmdr1 in Nanoro area, Burkina Faso].

INTRODUCTION: from a genetic point of view P. falciparumis extremely polymorphic. There is a variety of parasite strains infesting individuals living in malaria endemic areas. The purpose of this study is to investigate the relationship between polymorphisms in Plasmodium falciparum parasites and Pfcrt and Pfmdr1 gene mutations in Nanoro area, Burkina Faso.
METHODS: blood samples from plasmodium carriers residing in the Nanoro Health District were genotyped using nested PCR. Parasite gene mutations associated with resistance to antimalarial drugs were detected by PCR-RFLP.
RESULTS: samples of 672 patients were successfully genotyped. No msp1and msp2allelic families exhibited an increase in developing mutations in resistance genes. However, mutant strains of these genes were present at greater levels in monoclonal infections than in multi-clonal infections.
CONCLUSION: this study provides an overview of the relationship between polymorphisms in Plasmodium falciparum parasites and mutations in resistance genes. These data will undoubtedly contribute to improving knowledge of the parasite´s biology and its mechanisms of resistance to antimalarial drugs. Copyright: Paul Sondo et al.

Introduction

Le paludisme demeure une préoccupation sanitaire mondiale avec 228 millions de cas et 405.000 décès rapportés dans le monde en 2018 [1]. Au Burkina Faso, le nombre de cas était estimé à 7.875.575 dont 12.725 décès en 2018 [1]. De tous les hématozoaires pouvant parasiter l´homme, l´espèce P. falciparum est la plus dangereuse du fait de sa forte implication dans la mortalité attribuable au paludisme et dans la résistance aux antipaludiques.

Sur le plan génétique, P. falciparum est une espèce extrêmement polymorphe. Il existe une grande diversité de souches parasitaires qui infestent les individus vivant en zone d´endémie palustre [2-4]. Malgré l´existence de plusieurs marqueurs de polymorphisme, les protéines de surface du mérozoïte (msp1 et msp2) sont les plus appropriés, du fait de leur implication dans l´invasion du globule rouge par le mérozoïte. Le gène de la msp1 est situé sur le chromosome 9 et les variations au niveau des séquences répétées de son block 2 permettent de subdiviser les populations parasitaires en trois familles alléliques K1, MAD20 et RO33 [5,6]. Le gène de la msp2 est situé sur le chromosome 2 et le polymorphisme de son block central subdivise les populations parasitaires en deux familles alléliques 3D7 et FC27. Ces marqueurs de polymorphisme sont en effet les plus couramment utilisés pour distinguer les populations parasitaires [6].

Parallèlement, la résistance de P. falciparum aux antipaludiques constitue un grand obstacle à la lutte contre le paludisme dans la plupart des pays endémiques. Face à la résistance à la Chloroquine (CQ), les CTA ont été recommandées par l´OMS pour le traitement du paludisme simple. Le Burkina Faso a adopté les combinaisons Artésunate-Amodiaquine (ASAQ), Artéméther-Luméfantrine (AL) et Dihydro-artémisinine-Pipéraquine (DHAPPQ) pour la prise en charge du paludisme simple [7,8]. Il a été clairement démontré que des mutations au niveau des gènes Pfmdr1 et Pfcrt étaient associées à la résistance aux amino-4-quinoléines. Le gène Pfcrt est localisé sur le chromosome 7 et code pour une protéine membranaire impliquée dans le transport du médicament vers l´intérieur de la cellule. Une mutation au niveau du codon 76 qui induit un changement au niveau de la protéine par remplacement de l´acide aminé lysine (K) par la thréonine (T) est fortement associée à la résistance à la Chloroquine (CQ) et à l´Amodiaquine par résistance croisée [9,10]. Le gène Pfmdr1 est localisé sur le chromosome 5 et code pour une protéine membranaire dont l´implication dans la résistance à la Chloroquine et à l´Amodiaquine a été évoquée. Plusieurs points de mutations y sont décrits dont le point N86Y [11,12].

Cependant, la question de savoir s´il existe des associations entre certaines variantes génétiques du parasite et les mutations au niveau des gènes de résistances reste encore non clairement élucidée. La présente étude vise à étudier la relation entre le polymorphisme de P. falciparum et les mutations au niveau des gènes Pfcrt et Pfmdr1 dans la zone de Nanoro au Burkina Faso.

Méthodes

Site de l´étude: l´étude s´est déroulée à Nanoro dans la Province du Boulkiemdé au Burkina Faso en Afrique de l´Ouest. Le District sanitaire de Nanoro (DSN) est l´un des cinq districts de la région sanitaire du Centre-Ouest du Burkina Faso. La population totale de la zone était estimée à 180.357 habitants en 2019 et couvre une superficie de 1302 Km2, soit 5,98% de la superficie de la région du centre ouest [13]. Les études entomologiques les plus récentes conduites au Burkina Faso indiquent que les vecteurs les plus courants sont Anopheles gambiae s.s. et An. arabiensis. P. falciparum est le principal agent pathogène, suivi de P. malariae et de P. ovale [14].

Provenance des échantillons: les échantillons de sang séchés sur papier Whatman (confettis) utilisés pour cette étude ont été collectés chez des patients souffrant de paludisme à P. falciparum et enrôlés dans l´étude Pharmacovigilance des combinaisons thérapeutique à base d´Artémisinine en Afrique [15,16]. Toutefois, seuls les échantillons collectés au Jour 0, avant l´administration du traitement ont été utilisé pour cette investigation.

Analyse moléculaires: l´ADN parasitaire a été extrait des confettis en utilisant les Kits QIamp DNA miniKit (Qiagen, Germany) en suivants les instructions du fabricant. Le génotypage du bloc 2 de msp1 et du bloc 3 de msp2 s´est fait par la technique de la PCR nichée selon un protocole décrit antérieurement [3,17]. Ensuite, l´amplification des gènes Pfcrt et Pfmdr1 s´est fait par PCR nichée suivi d´une digestion des produits PCR par les enzymes de restriction. L´enzyme de restriction Apo I (NEB) a été utilisé pour le point Pfcrt K76T et Afl III (NEB) a été utilisé pour le point Pfmdr1 N86Y [18]. Les fragments d´ADN ont été séparés par électrophorèse sur gel d´agarose contenant du Bromure d´Ethidium. La révélation des fragments s´est faite au moyen d´un Trans illuminateur Ultraviolet.

Analyse des données: les résultats des analyses moléculaires ont été saisis sur un fichier Excel. Les données ont ensuite été analysées avec le logiciel R [19]. Un échantillon était considéré comme appartenant à une famille allélique donnée s´il y avait l´apparition d´au moins une bande suite à l´amplification de l´ADN de cet échantillon avec les amorces spécifiques de la famille en question. En cas d´absence de bande, l´échantillon était considéré comme n´étant pas de cette famille allélique. Les génotypes de Pfcrt et Pfmdr1 ont été déterminés sur la base de la présence ou l´absence de l´allèle sauvage/mutant au niveau des loci. Le test de Chi-carrée était utilisé pour comparer les proportions avec un seuil de significativité de 5%.

Considérations éthiques: tous les participants ont donné leur consentement libre et éclairé avant l´inclusion dans l´étude. L´étude a été conduite en respectant les principes de bonnes pratiques cliniques et la règlementation en vigueur en matière d´essai clinique au Burkina Faso. Le protocole de l´étude a été approuvé par le comité d´éthique institutionnelle du Centre Muraz et par le comité d´éthique pour la recherche en Santé du Ministère de la Santé du Burkina Faso.

Résultats

Au total, 680 patients ont été inclus dans l´étude d´évaluation de l´efficacité thérapeutique d´ASAQ comparée à AL. Tous les échantillons disponibles (n=676) ont été considérés de façon systématique pour cette investigation (indépendamment de l´issu du traitement avec ASAQ ou AL). Les échantillons de 672 (99,4%) participants ont été génotypés avec succès pour msp1 et msp2 et pour Pfcrt et Pfmdr1. La prévalence de la mutation Pfcrt K76T était de 20,6% (120/581) et celle de Pfmdr1 N86Y était de 08,1% (49/604). Les échantillons portant des infections mixtes avec à la fois l´allèle sauvage et l´allèle mutant étaient au nombre de 91 (13,5%) pour Pfcrt et de 68 (10,1%) pour Pfmdr1.

Le Tableau 1 illustre la relation entre la diversité génétique de P. falciparum et les mutations au niveau du gène Pfcrt. Aucune différence statistiquement significative de la présence de l´allèle sauvage ou mutant du gène Pfcrt selon le profile polymorphique des gènes msp1 n´a été observée (Tableau 1). Par contre, la prévalence de l´allèle mutant du gène Pfcrt était significativement plus élevée dans les infections monoclonales comparées aux infections polyclonales avec msp1 (χ2=12,02 p=0,001, Figure 1 A) et msp2 (χ2=17,91 p<0,001, Figure 1 C) respectivement. Le Tableau 1 illustre la relation entre le polymorphisme de msp2 et la mutation K76T du gène Pfcrt. Aucune variation significative de la prévalence de l´allèle mutant ou de l´allèle sauvage de Pfcrt entre familles allélique de msp2 n´a été observée (Tableau 2). La relation entre la variabilité allélique de msp1 et la mutation Pfmdr1 N86Y est représentée dans le Tableau 3.

Tableau 1

relation entre la variabilité allélique de msp1 et la mutation Pfcrt K76T

Profile polymorphique de msp1	K1N=142	MAD20 N=52	RO33N=50	K1MAD20N=94	K1-RO33N=103	RO33MAD20N=16	K1-MAD20-RO33 N=124
Pfcrt K76 n(%)	101(71,1)	37(71,1)	40(80,0)	76(80,8)	81(78,6)	16(100)	110(88,7)
Pfcrt T76 n(%)	41(28,9)	15(28,9)	10(20,0)	18(19,2	22(21,4)	0(0)	14(11,3

Figure 1

prévalence des souches sauvages et mutantes de Pfcrt et Pfmdr1 au niveau des infections monoclonales versus infections polyclonales; la couleur rouge représente les souches mutantes et la couleur bleue représente les souches sauvages

Tableau 2

relation entre la variabilité allélique de msp2 et la mutation Pfcrt K76T

Profile polymorphique de msp2	3D7 N=191	FC27N=85	3D7-FC27 N=305
Pfcrt K76 (n (%))	140(73,3)	64(75,3)	257(84,3)
Pfcrt T76 (n (%))	51(26,7)	21(24,7)	48(15,7)

Tableau 3

relation entre la variabilité allélique de msp1 et la mutation Pfmdr1 N86Y

Profile polymorphique de msp1	K1 N=141	MAD20 N=56	RO33 N=54	K1MAD20 N=110	K1-RO33 N=100	RO33MAD20 N=19	K1-MAD20-RO33 N=124
Pfmdr1 N86 n(%)	125(88,6)	44(78,6)	47(87,0)	107(97,3)	93(93,0)	18(94,7)	121(97,6)
Pfmdr1 Y86 n(%)	16(11,4)	12(21,4)	7(13,0)	3(2,7)	7(7,0)	1(5,3)	3(2,4)

Aucune famille allélique de msp1 n´était spécifiquement associée à la présence de mutation Pfmdr1 N86Y. Tout comme au niveau du gène Pfcrt, la fréquence de l´allèle mutant 86Y était plus élevée dans les infections monoclonales que dans les infections polyclonales avec msp1 (χ2=19,73 p<0,0001, Figure 1 B) et msp2 (χ2=9,72 p=0,002, Figure 1 D) respectivement.

Le Tableau 4 présente la relation entre famille allélique de msp2 et la mutation Pfmdr1 N86Y. A ce niveau également, aucune famille allélique de msp2 n´était spécifiquement associée à la présence de mutation Pfmdr1 Y184F (Tableau 4).

Tableau 4

relation entre la variabilité allélique de msp2 de P. falciparum et la mutation Pfmdr1 N86Y

Profile polymorphique de msp2	3D7 N=196	FC27 N=90	3D7-FC27 N=318
Pfmdr1 N86 n(%)	180(91,8)	77(85,6)	298(93,7)
Pfmdr1 Y86 n(%)	16(8,2)	13(14,4)	20(6,3)

Discussion

La relation entre la diversité génétique de P. falciparum et la résistance aux antipaludéens est cruciale mais reste jusque-là un phénomène non clairement élucidé. Dans cette étude nous avons exploré la susceptibilité de certaines variantes de msp1 et de msp2 à développer des mutations au niveau des gènes Pfcrt et Pfmdr1. En effet, les mutations aux niveaux de ces gènes représentent une sorte de mécanismes d´adaptation parasitaire pour survire dans les conditions environnementales défavorables en l´occurrence la pression médicamenteuse. Par exemple, l´utilisation de la chloroquine pour le traitement du paludisme avait entrainé une forte prévalence des souches mutantes au Burkina Faso. Son remplacement par les CTA dans les années 2005 s´est accompagné d´une diminution drastique de la prévalence de ces souches mutantes avec un retour progressif des souches sauvages de Pfcrt et Pfmdr1 qui sont chloroquino sensibles [20].

Dans l´ensemble, aucune famille allélique de msp1 ou de msp2 n´était spécifiquement associée à une susceptibilité accrue de porter des souches mutantes de Pfcrt ou de Pfmdr1. Cela voudrait dire que les facteurs favorisants l´apparition de ces mutations dont la pression médicamenteuse affectent toutes les variantes de msp1 et de msp2 de la même manière. Ce résultat était attendu, puisque l´inversion du profile des souches en termes de résistance induite par le changement de la politique de traitement ne s´est pas accompagné d´un changement de distribution des profils polymorphiques de msp1 et de msp2. Avant ou après le changement de la politique de traitement, la même distribution a été toujours observée avec une prédominance de la famille allélique K1, suivie de MAD20 et de RO33 pour msp1. Pour msp2, la famille allélique 3D7 a toujours été dominant par rapport à FC27 au Burkina Faso [4,21].

Nos résultats montrent également que les souches mutantes étaient significativement plus importantes dans les infections monoclonales que dans les infections multi-clonales. Nous postulons que cela résulte de la compétition entre souches génétiquement différentes du parasite au sein de l´hôte et cette compétition serait en défaveur des souches mutantes [2]. Cette compétition entre souches distinctes avec effet suppresseur pour les souches mutantes avait aussi été observée dans le modèle animal [22]. En effet, le fait que les souches mutantes soient moins compétitives pourrait s´expliquer par le coût de cette mutation conférant la résistance [23,24]. Il a été démontré que l´aptitude des parasites à survivre en l´absence de traitement se réduisait lorsqu´ils développaient des mutations conférant la résistance comparativement aux souches sauvages [23,24]. La distinction des souches parasitaires par gel d´agarose dans le cadre de cette étude ne permettait pas de déterminer la contribution de chaque génotype parasitaire dans les infections mixtes, ce qui est une limite de notre étude. Par conséquent, le constat en rapport avec la disparition des souches mutantes dans les infections multi-clonales mérite des investigations plus poussées visant à déterminer avec précision les facteurs défavorisant.

Conclusion

Cette étude fournit un aperçu global de la relation entre le polymorphisme de P. falciparum et les mutations au niveau des gènes de résistance Pfcrt et Pfmdr1. Aucune famille allélique des gènes msp1 et msp2 n´avait une susceptibilité accrue à développer des mutations au niveau des gènes de résistance. Par contre les souches mutantes étaient significativement plus importantes dans les infections monoclonales que dans les infections multi clonales. Ces données contribueront sans doute à améliorer les connaissances sur la biologie du parasite.

Etat des connaissances sur le sujet

P. falciparum est une espèce extrêmement polymorphe;

Les gènes des protéines de surface du mérozoïte (msp1 et msp2) sont couramment utilisés pour distinguer les souches parasitaires;

Les mutations au niveau des gènes Pfmdr1 et Pfcrt sont associées à la résistance aux amino-4-quinoléines.

Contribution de notre étude à la connaissance

Aucune famille allélique des gènes msp1 et msp2 n´avait une susceptibilité accrue à développer des mutations au niveau des gènes de résistance;

Les souches mutantes des gènes de résistance Pfcrt et Pfmdr1 étaient significativement plus importantes dans les infections monoclonales que dans les infections multi clonales.