Influence of Consumption of Orange Juice (Citrus Sinensis) on Cardiac Remodeling of Rats Submitted to Myocardial Infarction.

BACKGROUND: Orange juice (OJ) is rich in polyphenols with anti-inflammatory and antioxidant properties. After myocardial infarction (MI), complex changes occur in cardiac structure and function, which is known as cardiac remodeling (CR). Oxidative stress and inflammation can modulate this process. We hypothesized that the consumption of OJ attenuates the CR after MI.
OBJECTIVES: To evaluate the influence of OJ on CR after MI by analysis of functional, morphological, oxidative stress, inflammation, and energy metabolism variables.
METHODS: A total of 242 male rats weighing 200-250 g were submitted to a surgical procedure (coronary artery ligation or simulated surgery). Seven days after surgery, survivors were assigned to one of the four groups 1) SM, sham animals with water and maltodextrin (n= 20); 2) SOJ, sham animals with OJ (n= 20); 3) IM, infarcted animals with water and maltodextrin (n= 40); and 4) IOJ, infarcted animals with OJ (n = 40). Statistical analysis was performed by the two-way ANOVA supplemented by Holm-Sidak. Results are presented as mean ± standard deviation, the level of significance adopted was 5%.
RESULTS: After 3 months, MI led to left ventricular (LV) hypertrophy, with systolic and diastolic dysfunction, and increased oxidative stress and inflammatory mediators. OJ intake reduced LV cavity and improved systolic and diastolic function. The OJ animals presented lower activity of glutathione peroxidase and higher expression of heme-oxygenase-1 (HO-1).
CONCLUSION: OJ attenuated CR in infarcted rats and HO-1 may be play an important role in this process.

Introdução

O nome polifenóis , ou compostos fenólicos , refere-se a um grande grupo de moléculas encontradas em verduras, frutas, cereais, chá, café, cacau, soja, e suco de fruta. [1] Esses compostos têm sido estudados devido ao seu potencial efeito biológico na prevenção e tratamento de diferentes doenças. [2 , 3]

Em revisão da literatura, Hyson mostrou que o suco da fruta, definido como suco puro ou 100% suco, reteve a maioria dos nutrientes e fitoquímicos da fruta íntegra e, portanto, pode ser importante no benefício e proteção da saúde humana. [4] O suco de laranja (SL) é fonte de compostos fenólicos na forma de diferentes flavonoides. O principal flavonoide de interesse é a hesperidina e sua forma hidrolisada, a hesperetina. [5] O interesse na pesquisa sobre as propriedades do SL aumentou devido à sua ação anti-inflamatória e antioxidante nas doenças crônicas. [6]

Por exemplo, na lesão miocárdica, suplementos de antioxidantes podem ter efeito benéfico na remodelação cardíaca (RC). Em estudos usando modelo de infarto do miocárdio (IM), compostos bioativos presentes no alecrim, tomate, e chá verde, e antioxidantes tais como ácido ascórbico, quercetina, alfa-tocoferol, e vitamina A mostram efeito protetor contra a RC. [1 , 3 , 7 - 10]

A doença cardíaca isquêmica, incluindo o IM, é uma causa importante de insuficiência cardíaca e morte em todo o mundo. Após o IM, mudanças complexas no ventrículo esquerdo (VE) podem causar alterações no tamanho, na massa, e na geometria do coração, e na função cardíaca. [11 , 12] Tais mudanças são definidas como RC e podem levar à insuficiência cardíaca e aumento na mortalidade. [13] Muitos fatores podem estar envolvidos na RC, incluindo estresse oxidativo, inflamação, fibrose, e apoptose. [14 , 15]

No IM, a isquemia inicia a geração de espécies reativas de oxigênio (EROS). As EROS danificam diretamente as membranas celulares, ativam a resposta inflamatória, e levam à morte celular. Elas também podem atuar como sinais de transdução, estimulando o fator nuclear kappa B (NF-κB), o qual estimula a síntese de citocinas pró-inflamatórias. [14 - 16] Além disso, o sistema KEAP-1/Nrf2 (proteína 1 associada a ECH tipo Kelch/fator nuclear eritroide 2 relacionado ao fator 2) poderia ser ativado durante o estresse oxidativo celular, e exercer papel crítico na homeostase redox. Esse é um mecanismo universal que atua nos genes-alvo do Nrf2, conhecidos como elementos de resposta antioxidante. A glutationa peroxidase (GPx) e a heme-oxigenase-1 (HO-1) são exemplos de proteínas reguladas por esse sistema. [17]

Estratégias terapêuticas para atenuar a RC após o IM têm sido muito estudadas. [18 , 19] Bloqueadores de aldosterona, inibidores da enzima conversora de angiotensina e betabloqueadores são algumas dessas estratégias. [20] Nesse contexto, os compostos bioativos de produtos naturais, com propriedades cardioprotetoras, tais como os flavonoides, podem ser importante adjuvante no tratamento de IM. Por outro lado, estudos mostram que um foco em padrões alimentares e dietéticos, e não em nutrientes ou fitoquímicos individuais, é melhor para a saúde cardiometabólica. [21] Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a influência da ingestão de SL sobre a RC após IM.

Materiais e métodos

Protocolo experimental

Todos os experimentos e procedimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes para o cuidado e o uso de animais em laboratório dos Institutos Nacionais da Saúde (NIH), e aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP, São Paulo, Brasil (1126/2015). Foram utilizados 242 ratos Wistar machos, pesando 200 - 250 g. O IM foi induzido por ligação da artéria coronária, como descrito previamente. [22 , 23]

Após a cirurgia, os animais foram colocados em caixas com seis animais cada. Sete dias depois, o primeiro estudo ecocardiográfico foi realizado para avaliar a eficácia do procedimento cirúrgico. [24] Com base nesse ecocardiograma, os animais foram alocados aleatoriamente em caixas com dois animais cada, para receberem SL ou uma solução de maltodextrina (M). Os grupos foram: 1) SM, animais sham que receberam solução de M (n=20); 2) SSL, animais sham que receberam SL (n=20); 3) IM, animais com infarto que receberam solução de M; e 4) ISL, animais com infarto que receberam SL (n=40). O tamanho da amostra utilizada baseou-se em outros estudos realizados em nosso laboratório. [3 , 8 , 25] O número de ratos no grupo infartado foi maior, uma vez que a mortalidade esperada para esses animais durante o período experimental é de aproximadamente 50%. Além disso, somente animais com área infartada do VE maior que 30% foram incluídos no estudo. [24]

O alimento era oferecido à vontade ( ad libitum ). Os animais foram tratados durante três meses, e a mortalidade foi avaliada nesse período ( Figura 1 dos dados suplementares). Os ratos foram acondicionados em temperatura controlada (22 ± 2°C), com um ciclo claro-escuro de 12 horas.

Figura 1

– Expressão de fator nuclear eritroide 2 relacionado ao fator 2 (Nrf2) e heme-oxigenase-1 (OH-1) em ratos sham e ratos infartados por Western blot. Gráfico de barras mostrando a expressão de Nrf-2 e de HO-1 em cada grupo (A) expressão do Nrf-2 e Western blot representativo; tamanho da amostra: 8 animais em cada grupo; (B) expressão de HO-1 e Western blot representativo; tamanho da amostra: SM = 5; SSL = 6; IM = 5; ISL = 5; GAPDH gliceraldeído -3-fosfato-desidrogenase; dados expressos em média ± DP. p(I): valor p entre animais infartados e não infartados; p(SL): valor p entre animais que receberam maltodextrina e animais que receberam suco de laranja; p(IxSL): representa o valor de p quando houve interação entre fatores relacionados a infarto e fatores relacionados ao consumo de suco de laranja

Ligação da artéria coronária

O IM foi induzido por ligação da artéria coronária, conforme descrito previamente. [22 , 23] Em resumo, os ratos foram anestesiados com cetamina (70mg/Kg) e xilazina (1mg/Kg). Após toracotomia esquerda, o coração foi retirado. O átrio esquerdo foi retraído para facilitar a ligação da artéria coronária esquerda, com fio mononylon 5.0 entre a saída da artéria pulmonar e o átrio esquerdo. O coração foi recolocado no tórax, os pulmões inflados com pressão positiva, seguido por fechamento da toracotomia. Também se criou um grupo sham, em que os animais foram submetidos à cirurgia sem oclusão coronária. Após o efeito da anestesia, os ratos foram medicados oralmente com Metamizol sódico (30 mg / kg Dipirona®, Biovet, Vargem Grande Paulista, São Paulo, Brasil).

Suco de laranja

Os grupos SSL e ISL receberam suco de laranja em regime ad libitum . Os grupos controles (SM e IM) receberam uma solução de água e M na concentração de 100g/L. A solução de M foi dada aos animais controle para fornecer a mesma quantidade de carboidratos que o SL. O tratamento foi iniciado sete dias após a cirurgia. O SL e as soluções de M eram trocadas a cada 24 horas, e o consumo foi monitorado diariamente. A composição nutricional do SL é apresentada nos dados suplementares.

Estudo ecocardiográfico

Após três meses, todos os ratos foram pesados e avaliados por ecocardiografia transtorácica. [26 , 27] Para o estudo ecocardiográfico, os ratos foram anestesiados com injeção intramuscular de solução de cetamina (50 mg/kg) e xilazina (1 mg/kg). As medidas foram feitas pelo mesmo observador, seguindo o método de última geração recomendado pela Sociedade Americana de Ecocardiografia e a Associação Europeia de Ecocardiografia. [28] O ecocardiograma foi realizado com o sistema General Electric Vivid S6 System (GE Medical Systems, Tirat Carmel, Israel), com sonda phased array de 5 a 12-MHz.

Após o ecocardiograma, os animais foram eutanasiados com uma alta dose de pentobarbital, e os corações foram removidos. O VE foi isolado e amostras foram retiradas e imediatamente congeladas e armazenadas a -80 o C. Um corte transversal do VE foi separado e fixado com formalina tamponada 10%, e embebidos em parafina para estudo histológico.

Análise morfométrica

Cortes de cinco micrômetros de espessura foram marcados com hematoxilina e eosina para cálculo do tamanho do infarto conforme descrito anteriormente. Todos os animais foram incluídos na análise morfométrica. Após o cálculo do tamanho do infarto, os animais infartados com menos de 30% do VE de área infartada foram excluídos das análises. Todas as imagens foram coletadas com câmera de vídeo acoplada ao microscópio (Leica); as imagens foram analisadas usando o software Image-Pro Plus 3.0 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD).

Hidroperóxido lipídico no tecido cardíaco, atividade de enzima antioxidante, e metabolismo energético cardíaco

Amostras do VE (100mg) foram usadas para medidas de proteína total e hidroperóxido lipídico (HL), e atividade das seguintes enzimas antioxidantes – GPx (E.C.1.11.1.9), superóxido dismutase (SOD, E.C.1.15.1.1), e catalase (E.C.1.11.1.6). O metabolismo energético cardíaco foi avaliado pela atividade da 3-hidroxiacil coenzima-A desidrogenase (OHADH; E.C.1.1.1.35.), fosfofrutoquinase (PFK; E.C.2.7.1.11), lactato desidrogenase (LDH; E.C.1.1.1.27), piruvato desidrogenase (E.C.1.2.4.1), citrato sintase (CS; E.C.4.1.3.7.), e trifosfato de adenosina (ATP) sintase (EC 3.6.3.14). [3 , 9] Os testes de atividade enzimática foram realizados a 25 o C com um leitor de microplaca (µQuant-MQX 200-EONC com o software Gen5 2.0 conectado a um sistema de controle; Bio-Tec Instruments, VT, EUA). Todos os reagentes foram obtidos de Sigma (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).

Mediadores inflamatórios

Concentrações de interferon-γ (IFN-γ) e interleucina-10 (IL-10) nas amostras do VE foram determinadas por ELISA seguindo-se as instruções do fabricante (R&D Systems, Minneapolis, MN).

Western blot

O teste de Western blot foi realizado para analisar a expressão proteica da GPx-1 (ab 22604 - Abcam Inc, Cambridge), HO-1 (ab13248 - Abcam Inc, Cambridge), NF-kB total e fosforilada (NF-kB- sc 8008 e sc 3302- Santa Cruz Biotechnology, Inc, Europa), e sirtuína-1 (Sirt-1- sc 15404-Santa Cruz Biotechnology, Inc, Europa), no extrato celular total. Para determinar o fator nuclear eritroide 2 (Nrf-2-sc 722-Santa Cruz Biotechnology Inc, Europe), amostras do VE foram extraídas utilizando-se tampão de extração nuclear. [9] As amostras foram separadas em gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) a 10%, e as proteínas transferidas para uma membrana de nitrocelulose. A membrana foi bloqueada com leite em pós desnatado (5%) e em seguida incubada com anticorpo primário e anticorpo secundário. Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) (sc 32233, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Europa) foi usada para normalização das proteínas.

Análise estatística

A normalidade dos dados foi verificada pelo teste de Kolmogorov–Smirnov. Os dados foram apresentados como média ± desvio padrão (DP). As variáveis com distribuição normal foram analisadas pelo teste de variância com dois fatores, que fornece três valores p: 1) fator 1, presença de IM (I); 2) fator 2, ingestão de SL (SL); e 3) interação entres os fatores I e SL. Na análise de variância com dois fatores, assume-se a normalidade da distribuição dos dados. Se uma variável não se ajusta à distribuição normal, realiza-se transformação dos dados. O teste t de Student não pareado foi usado para análise do ecocardiograma inicial. O teste do qui-quadrado foi usado para avaliar mortalidade, e o teste t de Student não pareado foi usado para avaliar o tamanho do infarto nos animais infartados. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas se o valor de p fosse inferior a 0,05. As análises estatísticas foram realizadas usando o programa SigmaPlot para Windows 12.0 (Systat Software Inc., San Jose, CA).

Resultados

O ecocardiograma inicial mostrou que os animais dos dois grupos de animais infartados não apresentaram diferenças na área sistólica e diastólica ou no tamanho do infarto ( Tabela 1 do material suplementar).

Tabela 1

– Tamanho do infarto, ecocardiograma final, e análise morfométrica

Variável	SM (n = 19)	SSL (n = 20)	IM (n = 9)	ISL (n = 9)	p (I)	p (OJ)	p (I×OJ)
Peso corporal (g)	454±47,9	480±56,3	443±66,6	462±25,9	0,338	0,135	0,852
FC (bpm)	290±30,9	296±34,9	268±26,7	324±30,0 aB	0,756	0,001	0,009
AE/Ao	1,32±0,09	1,21±0,09 b	1,78±0,21 A	1,42±0,18 Ba	<0,001	<0,001	0,003
DDVE/BW (mm/kg)	15,9±1,31	15,0±1,79	22,1±2,70	20,2±2,10	<0,001	0,019	0,398
DSVE/BW (mm/kg)	6,67±0,87	6,02±0,89	15,1±2,70	12,8±2,70	<0,001	0,007	0,556
IMVE (g/kg)	1,63±0,22	1,56±0,27	2,62±0,60	2,36±0,36	<0,001	0,124	0,640
FAC (%)	67,3±8,28	67,4±8,27	34,5±8,28	36,6±8,28	<0,001	0,661	0,707
Onda E (ms)	79,7±11,3	81,4±7,16	89,1±10,8	80,7±19,2	0,204	0,325	0,139
Onda A (ms)	49,9±8,28	52,6±7,16	42,5±16,5	62,7±24,9 a	0,730	0,004	0,025
S´ média (cm/s)	5,78±0,04	5,82±0,31	4,60±0,30	5,01±0,3	<0,001	0,028	0,078
E´ média (cm/s)	5,62±0,44	5,82±0,45	4,23±0,60	4,77±0,60	<0,001	0,054	0,357
A´ média (cm/s)	3,67±0,44	4,02±0,45	4,54±0,90	5,55±1,20	0,058	0,058	0,28
Razão E/E´	13,7±3,49	14,1±1,79	21,3±3,30 A	16,9±2,40 Ba	<0,001	0,002	0,003
Peso VE/peso corporal (mg/g)	1,85±0,13	1,93±0,27	2,13±0,42	2,10±0,15	0,005	0,550	0,822
Peso VD/peso corporal (mg/g)	0,46±0,09	0,43±0,05	0,65±0,24	0,59±0,27	<0,001	0,294	0,776

Dados expressos em média ± desvio padrão. n: número de animais incluídos em cada grupo; SM: animais sham que receberam maltodextrina; SSL: animais sham que receberam suco de laranja; IM: animais infartados que receberam maltodextrina; ISL: animais infartados que receberam suco de laranja; FC: frequência cardíaca; AE: diâmetro do átrio esquerdo; Ao: diâmetro da aorta; DDVE: diâmetro diastólico final do ventrículo esquerdo; DSVE: diâmetro sistólico final do ventrículo esquerdo; IMVE: índice da massa do ventrículo esquerdo (massa do ventrículo esquerdo/peso corporal); FAC: fractional area change (variação da área do ventrículo esquerdo); onda E: velocidade de movimentação do anel mitral no início da diástole; onda A: velocidade de movimentação do anel mitral no final da diástole; média S´: velocidade média de movimentação do anel mitral septal e lateral; A´ e E´ médias: velocidade média de movimentação do anel mitral septal e lateral na diástole (E’: início e A’: final); VE: ventrículo esquerdo/ VD: ventrículo direito; pI:valor p do efeito do infarto; pSL: valordo efeito do consumo de suco de laranja. pIxSL: valor p da interação.Números em negritorepresentam efeitos estatisticamente significativos. : IM≠ISL; : SM≠SSL; : SM≠IM e SSL≠ISL.

Durante os três meses de experimento, a mortalidade foi de 5% no grupo SM (um rato morreu), 0% no grupo SSL, 22,5% no grupo IM (9 ratos morreram), e de 22,5% no grupo ISL (9 ratos morreram). Quando todos os grupos foram analisados, observou-se uma diferença na mortalidade entre os grupos (p=0,04). Contudo, a mortalidade não foi diferente entre os grupos infartados (p=0,836). Após o período de consumo de SL, realizou-se a eutanásia dos animais sobreviventes. Em seguida, efetuou-se a análise histológica do VE dos animais infartados para verificar o tamanho do infarto ( Figura 1 do material suplementar) (IM= 40,1±7,41%; ISL=38,1±5,76%; p= 0,528). O peso corporal final não foi diferente entre os grupos ( Tabela 1 ).

Efeito do IM nos corações dos ratos

O IM levou à RC. Quanto aos dados morfológicos, o IM causou aumento no diâmetro diastólico do VE/peso corporal final, diâmetro sistólico do VE /peso corporal final, diâmetro do átrio esquerdo/aorta, índice de massa do ventrículo esquerdo (IMVE), peso do VE/peso corporal final Tabela 1 ), e espessura da parede posterior do VE/peso corporal final, espessura da parede do septo interventricular/peso corporal final, e diâmetro atrial esquerdo/peso corporal final ( Tabela 1 do material suplementar). Essas mudanças caracterizam o aumento das cavidades esquerdas e hipertrofia do VE. O IM afetou a função cardíaca sistólica, conforme os valores mais baixos da variação de área do VE ( fractional area change , FAC) e S’ média ( Tabela 1 ), encurtamento endocárdico, e fração de ejeção ( Tabela 2 do material suplementar). A função diastólica também foi afetada, indicado por uma redução na E’ média ( Tabela 1 ), tempo de desaceleração da onda E, E’ lateral, e E’ septal ( Tabela 2 do material suplementar), e aumento na onda A, média da A’, razão E/E’ ( Tabela 1 ), índice de Tei, razão E/A, tempo de relaxamento isovolumétrico ajustado pela frequência cardíaca, A’ lateral e A’ septal.

Tabela 2

– Marcadores de estresse oxidativo e marcadores inflamatórios

Variável	SM (n = 8)	SSL (n = 8)	IM (n = 4)	ISL (n = 4)	p (I)	p (OJ)	p (I×OJ)
LH (nmol/g)	209±28,3	215±28,3	256±28,0	277±26,0	<0,001	0,293	0,573
Catalase (µmol/g)	64,4±6,79	61,8±7,07	55,4±7,00	58,1±7,60	0,056	0,993	0,404
SOD (nmol/mg)	12,9±2,83	13,5±2,83	18,7±1,80	17,1±1,40	<0,001	0,639	0,355
Atividade da GSH-px (nmol/mg)	62,5±6,51	50,2±7,07	58,0±7,00	45,3±6,00	0,134	<0,001	0,951
Expressão da GSH-px (unidade arbitrária)	7,56±7,39	7,62±10,8	6,63±5,82	6,37±3,78	0,600	0,649	0,546
IL-10 (pg/mg)	23,9±7,92	39,6±13,0 b	42,0±9,60 A	34,1±7,60	0,135	0,352	0,008
IFN-γ (pg/mg)	7,1±2,26	13,2±3,96 b	17,7±6,80 A	11,2±2,00 a	0,037	0,928	0,003
NF-κB (unidade arbitrária)	7,03±11,0	4,61±4,98	3,40±3,12	6,80±4,00	0,942	0,330	0,266
p NF-κB (unidade arbitrária)	5,40±10,2	3,18±2,40	3,28±3,12	5,22±3,34	0,587	0,084	0,980
Sirt 1 (unidade arbitrária)	1,81±0,82	2,34±1,41	2,42±1,44	1,65±0,56	0,925	0,813	0,203

Dados expressos em média ± desvio padrão. n: número de animais incluídos em cada grupo; SM: animais sham que receberam maltodextrina; SSL: animais sham que receberam suco de laranja; IM: animais infartados que receberam maltodextrina; ISL: animais infartados que receberam suco de laranja; HL: hidroperóxido lipídico; SOD: superóxido dismutase; GSH-px: glutationa peroxidase; IL-10: interleucina-10; INF-γ: interferon- γ; NF-κB: fator nuclear κB total; e p NF-κB: fator nuclear κB fosforilado; Sirt 1: sirtuína 1. pI:valor p do efeito do infarto; pSL: valor

O IM também aumentou o estresse oxidativo, demonstrado pelo aumento na atividade de LH e SOD ( Tabela 2 ), menor expressão da HO-1 (Figura 1A), e ocorreu a menor expressão do Nrf-2 (Figura 1B). Os mediadores inflamatórios IL-10 e INF-γ foram mais altos no IM ( Tabela 2 ), e não houve diferença nos níveis de NF-κB ou Sirt-1 entre os animais infartados e não infartados ( Tabela 2 e Figura 2 do material suplementar). Observou-se maior oxidação de carboidratos que de ácidos graxos, e menor metabolismo energético, demonstrados por maior atividade de LDH e PFK, e menor atividade de OHADH, CS, e ATP sintase. Não foi observada diferença para a atividade do piruvato desidrogenase ( Tabela 3 ).

Figura 2

– Esquema ilustrativo dos principais achados do estudo.

Tabela 3

– Enzimas envolvidas no metabolismo energético cardíaco

Variável	SM (n = 8)	SSL (n = 8)	IM (n = 4)	ISL (n = 4)	p (I)	p (SL)	p (I×SL)
PFK (nmol/g)	128±17,0	112±24,6	139±26,0	178±26,0 aB	<0,001	0,257	0,011
LDH (nmol/mg)	88,5±18,7	82,6±18,1	111±18,6	134±16,	<0,001	0,320	0,092
PDH (nmol/g)	344±53,7	385±31,1	345±100	341±42,0	0,386	0,461	0,376
OHADH (nmol/mg)	33,2±6,22	33,9±6,22	23,8±8,40	24,5±2,80	0,003	0,798	0,992
CS (nmol/mg)	50,0±6,22	49,4±6,51	34,5±7,40	40,5±4,80	<0,001	0,350	0,254
ATP sintase (nmol/mg)	21,0±3,11	27,8±5,37	11,4±1,20	15,9±4,40	<0,001	0,005	0,532

Dados expressos em média ± desvio padrão. n: número de animais incluídos em cada grupo; SM: animais sham que receberam maltodextrina; SSL: animais sham que receberam suco de laranja; IM: animais infartados que receberam maltodextrina; ISL: animais infartados que receberam suco de laranja; PFK: fosfofrutoquinase; LDH: lactato desidrogenase; PDH: piruvato desidrogenase; OHADH: 3-hidroxiacil coenzima-A desidrogenase; CS: citrato sintase; ATP: adenosina trifosfato. pI: valor p do efeito do infarto; pSL: valor

Efeito do consumo de SL sobre o coração

A ingestão de SL causou redução da cavidade do VE, com valores mais baixos do diâmetro diastólico final do VE (DDVE) e diâmetro sistólico final do VE (DSVE); melhorou a função sistólica, com valores mais altos de S’ médio; e melhorou a função diastólica, com menor diâmetro do átrio esquerdo ajustado para o diâmetro da aorta ( Tabela 1 ) [29] após o IM. Não foram observadas diferenças para outras variáveis ecocardiográficas ( Tabela 1 ). As outras variáveis relativas à função não foram valorizadas devido à elevada frequência cardíaca [30] no grupo SL ( Tabela 2 do material suplementar).

Além disso, os animais que consumiram SL apresentaram atividade mais baixa da GSH-Px ( Tabela 2 ). Não foram observadas diferenças para atividade de LH, SOD, catalase, ou expressão de GSH-Px ( Tabela 2 e Figura 2 do material suplementar).

Quanto aos mediadores inflamatórios, o grupo SSL apresentou IL-10 e INF-γ mais elevados em comparação ao grupo SM ( Tabela 2 ). O grupo ISL apresentou valores de INF-γ mais baixos que o grupo IM ( Tabela 2 ). Não houve diferenças para NF-κB ou Sirt-1 entre os animais que consumiram e os que não consumiram SL ( Tabela 2 e Figura 2 do material suplementar).

Observou-se melhora no uso de substratos nos animais que consumiram SL. Observamos valores mais altos para atividade da PFK no grupo ISL em comparação ao grupo IM, e atividade mais alta da ATP sintase nos animais que consumiram SL. Não se observou diferenças na atividade de outras enzimas do metabolismo energético entre os grupos ( Tabela 3 ).

Um resultado interessante que os animais que consumiram SL apresentaram maior expressão de HO-1 (Figura 1A), apesar de não terem apresentado diferença na expressão de Nrf2 (Figura 1B).

Discussão

No presente estudo, IM induzido por ligação da artéria coronária em ratos resultou em hipertrofia do VE e disfunção diastólica, o que foi compatível com alterações observadas no infarto crônico. [11] Nossos dados também mostraram aumento no estresse oxidativo e marcadores inflamatórios, bem como alterações no metabolismo energético, com deficiência na β-oxidação de ácidos graxos. Essas alterações caracterizam o processo de RC. [31 - 33] Também observamos redução na expressão de Nrf-2 e HO-1. Na fase crônica do IM, a via do Nrf2 pode estar reduzida por expressão anormal do gene-alvo do Nrf2, afetando a manutenção da homeostase redox via enzimas medidas por elementos de resposta antioxidante. [34] Em estudo prévio conduzido em nosso laboratório com modelo de IM, observamos expressão mais baixa de Nrf2 e HO-1. [3] Esses achados sugerem ou uma menor expressão ou um maior catabolismo da proteína Nrf2, levando, assim, à menor síntese de HO-1.

No presente estudo, o consumo de SL resultou na atenuação da RC nos animais infartados. Essa atenuação pode ser observada na diminuição da cavidade do VE (DDVE e DSVE), e na melhora da função sistólica, caracterizada pelo aumento no S’ médio, [35] e na função diastólica (menor diâmetro do átrio esquerdo). No estudo de Yu et al., [36] os ratos infartados por ligação da artéria coronária esquerda, tratados com hesperidina por quatro semanas, apresentaram DDVE e DSVE mais baixos e melhor função sistólica que os animais infartados. Esses dados são similares aos nossos, e podem indicar o efeito da hesperidina do SL sobre o processo de RC. Em outro estudo, outro composto fenólico, a hesperetina, também apresentou efeito sobre o coração. Em um modelo de sobrecarga de pressão, Deng et al., [37] encontraram valores mais baixos de DDVE e de DSVE oito semanas após a administração de hesperetina.

O IM leva a desequilíbrio entre a produção de EROS e defesas antioxidantes, levando a estresse oxidativo. Após isquemia, algumas EROS danificam membranas celulares, iniciando o processo de peroxidação lipídica. [38] Por exemplo, Bagatini et al., [39] descreveram aumento na peroxidação lipídica em pacientes com IM. Nossos resultados também mostraram maior concentração de hidroperóxidos lipídicos nos animais infartados em comparação aos animais não infartados. [40] A enzima SOD é a primeira defesa do organismo contra EROS. Nosso estudo mostrou que os animais infartados, em comparação aos não infartados, apresentaram maior atividade da enzima SOD, conforme descrito anteriormente. [3 , 25] Em relação ao consumo de SL, observamos que os animais que consumiram SL apresentaram menor atividade da GSH-Px. Resultado semelhante foi apresentado por Selvaraj e Pugalendi [41] no modelo de isquemia induzida por isoproterenol: os ratos que receberam hesperidina apresentaram atividade mais baixa das enzimas antioxidantes, entre eles, a GSH-Px. [41]

Em relação ao metabolismo energético, o coração, assim como outros órgãos, consegue adaptar-se e utilizar o melhor substrato energético em cada situação. A PFK atua na regulação da glicólise, e catalisa a fosforilação de glicose em frutose-6-fosfato e subsequentemente em frutose 1,6-bisfosfato. [42] A PFK é ativada quando as concentrações de ATP são reduzidas e é inibida quando as células têm reserva suficiente de ATP e de outros substratos, tais como ácidos graxos. [42] Nossos dados mostraram valores mais altos de PFK em animais infartados com ingestão de SL. Esses dados mostram que atividade aumentada da PFK pode levar à regulação da via glicolítica, fornecendo mais substrato para produção de energia. Outro achado importante que indica maior uso de substrato é a maior atividade da ATP sintase em animais que receberam SL.

Além do estresse oxidativo e alterações metabólicas, observamos que os animais infartados que receberam SL apresentaram valores mais baixos de IFN-γ. Uma vez que a fase crônica da inflamação está relacionada a uma produção aumentada de IFN-γ, [43] nossos resultados sugerem uma fase mais avançada em direção à resolução do processo inflamatório. Um resultado interessante é que animais sham que consumiram SL mostraram efeito imunomodulatório, indicado pelos valores mais altos de IL-10 e INF-γ. Similar aos nossos achados em animais do grupo sham, os quais não sofreram nenhuma lesão cardíaca, estudos com humanos sadios, de meia idade, relataram que o SL alterou a expressão gênica em leucócitos para um perfil anti-inflamatório e antiaterogênico, [44] e promoveu uma proteção precoce de células sanguíneas mononucleares contra dano oxidativo no DNA. [45] Além disso, o consumo de SL com a refeição rica em carboidratos preveniu o estresse oxidativo e inflamatório induzido pela refeição. [46]

Outro achado interessante em nosso estudo foi os valores mais elevados de HO-1 em animais que consumiram SL. Lin et al., [47] em 2005, também mostraram que a hesperetina induziu a expressão proteica de HO-1. [47] A enzima HO-1 exerce ação importante na homeostase celular devido à sua ação catabólica no grupo heme das hemoproteínas, gerando subprodutos tais como ferro, biliverdina e monóxido de carbono. Por meio desses subprodutos, a HO-1 exerce ação inflamatória antioxidante, e antiapoptótica. [48 , 49] Além dessa função clássica, a HO-1 participa na sinalização celular amplificando a ação dos indutores (heme, oxidantes, citocinas, forças hemodinâmicas, fatores de crescimento, hipóxia, e hormônios) de fatores de transcrição. [48]

Wang et al., [50] mostraram que a HO-1 é importante para a homeostase cardíaca, protegendo o órgão contra isquemia e lesões induzidas pela reperfusão, e danos oxidativos. [50] Em outro estudo, a administração de hemina em camundongos infartados induziu a ativação de HO-1, o que causou uma mudança nos macrófagos para um fenótipo anti-inflamatório (M2), redução da expansão da cicatriz do infarto, e melhora da função cardíaca. [51] Assim, HO-1 aumentada também pode exercer importante papel na atenuação da RC pelo SL ( Figura 2 ). Ainda, esse aumento foi independente da via do Nrf2, uma vez que o SL não causou alterações na expressão dessa proteína. Similar aos nossos achados, Wang et al., [52] encontraram que a isoliquiritina e a isoliquiritigenina, flavonoides derivados do alcaçuz, induziram a expressão de HO-1 independentemente da expressão de Nrf2. [52] A expressão de HO-1 pode ser induzida por diferentes vias e variar de acordo com o modelo e tratamento utilizado. [47]

Limitações

O SL usado no estudo foi um suco comercial, pronto para consumo, pasteurizado, livre de conservantes e açúcar. A escolha por esse suco foi para garantir a padronização. No entanto, é possível que o uso de outros tipos de sucos, elaborados com outros tipos de laranjas, poderia levar a respostas diferentes.

Conclusão

O SL atenuado por RC após IM, com diminuição do diâmetro do VE e melhora da função sistólica e diastólica; HO-1 pode desempenhar um papel importante neste processo.

Introduction

The name polyphenols , or phenolic compounds , refers to a large group of molecules found in leaf vegetables, fruits, cereals, tea, coffee, cocoa, wine, soy, and fruit juice.[1] These compounds have been studied because of their potential biological effect in prevention and treatment of different diseases.[2 , 3]

In a review of the literature, Hyson showed that fruit juices, defined as pure juice or 100% fruit juice, retained most of nutrients and phytochemicals of the whole fruit and therefore may have an important potential to benefit and protect human health.[4] Orange juice (OJ) is a source of phenolic compounds in the form of different flavonoids. The main flavonoid of interest is hesperidin and its hydrolyzed form, hesperetin.[5] The research interest in the properties of OJ has increased because of its anti-inflammatory and antioxidant action in chronic diseases.[6]

For example, in myocardial injury, antioxidant supplements may have beneficial effects in cardiac remodeling (CR). In studies using myocardial infarction (MI) model, bioactive compounds present in rosemary, tomato, green tea, and antioxidants such as ascorbic acid, quercetin, alpha-tocopherol, and vitamin A showed protection against CR.[1 , 3 , 7 - 10]

Ischemic heart disease, including MI, is a leading cause of heart failure and death worldwide. After MI, complex changes in the left ventricle can cause changes in cardiac size, mass, geometry, and function.[11 , 12] These changes are defined as CR and can lead to heart failure and increased mortality.[13] Many factors may be involved in CR, such as oxidative stress, inflammation, fibrosis, and apoptosis.[14 , 15]

In MI, ischemia initiates the generation of reactive oxygen species (ROS). ROS directly damage cell membranes, activate the inflammatory response, and lead to cell death. They can also act as transduction signals, stimulating nuclear factor κB (NF-κB), which, in turn, stimulates proinflammatory cytokines synthesis.[14 - 16] In addition, the Kelch-like ECH-associated protein 1/nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (KEAP-1/Nrf2) system could be activated during cellular oxidative stress and play a critical role in redox homeostasis. This is a universal mechanism that acts in Nrf2 target genes called antioxidant response elements. Glutathione peroxidase (GSH-Px) and heme-oxygenase-1 (HO-1) are examples of proteins regulated by this system.[17]

Therapeutic strategies to attenuate CR after MI have been extensively studied.[18 , 19] Aldosterone blockers, angiotensin-converting enzyme inhibitors, and beta-blockers are some of these strategies.[20] In this context, bioactive compounds of natural products, with cardioprotective properties such as flavonoids, can be an important adjuvant in the treatment of MI. On the other hand, studies show that a focus on food and dietary patterns instead of individual nutrients or phytochemicals is better for cardiometabolic health.[21] Thus, the aim of this study was to evaluate the influence of OJ intake on CR after MI.

Materials and Methods

Experimental protocol

All experiments and procedures were performed in accordance with the National Institutes of Health’s (NIH) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals and were approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the Botucatu Medical School, UNESP, São Paulo, Brazil (1126/2015). A total of 242 male Wistar rats weighing 200 to 250 g were used in this study. MI was induced by coronary artery ligation, as previously described.[22 , 23]

After surgery, the animals were placed in boxes with six animals each. Seven days after surgical procedure, the first echocardiographic study was performed to evaluate the efficacy of the surgical procedure.[24] Then, the animals were randomly placed in boxes with two animals each, to receive either OJ or a maltodextrin (M) solution. The groups were 1) SM, sham animals that received M solution (n = 20); 2) SOJ, sham animals that received OJ (n = 20); 3) IM, infarcted animals that received M solution intake (n = 40); and 4) IOJ, infarcted animals that received OJ (n = 40). The sample size used was based on other studies from our laboratory.[3 , 8 , 25] The number of rats in the infarcted groups was higher, since the expected mortality in these animals during the experimental period is around 50%. In addition, only rats with a left ventricular (LV) infarcted area greater than 30% were included.[24]

Food was supplied ad libitum . The animals were treated for 3 months, and mortality was observed in this period ( Figure 1 of the supplementary data). The rats were housed in a temperature-controlled room (22 ± 2°C) with a 12-h light/12-h dark cycle.

Figure 1

– Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) and heme-oxygenase-1 (HO-1) expression in sham and infarcted rats by Western blot. Bar chart showing the expression of Nrf2 and HO-1 proteins in each group (A) Nrf2 expression and representative Western blot; sample size: 8 in each group. (B) HO-1 expression and representative Western blot; sample size: SM = 5; SOJ = 6; IM = 5; IOJ = 5. GAPDH glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Data are expressed as mean ± SD. p(I): p value between non-infarcted animals vs. infarcted animals; p(OJ): p value between animals that received maltodextrin vs. animals that received orange juice; p(IxOJ): p-value for the interaction between the factors of infarction and orange juice intake.

Coronary artery ligation

MI was conducted by coronary artery ligation, as previously described.[22 , 23] In brief, the rats were anesthetized with ketamine (70 mg/Kg) and xylazine (1 mg/Kg), and after a left thoracotomy, the heart was exteriorized. The left atrium was retracted to facilitate the ligation of the left coronary artery with 5-0 mononylon between the pulmonary outflow tract and the left atrium. The heart was then replaced in the thorax, the lungs were inflated by positive pressure, and the thoracotomy was closed. A sham group, in which animals were submitted to surgery but without coronary occlusion, was also created. After anesthetic effect, the rats were medicated orally with metamizole sodium (30 mg / kg Dipirona®, Biovet, Vargem Grande Paulista, Sao Paulo, Brazil).

Orange juice

Supplemented groups (SOJ and IOJ) received OJ ad libitum . Control groups (SM and IM) received a solution of water and M at a concentration of 100 g/L. The M solution was given to control animals to provide the same amount of carbohydrates as the OJ. Treatment began seven days after surgery. The OJ and M solutions were changed every 24 hours, and intake was monitored daily. Nutritional composition of the OJ is shown in supplementary data.

Echocardiographic study

After three months, all rats were weighed and evaluated by transthoracic echocardiography.[26 , 27] For the echocardiographic study, the rats were anaesthetized with intramuscular injection of ketamine (50 mg/kg) and xylazine (1 mg/kg) solution. All measurements were made by the same observer, according to the leading-edge method recommended by the American Society of Echocardiography/European Association of Echocardiography.[28] Echocardiography was performed with the General Electric Vivid S6 System (GE Medical Systems, Tirat Carmel, Israel) equipped with a 5- to 12-MHz phased array transducer.

After echocardiography, the animals were euthanized with a large dose of pentobarbital, and their hearts were removed. The left ventricle was isolated and LV samples were immediately frozen and stored at –80°C. One transverse section of the LV was separated and fixed in 10% buffered formalin and was then embedded in paraffin for histological study.

Morphometric analysis

Five-micrometer-thick sections were stained with hematoxylin and eosin for calculations of infarction size as previously described. All animals were included in the morphometric analysis. After infarction size calculation, infarcted animals with less than 30% of LV infarcted area were excluded from analysis. All images were collected with a video camera attached to Leica microscope; the images were analyzed with the Image-Pro Plus 3.0 software program (Media Cybernetics, Silver Spring, MD).

Cardiac lipid hydroperoxide, antioxidant enzyme activity, and cardiac energy metabolism

LV samples (100 mg) were used to determine total protein and lipid hydroperoxide (LH) concentrations, and activity of the following antioxidant enzymes – GPx (E.C.1.11.1.9), superoxide dismutase (SOD, E.C.1.15.1.1), and catalase (E.C.1.11.1.6). Cardiac energy metabolism was assessed by 3-hydroxyacyl coenzyme-A dehydrogenase (OHADH; E.C.1.1.1.35.), phosphofructokinase (PFK; E.C.2.7.1.11), lactate dehydrogenase (LDH; E.C.1.1.1.27), pyruvate dehydrogenase (E.C.1.2.4.1), citrate synthase (CS; E.C.4.1.3.7.), and adenosine triphosphate (ATP) synthase (EC 3.6.3.14) activities.[3 , 9] The enzyme activity assays were performed at 25°C with a microplate reader (µQuant-MQX 200-EONC with Gen5 2.0 software connected to a computer system control; Bio-Tec Instruments, VT, USA). All the reagents were obtained from Sigma (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).

Inflammatory mediators

Interferon-γ (IFN-γ) and interleukin-10 (IL-10) concentrations in LV samples were determined by ELISA according to the manufacturer’s instructions (R&D Systems, Minneapolis, MN).

Western blot was performed to analyze protein expression of GPx-1 (ab 22604 - Abcam Inc, Cambridge), HO-1 (ab13248 - Abcam Inc, Cambridge), total and phosphorylated NF-kB (NF-kB- sc 8008 and sc 3302- Santa Cruz Biotechnology, Inc, Europe), and sirtuin-1 (Sirt-1- sc 15404-Santa Cruz Biotechnology, Inc, Europe), in total cellular extract. To determine nuclear erythroid factor 2 (Nrf-2-sc 722-Santa Cruz Biotechnology Inc, Europe), LV samples were extracted with nuclear extraction buffer.[9] Samples were separated on a 10% sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel, and the proteins were transferred to a nitrocellulose membrane. The membrane was blocked with 5% nonfat dry milk and then incubated with primary and secondary antibodies. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GAPDH (sc 32233, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Europe) was used for normalization of all proteins.

Statistical analysis

The normality of the data was verified by Kolmogorov–Smirnov statistical test. Data are presented as the mean ± standard deviation (SD). Variables with normal distributions were analyzed by 2-factor analysis of variance, which gives three p values: 1) factor 1, presence of MI (I); 2) factor 2, OJ intake (OJ); and 3) interaction between factors I and OJ. The 2-factor analysis of variance requires an assumption of normality. If a measurement variable does not fit a normal distribution, data transformation was performed. The Student’s unpaired t -test was used to analyze the initial echocardiogram; the χ2test was used to evaluate mortality, and Student’s unpaired t-test used to evaluate the infarct size in infarcted animals. Differences were considered statistically significant if p <0.05. Statistical analyses were performed using SigmaPlot for Windows 12.0 (Systat Software Inc., San Jose, CA).

Results

The initial echocardiogram showed that animals of both infarcted groups did not present differences in the systolic and diastolic area or in the infarct size ( Table 1 of Supplementary material).

Table 1

– Infarction size, final echocardiogram, and morphometric analysis.

Variable	SM (n = 19)	SOJ (n = 20)	IM (n = 9)	IOJ (n = 9)	p (I)	p (OJ)	p (I×OJ)
BW (g)	454±47.9	480±56.3	443±66.6	462±25.9	0.338	0.135	0.852
HR (bpm)	290±30.9	296±34.9	268±26.7	324±30.0aB	0.756	0.001	0.009
LA/Ao	1.32±0.09	1.21±0.09b	1.78±0.21A	1.42±0.18Ba	<0.001	<0.001	0.003
LVEDD/BW (mm/kg)	15.9±1.31	15.0±1.79	22.1±2.70	20.2±2.10	<0.001	0.019	0.398
LVESD/BW (mm/kg)	6.67±0.87	6.02±0.89	15.1±2.70	12.8±2.70	<0.001	0.007	0.556
LVMI (g/kg)	1.63±0.22	1.56±0.27	2.62±0.60	2.36±0.36	<0.001	0.124	0.640
FAC (%)	67.3±8.28	67.4±8.27	34.5±8.28	36.6±8.28	<0.001	0.661	0.707
E wave (ms)	79.7±11.3	81.4±7.16	89.1±10.8	80.7±19.2	0.204	0.325	0.139
A wave (ms)	49.9±8.28	52.6±7.16	42.5±16.5	62.7±24.9a	0.730	0.004	0.025
S´ mean (cm/s)	5.78±0.04	5.82±0.31	4.60±0.30	5.01±0.3	<0.001	0.028	0.078
E´ mean (cm/s)	5.62±0.44	5.82±0.45	4.23±0.60	4.77±0.60	<0.001	0.054	0.357
A´ mean (cm/s)	3.67±0.44	4.02±0.45	4.54±0.90	5.55±1.20	0.058	0.058	0.28
E/E´ ratio	13.7±3.49	14.1±1.79	21.3±3.30A	16.9±2.40Ba	<0.001	0.002	0.003
LVW/BW (mg/g)	1.85±0.13	1.93±0.27	2.13±0.42	2.10±0.15	0.005	0.550	0.822
RVW/BW (mg/g)	0.46±0.09	0.43±0.05	0.65±0.24	0.59±0.27	<0.001	0.294	0.776

Data are expressed as mean ± standard deviation. n: numbers of animals included in each experimental group. SM: sham animals that received maltodextrin; SOJ: sham animals that received orange juice; IM: infarcted animals that received maltodextrin; IOJ: infarcted animals that received orange juice. BW: body weight; HR: heart rate; LA: left atrial diameter; Ao: aorta diameter; LVEDD: left ventricular end-diastolic diameter; LVESD: left ventricular end-systolic diameter; LVMI: left ventricular mass index (left ventricular mass/BW); FAC: fractional area change; E wave: early diastolic mitral inflow velocity; A wave: late diastolic mitral inflow velocity; S´ mean: mean of systolic annular mitral velocity septal and lateral; A´ and E´ mean: mean of diastolic annular mitral velocity septal and lateral (E´: early and A: late); LVW: left ventricular weight; RVW: right ventricular weight. pI: p value for the effect of infarction. pOJ:

During the 3-month experimental period, mortality was 5.0% in the SM (1 rat died), 0% in the SOJ, 22.5% in the IM (9 rats died), and 22.5% in the IOJ group (9 rats died). When all groups were analyzed, a difference in mortality was observed between the groups (p=0.04). However, mortality was not different between the infarcted groups (p=0.836). After the period of OJ intake, euthanasia of surviving animals was performed. Then, histological analysis of the left ventricle of infarcted animals was performed to verify the infarction size ( Figure 1 of the Supplementary material). These animals did not present a difference in infarct size (IM= 40.1±7.41%; IOJ=38.1±5.76%; p= 0.528). The final body weight (BW) was not different among the groups ( Table 1 ).

Effect of MI in rat hearts

MI led to adverse CR. Regarding morphological data, MI led to higher values of LV diastolic diameter/BW, LV systolic diameter/BW, left atrial diameter/aorta, LV mass index (LVMI), LV weight/BW, and right ventricular weight/BW ( Table 1 ), LV posterior wall thickness/BW, interventricular septum wall thickness/BW, and left atrial diameter/BW ( Table 1 of Supplementary material). These changes characterize the enlargement of the left cavities and LV hypertrophy. MI impaired cardiac systolic function, as shown by the lower values of fractional area change (FAC), S´ mean ( Table 1 ), endocardial fractional shortening, and ejection fraction ( Table 2 of Supplementary material). Cardiac diastolic function was also impaired, as shown by decreased mean E´ ( Table 1 ), E wave deceleration time, E´ lateral, and E´ septal ( Table 2 of Supplementary material) and increased A wave, A´ mean; E/E´ ratio ( Table 1 ), Tei index, E/A ratio, isovolumetric relaxation time adjusted by heart rate, A´ lateral, and A´ septal.

Table 2

– Oxidative stress and inflammatory markers

Variable	SM (n = 8)	SOJ (n = 8)	IM (n = 4)	IOJ (n = 4)	p (I)	p (OJ)	p (I×OJ)
LH (nmol/g)	209±28.3	215±28.3	256±28.0	277±26.0	<0.001	0.293	0.573
Catalase (µmol/g)	64.4±6.79	61.8±7.07	55.4±7.00	58.1±7.60	0.056	0.993	0.404
SOD (nmol/mg)	12.9±2.83	13.5±2.83	18.7±1.80	17.1±1.40	<0.001	0.639	0.355
GSH-px activity (nmol/mg)	62.5±6.51	50.2±7.07	58.0±7.00	45.3±6.00	0.134	<0.001	0.951
GSH-px expression (arbitrary unit)	7.56±7.39	7.62±10.8	6.63±5.82	6.37±3.78	0.600	0.649	0.546
IL-10 (pg/mg)	23.9±7.92	39.6±13.0b	42.0±9.60A	34.1±7.60	0.135	0.352	0.008
IFN-γ (pg/mg)	7.1±2.26	13.2±3.96b	17.7±6.80A	11.2±2.00a	0.037	0.928	0.003
NF-κB (arbitrary unit)	7.03±11.0	4.61±4.98	3.40±3.12	6.80±4.00	0.942	0.330	0.266
p NF-κB (arbitrary unit)	5.40±10.2	3.18±2.40	3.28±3.12	5.22±3.34	0.587	0.084	0.980
Sirt 1 (arbitrary unit)	1.81±0.82	2.34±1.41	2.42±1.44	1.65±0.56	0.925	0.813	0.203

Data are expressed as mean ± standard deviation. n: numbers of animals included in each experimental group. SM: sham animals that received maltodextrin; SOJ: sham animals that received orange juice; IM: infarcted animals that received maltodextrin; IOJ: infarcted animals that received orange juice. LH: lipid hydroperoxide; SOD: superoxide dismutase; GSH-px: glutathione peroxidase; IL-10: interleukin-10; INF-γ: interferon- γ; NF-κB: nuclear factor–κB total and phosphorylated (p NF-κB); Sirt 1: sirtuin 1. pI: p value for the effect of infarction. pOJ: p value of orange juice intake effect. pIxOJ: p value of interaction.Bold numbers represent statistically significant effects. : IM≠IOJ; : SM≠SOJ; : SM≠IM e SOJ≠IOJ.

MI also increased oxidative stress, as presented with higher LH and SOD activity ( Table 2 ), lower expression of HO-1 (Figure 1A), and of Nrf2 (Figure 1B). The inflammatory mediators IL-10 and INF-γ were higher in MI ( Table 2 ), and there was no difference in NF-κB and Sirt-1 between infarcted and noninfarcted animals ( Table 2 and Figure 2 of Supplementary material). A greater oxidation of carbohydrates than fatty acids and impaired energy metabolism were observed, as shown by higher activity of LDH and PFK and lower activity of OHADH, CS, and ATP synthase. No difference was observed for activity of pyruvate dehydrogenase ( Table 3 ).

Figure 2

– Scheme illustrating the main findings of this study.

Table 3

– Enzymes involved in cardiac energy metabolism

Variable	SM (n = 8)	SOJ (n = 8)	IM (n = 4)	IOJ (n = 4)	p (I)	p (OJ)	p (I×OJ)
PFK (nmol/g)	128±17.0	112±24.6	139±26.0	178±26.0aB	<0.001	0.257	0.011
LDH (nmol/mg)	88.5±18.7	82.6±18.1	111±18.6	134±16.	<0.001	0.320	0.092
PDH (nmol/g)	344±53.7	385±31.1	345±100	341±42.0	0.386	0.461	0.376
OHADH (nmol/mg)	33.2±6.22	33.9±6.22	23.8±8.40	24.5±2.80	0.003	0.798	0.992
CS (nmol/mg)	50.0±6.22	49.4±6.51	34.5±7.40	40.5±4.80	<0.001	0.350	0.254
ATP synthase (nmol/mg)	21.0±3.11	27.8±5.37	11.4±1.20	15.9±4.40	<0.001	0.005	0.532

Data are expressed as mean ± standard deviation. n: numbers of animals included in each experimental group. SM: sham animals that received maltodextrin; SOJ: sham animals that received orange juice; IM: infarcted animals that received maltodextrin; IOJ: infarcted animals that received orange juice. PFK: phosphofructokinase; LDH: lactate dehydrogenase; PDH: pyruvate dehydrogenase; OHADH: 3-hydroxyacyl coenzyme-A dehydrogenase; CS: citrate synthase; ATP: adenosine triphosphate. pI: p value for the effect of infarction. pOJ: p value of orange juice intake effect. pIxOJ: p value of interaction. Bold numbers represent statistically significant effects.

Effect of OJ intake on rat hearts

OJ intake reduced the LV cavity, with lower values of LV end-diastolic diameter (LVDD) and LV end-systolic diameter (LVSD); improved systolic function, with higher values of S´ mean; and improved diastolic function, with lower left atrial diameter adjusted for aorta diameter ( Table 1 )[29] after MI. No differences were observed for other echocardiographic variables ( Table 1 ). The other function variables were not valued because of the higher heart rate[30] in the IOJ group (presented in Supplementary material Table 2 ).

In addition, the animals that consumed OJ presented lower activity of GSH-Px ( Table 2 ). No differences were observed for LH, SOD activity, catalase activity, or GSH-Px expression ( Table 2 and Figure 2 of the Supplementary material).

Regarding the inflammatory mediators, the SOJ group showed higher IL-10 and INF-γ than the SM group ( Table 2 ). Also, the IOJ group had lower INF-γ values than the IM group ( Table 2 ). No differences were observed for NF-κB or Sirt-1 between animals that consumed or did not consume OJ ( Table 2 and Figure 2 of the Supplementary material).

An improvement in the use of substrate occurred in the animals that consumed OJ. We observed higher values in PFK activity in the IOJ group compared with the IM group and higher activity of ATP synthase in animals that consumed OJ. No difference was observed in the activity of other energy metabolism enzymes between the groups ( Table 3 ).

Interestingly, the animals with OJ intake had a higher expression of HO-1 (Figure 1A), although they did not present a difference in Nrf2 expression (Figure 1B).

Discussion

In the present study, MI induced by coronary artery ligation in rats resulted in LV hypertrophy and diastolic dysfunction, which was compatible with changes observed in chronic infarction.[11] Our data also showed increased oxidative stress and inflammatory markers as well as alterations in energy metabolism, with impairment of fatty acid β-oxidation. These alterations characterize the CR process.[31 - 33] We also observe a decrease in Nrf2 and HO-1 expression. In the chronic phase of MI, the Nrf2 pathway may be diminished by abnormal expression of the Nrf2 target gene, affecting the maintenance of redox homeostasis via enzymes mediated by antioxidant response elements.[34] In a previous study conducted in our laboratory with the MI model, lower expression of Nrf2 and HO-1 was observed.[3] These findings suggest either a lower expression or greater catabolism of the Nrf2 protein, thus leading to the lower synthesis of HO-1.

In the present study, OJ intake resulted in attenuation of CR in infarcted animals. This attenuation can be observed in the decrease of LV cavity (LVDD and LVSD) and in the improvement of systolic function, characterized by the increase in the S´ mean,[35] and diastolic function (lower left atrial diameter). In the study by Yu et al.,[36] infarcted rats, by left coronary ligation, treated with hesperidin for four weeks had lower LVDD and LVSD and improved systolic function than infarcted animals. These data are similar to ours and may show the effect of hesperidin of OJ on the CR process. In other study, another phenolic compound, hesperetin, also had an effect on the heart. In pressure-overload model, Deng et al.[37] found lower values of LVDD and LVSD at eight weeks of hesperetin administration.

MI leads to an imbalance between the production of ROS and antioxidant defenses, leading to oxidative stress. After ischemia, some ROSs damage cell membranes, initiating the process of lipid peroxidation.[38] For example, Bagatini et al.[39] described an increase in lipid peroxidation in patients with MI. Our data also show a higher concentrations of lipid hydroperoxides in infarcted animals compared to non-infarcted animals. The SOD enzyme is the organism’s first defense against ROS.[40] Our data show that infarcted animals compared to non-infarcted animals showed greater activity of the SOD enzyme, as previously described.[3 , 25] Regarding OJ intake, we observed that the animals that consumed OJ presented lower GSH-Px activity. A similar result was shown by Selvaraj and Pugalendi[41] in myocardial ischemia model induced by isoproterenol: rats that received hesperidin presented lower activity of the antioxidant enzymes, among them GSH-Px.[41]

In relation to energy metabolism, the heart, like other organs, can adapt and use the best energy substrate in each situation. PFK acts in glycolysis regulation, and catalyzes the phosphorylation of glucose in fructose-6-phosphate and subsequently in fructose 1,6-bisphosphate.[42] PFK is activated when ATP concentrations become low and is inhibited when cells have sufficient supply of ATP and other substrates such as fatty acids.[42] Our data showed higher values of PFK in infarcted animals with OJ intake. These data show that increased PFK activity may lead to regulation of the glycolytic pathway, by providing more substrate for energy production. Another important finding that indicates a greater use of substrate is the higher ATP synthase activity in the animals that received OJ.

In addition to oxidative stress and metabolic changes, we found that the infarcted animals that received OJ presented lower values of IFN-γ. Since a chronic phase of inflammation is related to an increased production of IFN-γ,[43] our findings suggest more advanced phase towards the resolution of the inflammatory process. An interesting result is that sham animals who consumed OJ demonstrated an immunomodulatory effect, as shown by higher values of IL-10 and INF-γ. Similar to our findings in animals in the sham group, which had no cardiac injury, studies in healthy, middle-aged humans showed that OJ altered leukocyte gene expression to an anti-inflammatory and anti-atherogenic profile[44] and provided an early protection of mononuclear blood cell against oxidative DNA damage.[45] In addition, OJ intake with the high-carbohydrate meal prevented meal-induced oxidative and inflammatory stress.[46]

Another intriguing finding in our study was the higher values of HO-1 in animals that consumed OJ. Lin et al.[47] in 2005 also showed that hesperetin induced protein expression of HO-1.[47] The HO-1 enzyme plays important role in cell homeostasis because of its catabolic action on the heme group of hemoproteins, generating by-products such as iron, biliverdin, and carbon monoxide. Through these by-products, HO-1 exerts anti-inflammatory, antioxidant, and antiapoptotic action.[48 , 49] In addition to this classical function, HO-1 participates in cell signaling as amplifier of inductors (heme, oxidants, cytokines, hemodynamic forces, growth factors, hypoxia, and hormones) of transcription factors.[48]

Wang et al.[50] showed that HO-1 is important for heart homeostasis by protecting it from ischemia and reperfusion-induced lesions and oxidative damage.[50] In another study, hemin administration in infarcted mice induced HO-1 activation, which caused a change in infarct macrophages toward a M2 anti-inflammatory phenotype, reduction of infarct scar expansion, and improvement of cardiac function.[51] Thus, increased HO-1 may also play an important role in CR attenuation by OJ ( Figure 2 ). In addition, this increase was independent of the Nrf2 pathway, since OJ did not lead to alterations in the expression of this protein. Similar to our findings, Wang et al.[52] found that isoliquiritin and isoliquiritigenin, flavonoids derived from liquorice, induced HO-1 expression independent of Nrf2 expression.[52] The HO-1 expression can be induced by different pathway and may vary according to the model and treatment used.[47]

Limitations

The OJ used in the study was a commercial, ready-to-eat, pasteurized juice, free of preservatives and sugar. The choice of ready juice was to ensure its standardization. However, the use of other types of juices, made with other types of oranges, could possibly show different responses.

Conclusion

OJ attenuated CR after MI, with decreased LV diameter as well as improvement in systolic and diastolic function; HO-1 may play an important role in this process.