[Clinical prognosis analysis of patients with "double hit" multiple myeloma].

Objective: To analyze and explore the clinical characteristics and prognosis of patients with "double hit" multiple myeloma (MM) .
Methods: We retrospectively analyzed 89 MM patients in our department of Shanghai Changzheng Hospital from 2010-2016. All patients were assayed by fluorescence in situ hybridization (FISH) and TP53 gene sequencing, based on Dr. Walker BA proposed the "double hit" MM concept, and then the clinical features and prognosis were evaluated.
Results: In the results, 15 (16.85%) cases harbored "double hit" showed the median PFS of 8.4 months and the median OS 22.2 months, which was significantly lower than non-"double hit" patients with median PFS 14.2 months and the median OS 39.2 months, respectively (P<0.05) . Multivariate analysis displayed that the "double hit" was an independent poor prognostic factor on PFS (HR=2.171, 95%CI 1.206-3.907, P=0.010) and OS (HR=4.106, 95%CI 2.116-7.969, P<0.001) . Moreover, "double hit" MM patients had the higher adverse prognosis risk, which showed the shorter median OS and PFS than stage III of R-ISS patients (PFS 8.4 vs 11.8 months; OS 22.2 vs 24.3 months, P<0.05, respectively) .
Conclusion: Patients with "double hit" MM have a very poor clinical prognosis. Prospective clinical studies are urgently needed to improve these extra high risk patients.

多发性骨髓瘤（Multiple myeloma，MM）是一种单克隆浆细胞恶性增殖性疾病，其发病率在血液系统恶性肿瘤中位列第2。近年来新药极大地改善了MM患者的预后，但高危患者总体生存（OS）时间仍不足3年，精准的预后危险度分层对于指导治疗、改善患者预后具有重要意义[1]。2019年Walker等[2]提出了“双打击”MM的概念：TP53双等位基因失活或ISS Ⅲ期且1q21拷贝数大于3，此类型患者中位OS时间仅20.7个月，中位无进展生存（PFS）时间为15.4个月，危险分层属于极高危。

此危险分层体系是否适用于我国患者？我国“双打击”患者的预后如何？我中心回顾性分析了具有FISH和TP53全基因测序数据的89例MM患者的临床特征和预后，旨在鉴别极高危MM患者，以指导治疗并改善患者预后。

病例与方法

1．病例：回顾性分析了2010–2016年第二军医大学长征医院收治的89例MM患者（依据国内外诊断标准[3]–[4]），所有患者均具备完整的FISH数据和TP53全基因测序结果，对其临床特征与预后的相关性进行研究。

2．间期FISH检测常见遗传学异常：诊断和复发时分别抽取患者骨髓标本15~20 ml，肝素抗凝，采用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞，磁珠分离CD138阳性细胞。缓冲液、水、探针（购自英国CYTOCELL公司）按照7∶2∶1的比例混合以配置探针混合液，将纯化后的浆细胞滴于玻片上，探针混合液加至玻片杂交区，加上盖玻片后以树脂胶封固，将玻片置于ThermoBrite原位杂交仪（购自美国自然基因有限公司）。观察200个分裂间期细胞荧光杂交信号，进行图像分析（美国VideoTest公司软件）。按照欧洲骨髓瘤工作组设定的阳性阈值标准[5]：13q−、17p–和1q21扩增为阳性细胞百分率≥20%，融合基因为阳性细胞百分率≥10%。

3．TP53基因突变检测：经CD138磁珠分选骨髓单个核细胞（≥5×l06），用DNA提取试剂盒（购自美国Gentra公司）提取其基因组DNA。扩增TP53基因4~11号外显子，反应条件：94 °C预变性3 min，94 °C 30 s，59 °C 30 s，72 °C 90 s（35个循环），72 °C延伸10 min。PCR产物行Sanger测序。

4．治疗：所有患者均接受以硼替佐米为主的3药治疗，包括硼替佐米、地塞米松联合阿霉素或环磷酰胺（PAD或VCD方案），共治疗6~8个疗程。根据本课题组既往研究[6]，两组方案疗效差异无统计学意义。

5．随访：患者均随访至2019年1月，中位随访时间36.9（0.7~80.0）个月，方式为查询住院病历及电话随访。OS时间指患者从诊断或进展时完成FISH和TP53基因检测至死亡或末次随访时间。PFS时间指患者自诊断时完成FISH和TP53基因检测至疾病进展或末次随访时间。

6．统计学处理：采用SPSS 23.0软件行统计分析。组间构成比、率的比较采用卡方检验，采用Kaplan-Meier曲线进行生存分析，Log-rank检验进行差异性分析。多因素分析采用Cox回归模型，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1．“双打击”MM患者基因型和临床特征：依据Walker等[2]提出的“双打击”MM标准，本研究纳入“双打击”MM患者15例（16.85%），非“双打击”患者74例（83.1%）；“双打击”患者包括TP53双等位基因失活患者3例，ISS分期Ⅲ期且1q21扩增拷贝数>3的患者12例。本研究89例MM患者中，男60例，女29例，中位年龄61（38~81）岁，中位OS时间34.1个月，中位PFS时间14.2个月，患者临床特征见表1。“双打击”患者均处于DS Ⅲ期和（或）ISS Ⅲ期，“双打击”与非“双打击”患者中处于R-ISS Ⅲ期的患者比例分别为73.33%和25.68%（P=0.001）。15例“双打击”MM患者中53.33%为IgD型，且均携带1q21+，以上结果提示“双打击”MM患者发病时病情较重。

表1

89例多发性骨髓瘤患者的临床特征

特征	“双打击”组	非“双打击”组	P值
性别（例，男/女）	10/5	50/24	0.946
年龄［岁，M（范围）］	67（45～81）	60（38～78）	0.165
M蛋白类型［例（%）］			0.021
IgG型	5（33.3）	28（37.8）	0.742
IgA型	0（0）	18（24.3）	0.035
IgD型	8（53.3）	18（24.3）	0.024
轻链型	2（13.3）	10（13.5）	1.000
DS分期［例（%）］			0.177
ⅠA期	0（0）	1（1.4）	1.000
ⅡA期	0（0）	3（4.0）	1.000
ⅡB期	0（0）	2（2.7）	1.000
ⅢA期	8（53.3）	54（73.0）	0.131
ⅢB期	7（46.7）	14（18.9）	0.021
ISS分期［例（%）］			<0.001
Ⅰ期	0（0）	15（20.3）	0.065
Ⅱ期	0（0）	26（35.1）	0.004
Ⅲ期	15（100）	33（44.6）	<0.001
R-ISS分期［例（%）］			0.001
Ⅰ期	0（0）	10（13.5）	0.202
Ⅱ期	4（26.7）	45（60.8）	0.022
Ⅲ期	11（73.3）	19（25.7）	0.001
LDH［U/L，M（范围）］	407（116～2 332）	193（81～1 314）	0.427
骨髓浆细胞［%，M（范围）］	66.5（19.5～90.0）	41.0（0～94.5）	0.023
初诊患者［例（%）］	13（86.7）	43（58.1）	0.043
FISH［例（%）］
t（11；14）	2（13.3）	12（16.2）	1.000
t（14；16）	1（6.7）	3（4.0）	0.529
t（4；14）	2（13.3）	12（16.2）	1.000
17p－	2（13.3）	12（16.2）	1.000
1q21+	15（100.0）	52（70.3）	0.018
13q－	5（33.3）	35（47.3）	0.322
TP53基因突变［例（%）］			0.006
纯合型	2（13.3）	0（0）	0.024
杂合型	0（0）	8（10.8）	0.342
野生型	13（86.7）	66（74.2）	0.674

2．TP53突变对MM患者预后的影响：17p–是染色体预后不良的重要危险因素，但最近Walker等提出17p–纯合型、杂合型及17号染色体上的TP53基因纯合失活、杂合突变对预后具有不同影响。本研究89例患者中FISH检测出17p–杂合型14例（15.73%），无纯合型17p–异常。TP53基因纯合突变2例（2.25%），杂合突变10例（11.24%），其中1例（1.12%）患者同时存在TP53杂合突变和17p–导致TP53双等位基因失活，因此TP53双等位基因失活的“双打击”MM患者共3例。预后分析显示，野生型（无17p–及TP53突变）、杂合型（单等位基因17p–或TP53突变）及纯合型（“双打击”）患者PFS率和OS率的差异并无统计学意义（图1），但“双打击”（纯合型TP53突变）患者的中位OS时间（25.7个月）明显低于野生型（34.1个月）和杂合型（40.4个月）两组患者。

图1

17p–和TP53基因突变对多发性骨髓瘤患者无进展生存期（A）和总生存期（B）的影响

3．1q21拷贝数变化对MM患者预后的影响：按照“双打击”的概念，将患者分为1q21野生型、1q21获得（拷贝数1~3）与1q21扩增（拷贝数≥4）三组行预时间显著低于其它两组，中位PFS时间仅为8.4个月后分析。结果示：1q21扩增组（拷贝数≥4）患者生存（P=0.034），中位OS时间为15.4个月（P=0.006）；1q21获得组患者与1q21正常组患者预后的差异无统计学意义（图2）。

图2

1q21异常对多发性骨髓瘤患者无进展生存期（A）和总生存期（B）的影响

4．“双打击”对MM患者预后的影响：依据Walker等2019年提出的“双打击”定义，本研究中“双打击”MM患者的中位PFS时间（8.4个月）显著短于非“双打击”患者（14.2个月）（P=0.011）（图3）。“双打击”患者的中位OS时间（22.2个月）也显著短于非“双打击”患者（39.2个月）（P<0.001）（图3）。多因素Cox风险预后模式分析提示“双打击”是导致患者PFS（HR=2.171，95%CI1.206~3.907，P=0.010）和OS（HR=4.106，95%CI 2.116~7.969，P<0.001）不良的独立预后因素。

图3

“双打击”与非“双打击”多发性骨髓瘤患者的无进展生存曲线（A）及总体生存曲线（B）

5．“双打击”和R-ISS分期对MM患者预后的预测价值：我们的研究显示，“双打击”患者的OS率显著低于R-ISS分期Ⅲ期的患者（P=0.001）（图4）。R-ISS分期为Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期患者的3年OS率分别为53.3%、52.1%和30.2%，而“双打击”患者3年OS率为0，提示“双打击”患者总体生存时间短，预后极差（表2）。在预后风险评估中，由于15例“双打击”患者中11例为R-ISS Ⅲ期，因此主要与R-ISS分期Ⅰ期的患者进行预后风险比较。结果示，“双打击”患者较ISS分期Ⅰ期患者OS、PFS不良的预后风险系数分别为5.900（95%CI 1.688~20.622，P=0.005）和2.614（95%CI 1.088~6.280，P=0.032）（表3）。

图4

“双打击”与不同R-ISS分期多发性骨髓瘤患者的无进展生存曲线（A）及总体生存曲线（B）

表2

“双打击”及不同R-ISS分期多发性骨髓瘤患者的总体生存（OS）率及中位OS时间

分期	1年OS率（%）	2年OS率（%）	3年OS率（%）	中位OS时间（月）
R-ISS Ⅰ期	90.0	80.0	53.3	未达到
R-ISS Ⅱ期	85.0	70.1	52.1	37.6
R-ISS Ⅲ期	71.4	52.8	30.2	24.3
“双打击”	66.7	40.0	0	22.2

表3

“双打击”与不同R-ISS分期多发性骨髓瘤患者总体生存（OS）期和疾病无进展生存（PFS）期的风险比

	HR（95%CI）	P值
OS
R-ISS Ⅱ期对Ⅰ期	1.900（0.575～6.282）	0.293
R-ISS Ⅲ期对Ⅰ期	3.054（0.906～10.288）	0.072
“双打击”对R-ISS Ⅰ期	5.900（1.688～20.622）	0.005
PFS
R-ISS Ⅱ期对Ⅰ期	1.522（0.709～3.271）	0.282
R-ISS Ⅲ期对Ⅰ期	1.455（0.652～3.251）	0.360
“双打击”对R-ISS Ⅰ期	2.614（1.088～6.280）	0.032

讨论

研究通过TP53基因测序及FISH结果回顾性分析了我中心89例MM患者中“双打击”患者的临床特征和预后，证实“双打击”MM患者的OS时间不足3年，预后差，属于极高危群体。

MM是一种浆细胞恶性克隆增殖性疾病，在多方面具有显著异质性，包括临床表现、生物学特征、疗效和预后等。如何有效地预测患者预后是指导治疗的重要因素。既往危险度分层体系（包括DS、ISS、R-ISS期等[4],[7]–[9]）各有优劣。2015年国际骨髓瘤工作组重新修订R-ISS分期，纳入细胞遗传学因素[10]–[13]，能够更加精准地预测预后。2013年Ji等[14]报道，一例MM患者同时存在IGH/MYC与IGH/CCND1双融合基因，首次提出“双打击”MM的概念。2019年Walker等提出了“双打击”MM的定义，即“TP53双等位基因失活或ISS Ⅲ期且1q21拷贝数大于3的患者”，其中位PFS时间仅15.4个月，预后极差[2]。2018年美国梅奥诊所更新了mSMART 3.0预后分层系统，也提出了“双打击”和“三打击”MM的概念。2019年Shah等[15]对MRC Myeloma Ⅸ和MRC Myeloma Ⅺ临床试验进行了荟萃分析，基于FISH也界定了何为“双打击”和“三打击”MM。尽管目前尚无统一标准界定“双打击”MM，但所有预后分层体系旨在区分不同危险度的患者，尤其是极高危患者。

本研究按照最新Walker等[2]提出的“双打击”概念回顾性分析了89例MM患者，“双打击”患者共15例（16.85%），明显高于国外报道（6.1%）。15例“双打击”MM患者中11例（68.9%）为R-ISS Ⅲ期，提示“双打击”患者起病急、肿瘤负荷高、进展快、分期晚。在预后分析中，“双打击”患者的中位PFS时间（8.4个月）和中位OS时间（22.2个月）均明显低于非“双打击”患者（中位PFS时间14.2个月，中位OS时间39.2个月），且本研究中“双打击”患者的中位PFS时间明显低于Walker等报道的15.4个月，尽管与国外报道患者存在较大异质性，但可能与我国患者诊断时处于晚期，接受新药的治疗机会受限相关。

Walker等的研究由于LDH资料不全未与R-ISS分期比较预后风险，本研究将“双打击”类型与R-ISS分期进行了比较，发现“双打击”患者的预后不良风险远高于R-ISS分期。R-ISS分期Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期患者的3年OS率分别为53.3%、52.1%和30.2%，然而“双打击”患者3年OS率为0，“双打击”患者较R-ISS Ⅰ期患者OS和PFS不良的预后风险系数分别为5.900和2.614。Cox多因素分析提示“双打击”类型是MM患者预后不良的独立危险因素。

综上所述，本研究发现“双打击”患者占MM患者的比例明显高于国外报道，且预后较R-ISS Ⅲ期患者更差，为极高危群体。鉴别“双打击”患者需借助FISH和TP53基因测序技术，目前FISH检测1q21染色体已在临床常规开展，但未常规描述1q21扩增拷贝数变化，因此建议FISH检测具体到1q21扩增拷贝数量；同时提倡尽早将TP53基因测序项目纳入常规检测从而尽早识别“双打击”类型，优化整体治疗策略。