虽然已陆续发现一些与癌症发生发展相关的功能性长链非编码RNA（lncRNA），但人们对lncRNA功能和机制的研究尚处于起步阶段，目前已知确切功能的lncRNA数量极少。lncRNA与多种血液系统疾病相关，然而其在白血病发病中的作用尚不清楚。我们前期实验揭示了急性白血病（AL ）患儿lncRNA与正常儿童存在明显差异[1 ]，本研究选取差异最显著的AC002454.1，探讨AC002454.1在儿童AL 中的表达及其对NB4 白血病细胞生物学功能的影响。
对象与方法
一、研究对象
选取经细胞形态学、免疫学、细胞遗传学和分子生物学（MICM）分型诊断的初诊AL 患儿43例，其中急性淋巴细胞白血病（ALL）21例、急性髓系白血病（AML ）22例；中位年龄5.85（1.3岁~13.0）岁，男31例、女12例。骨髓象正常的21例非恶性血液病患儿作对照组，中位年龄7.1（0.7~15.0）岁，男9例、女12例。收集骨髓标本用于lncRNA芯片扫描及实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测，并对在儿童AL 中显著异常表达的lncRNA进行验证。标本采集经医院伦理委员会批准及患者知情同意。
二、细胞株和培养
白血病细胞株NB4 购于美国模式培养物集存库（ATCC ）。培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基中，采用37 °C 、含5% CO2 的恒温无菌培养箱培养。
三、主要试剂
基因芯片表达配套试剂盒购自美国Agilent公司；SuperRT cDNA第一链合成试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；SYBR Green mix购自瑞士Roche公司；Cell Counting Kit -8试剂盒购自上海华雅思创生物科技有限公司；溴化乙锭（PI）、Triton X-100 购自上海生工生物工程技术服务有限公司；RNase A购自美国Thermo Scientific公司；PE Annexin Ⅴ Apoptosis Detection Kit 1购自美国BD公司；RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒购自江苏碧云天生物技术研究所；TRIzol 、SDS 、聚丙烯酰胺、蛋白Marker购自美国Invitrogen公司；PVDF 膜、化学发光试剂盒购自美国Millipore公司；鼠抗人GAPDH 抗体、鼠抗人CDK6 抗体、鼠二抗购自美国Cell Signaling Technology公司。
四、实验方法
1．lncRNA芯片扫描和数据分析：将骨髓单个核细胞标本加入1 ml TRIzol ，干冰运输至上海康成生物工程有限公司进行，经过Microarray基因芯片扫描仪扫描后得到原始数据，原始数据经过统计软件转换后进行统计分析，经过图像采集和数据分析后得到lncRNA数据，设定差异表达的标准：差异改变倍数≥2.0，P<0.05，根据此标准筛选得到AL 患儿与对照组之间lncRNA的差异表达谱。
2．qRT-PCR：利用实时荧光定量PCR仪（LightCycler 480® Ⅱ，瑞士Roche公司产品）检测lncRNA相对表达量，由Invitrogen公司合成引物。定量PCR扩增反应体系20 µl，含0.2 mmol/L引物各0.1 µl，10 µl SYBR Green mix；反应条件：95 °C 预变性10 min，95 °C 变性15 s，60 °C 退火15 s，72 °C 延伸60 s，共进行45个循环，后95 °C 10 s，65 °C 60 s，4 °C ∞。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH ）为内参基因，以104×2−ΔCT计算每个基因的相对表达量。
3．细胞株的收获与冻存：待NB4 细胞处于对数生长期，细胞密度达1×l06/ml时收获细胞。1 500 r/min离心5 min，弃上清，保留细胞沉淀，每管中各加入1 ml冻存液，混匀，编号后放入−80 °C 冰箱保存。
4．RNA的提取和cDNA合成：采用TRIzol 提取细胞的总RNA后，采用分光光度计测定RNA浓度，通过琼脂糖凝胶电泳评估RNA纯度。将所得的RNA利用SuperRT cDNA第一链合成试剂盒10 µl体系逆转录cDNA。
5．AC002454.1沉默病毒的设计、合成及细胞转染：AC002454.1沉默病毒由上海吉凯基因化学技术有限公司完成。根据试剂盒说明书操作。实验分为3组：实验组为NB4 细胞转染时加入AC002454.1沉默病毒；阴性对照组为NB4 细胞转染时加入阴性对照病毒；空白对照组为未进行任何干预的NB4 细胞。并利用流式细胞仪检测转染效率。
6．CCK -8法检测细胞增殖：收集空白对照组、阴性对照组及实验组对数生长期细胞（5×104/ml）分别接种于4块96孔板中，空白对照组、阴性对照组、实验组及培养基对照组各设5个平行孔，培养24、48、72、96 h检测细胞增殖情况，按照CCK -8试剂盒操作说明，检测前每孔各加入20 µl CCK -8试剂，后于37 °C 、5%CO2 恒温培养箱孵育2 h，于酶标仪检测，在450 nm波长处读取相应的吸光度（A）值。
7．细胞周期检测：取对数生长期细胞，制备单细胞悬液；PBS 洗涤2次，离心后弃上清液；加入预冷的75%乙醇固定，吹打均匀，4 °C 固定过夜；检测前离心，PBS 洗涤2次；加入500 µl PBS （含50 µg/ml PI）、100 µg/ml RNase A、0.2% Triton X-100 ，4 °C 避光孵育30 min；流式细胞术检测各周期DNA含量。实验重复3次。
8．细胞凋亡检测：制备单细胞悬液，调整细胞密度，以每孔2×105细胞接种于6孔板，培养48 h，PBS 洗涤2次，离心收集并重悬计数，保证每个待检样本细胞量为（5~10）×105个；离心收集细胞后，加入100 µl 1×结合缓冲液，吹匀；加入5 µl 7-ADD及5 µl PE ，25 °C 避光放置，流式细胞术检测分析；结果判定：左下象限显示活细胞；其余象限为凋亡细胞。
9．Western blot法测定蛋白表达：收集各组细胞采用RIPA裂解液裂解后提取蛋白，应用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。取20 µg总蛋白行SDS -PAGE，然后转移至聚偏二氟乙烯膜，膜封闭后加入一抗孵育过夜，TBST洗膜后加入二抗稀释液封闭1 h，洗涤后用增强的化学发光试剂盒显影，利用Amersham Imager 600显像系统扫描条带。
五、统计学处理
采用SPSS 17.0软件进行统计处理，同时采用GraphPad Prism 5软件进行绘图。结果以均数±标准差表示，两样本均数的比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1．筛选并验证儿童AL 异常表达的lncRNA：从前期研究基因芯片数据中选取了97个异常表达的lncRNA，对21个儿童ALL样本、22个儿童AML 样本和21个对照样本进行qRT-PCR验证并比较。结果显示：和对照样本比较，儿童ALL组16个lncRNA表达差异显著（P值均<0.05），其中9个上调（uc002ehu.1、AC002454.1、uc001guz.2、BC035649、uc001kpt.2、AK123765、NR_026776、NR_027182、ENST00000508489），7个下调（ENST00000415964、uc010arh.1、ENST00000457799、ENST00000511213、NR_002712、X61079、ENST00000417930）；儿童AML 组24个lncRNA表达差异显著（P值均<0.05），其中12个上调（AC002454.1、uc002ehu.1、ENST00000509150、uc001guz.2、ENST00000457457、uc001kpt.2、NR_027182、AK123765、BC031319、AK124936、uc003hhv.1、NR_026776），12个下调（AK027193、AK024584、BC005232、AK094982、uc003ebe.1、ENST00000512129、AF088004、uc002vje.1、uc010arh.1、ENST00000428188、ENST00000457799、ENST00000415964）。AC002454.1表达差异最显著（P=0.040，P=0.002），尤其在AML 组表达明显升高（图1）。
图1 AC002454.1在对照组、急性淋巴细胞白血病（ALL）组和急性髓系白血病（AML）组的表达
2．AC002454.1沉默病毒的构建及转染效率：构建沉默AC002454.1的慢病毒载体并转染至NB4 细胞中。多次行转染实验，当转染条件被优化到转染效率>50%时，行下一步实验的检测（图2）。
图2 AC002454.1沉默病毒对NB4细胞的转染效率
A：流式细胞术显示NB4转染组的效率为80.2%；B：实时荧光定量PCR实验显示沉默AC002454.1基因的慢病毒载体可以下调NB4细胞的AC002454.1的表达
AC002454.1沉默病毒对NB4细胞的转染效率
A：流式细胞术显示NB4 转染组的效率为80.2%；B：实时荧光定量PCR实验显示沉默AC002454.1基因的慢病毒载体可以下调NB4 细胞的AC002454.1的表达
3．AC002454.1对NB4 细胞增殖的影响：用沉默AC002454.1的慢病毒载体转染NB4 细胞，采用CCK -8细胞增殖检测试剂盒分析其对细胞增殖的影响，结果显示48、72、96 h实验组均出现细胞增殖抑制（P值均<0.01）（图3）。
图3 下调AC002454.1表达对NB4细胞增殖的影响（实验重复3次。与阴性对照组比较，aP<0.01）
4．AC002454.1对NB4 细胞周期的影响：流式细胞术检测结果显示，下调AC002454.1表达后G2/M期NB4 细胞比例显著增加（P<0.01）（图4）。
图4 下调AC002454.1表达对NB4细胞周期的影响（实验重复3次。与阴性对照组比较，aP<0.01）
5．AC002454.1对NB4 细胞凋亡的影响：流式细胞术结果显示，空白对照组、阴性对照组、实验组的凋亡率分别为（0.80±0.53）%、（0.80±0.44）%和（4.53±0.90）%，下调AC002454.1表达后NB4 细胞凋亡率增加（P=0.003）。
6．AC002454.1对CDK6 蛋白表达的影响：采用Western blot方法检测转染后的NB4 细胞CDK6 表达。结果显示，下调AC002454.1表达后NB4 细胞的CDK6 蛋白表达下降（图5）。
图5 Western blot法检测下调AC002454.1表达后NB4细胞CDK6蛋白的表达
1：空白对照组；2：阴性对照组；3：实验组
Western blot法检测下调AC002454.1表达后NB4细胞CDK6蛋白的表达
1：空白对照组；2：阴性对照组；3：实验组
讨论
目前研究提示lncRNA的功能异常与人类多种肿瘤密切相关，如MALAT1 是最早发现与肿瘤相关的lncRNA之一，在肺癌、膀胱癌、乳腺癌等多种肿瘤中发现MALAT1 水平上调，提示MALAT1 可促进肿瘤细胞增殖导致肿瘤发生[2 ]。MEG3 被发现有肿瘤抑制功能，在多种正常组织尤其是脑组织中呈现高表达，但在肺癌、肝细胞癌、脑膜瘤等肿瘤表达下降[3 ]。lncRNA在白血病发生、发展过程中的作用也有较多探索。Hirano等[4 ]发现，CCDC26 通过调节KIT 表达来控制髓样白血病细胞的生长，KIT 抑制剂可能是对CCDC26 有改变的AML 患者有效的治疗药物。Trimarchi等[5 ]发现，LUNAR1 能够调控IGF1R基因的表达、IGF1信号转导和T-ALL的生长，表明LUNAR1 可以作为T-ALL的生物标志物和治疗靶点。Guo等[6 ]发现BGL3 可以作为竞争性内源RNA结合miR-17、miR-93、miR-20a 、miR-20b 、miR-106a和miR-106b来交叉调节PTEN 表达，同时BCR-ABL 通过c -Myc 依赖性DNA甲基化抑制BGL3 表达，揭示了BCR-ABL 介导的细胞转化关键需要肿瘤抑制因子BGL3 的沉默，并且提出了用于治疗BCR-ABL 阳性白血病的潜在策略。以上研究提示，lncRNA在白血病的发生、发展中发挥重要作用，可作为白血病诊断的标志物，也是白血病治疗的潜在药物靶点。本研究从基因芯片数据中选取了97个异常表达的lncRNA，对21个儿童ALL样本、22个儿童AML 样本和21个对照样本进行qRT-PCR验证并比较，结果发现AC002454.1表达差异最显著。对于AC002454.1目前少有研究，仅有研究提示AC002454.1可能参与子宫内膜异位症的发病机制[7 ]。本研究显示AC002454.1在AL 患儿的表达显著高于对照组，尤其在AML 表达更为显著，提示AC002454.1可能作为癌基因参与儿童AL 的发生和发展。
本研究用沉默AC002454.1的慢病毒载体转染白血病细胞株NB4 ，分析AC002454.1对NB4 细胞增殖和细胞周期的影响，结果显示沉默AC002454.1表达后NB4 细胞增殖受到明显抑制，G2/M期显著延长。研究表明G2/M期阻滞的细胞非常易于凋亡，其增殖能力明显降低[8 ]，提示AC002454.1对NB4 细胞的增殖起促进作用并可抑制其凋亡。
本研究前期对基因芯片生物信息经Pathway与GO分析均提示，儿童AL 中显著上调的lncRNA在细胞周期中可能具有重要功能，我们查阅（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene）网站，AC002454.1位于人类染色体7: 92836483-92917187，正靠近CDK6 （位于人类染色体7: 92604921-92836627）。
CDK6 是细胞周期素依赖激酶（Cyclin-Dependent Kinases, CDK）的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族中的一员，CDK主要负责哺乳动物细胞的增殖，参与细胞周期进展和细胞分化[9 ]。研究表明CDK6 可以通过结合EYA2 蛋白并促进其降解，直接调控细胞周期，并在某些类型的细胞增殖和分化中起着重要的作用[10 ]。业已证实，在人体的很多肿瘤中CDK6 、E2F-1表达均呈组蛋白修饰长链非编码RNA出现异常，其与肿瘤的发生发展有密切联系。高表达的CDK6 可以促进白血病细胞的增殖及阻碍细胞分化，从而导致了白血病的发生，CDK6 还是MLL -AF4 融合蛋白的直接靶点，促进MLL 基因重排的白血病细胞增殖，是MLL 基因重排的白血病发生和进展的重要因素[11 ]–[13 ]。现有研究发现，CDK4/6 抑制剂可通过抑制Rb磷酸化而抑制人类表皮生长因子受体2阳性乳腺癌细胞增殖[14 ]。在造血系统疾病方面，CDK4/6 抑制剂Pd0332991 通过阻滞细胞于G1期来抑制Ph+ ALL细胞株的增殖[15 ]。 为探讨AC002454.1与CDK6 间的相关性，本实验采用Western blot方法检测转染后NB4 细胞的CDK6 表达。结果显示：下调AC002454.1表达后NB4 细胞的CDK6 表达明显低于空白对照组及阴性对照组，提示下调AC002454.1能降低NB4 细胞CDK6 表达，有望作为治疗白血病的靶标之一。
综上所述，AC002454.1在AL 儿童表达明显高于正常儿童，说明AC002454.1可能参与儿童白血病的发生和发展。AC002454.1有促进NB4 细胞增殖和抑制其凋亡、并使其G2/M期缩短影响细胞周期的功能。下调AC002454.1表达后NB4 细胞的CDK6 表达明显降低，提示AC002454.1可能通过增强CDK6 表达促进白血病细胞的增殖，然而AC002454.1与CDK6 相互作用机制尚不清楚，将在我们今后的研究中进一步探讨。
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