[Effect of minimal residual disease monitoring by multiparameter flow cytometry pre-conditioning on prognosis of acute myeloid leukemia after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation].

Objective: To investigate the effect of minimal residual disease (MRD) monitoring by multiparameter flow cytometry (MFC) pre-conditioning on prognosis of acute myeloid leukemia in first complete remission (CR(1)-AML) after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT) , and to explore the value of MRD monitoring by MFC in the prognosis evaluation on allo-HSCT in CR(1)-AML.
Methods: Between April 2012 and March 2015, consecutive 186 patients with CR(1)-AML who underwent allo-HSCT were analyzed retrospectively. MRD in BM before conditioning was detected by eight-color MFC. Any level of residual disease was considered to be MRD positive.
Results: ①Of 186 patients, MRD was negative in 151 patients, positive in 35 patients (<1% in 25 patients and 1% to 3% in 10 patients) . ② With the median follow up of 18 (5-41) months, two-year DFS was 80.0% (95%CI 68.5%-92.3%) . Univariate analysis showed that MRD positive patients had lower DFS[62.9% (95%CI 50.6%-75.2%) vs 88.9% (95%CI 76.6%-100.0%) , P<0.001], higher relapse[11.4% (95%CI 4.1%-29.0%) vs 3.3% (95% CI 0.6%-20.9%) , P=0.003] and higher NRM [25.7% (95% CI 8.1%-43.3%) vs 7.9% (95% CI 1.3%-26.5%) , P=0.001] after HSCT compared with that of MRD negative patients. Secondary AML showed lower DFS than primary AML [60.0% (95% CI 42.4%-76.6%) vs 86.0% (95% CI 68.4%-100.0%) , P=0.004]. ③Multivariate analysis indicated that MRD positive pre-HSCT was the independent risk factor on DFS [HR=4.565 (95%CI 2.918-9.482) , P<0.001], relapse [HR=5.854 (95%CI 1.538-22.288) , P=0.010] and NRM [HR=3.379 (95%CI 1.361-8.391) , P=0.009] after allo-HSCT in CR(1)-AML.
Conclusion: MRD positive pre-conditioning was the only negative impact factor for patients with CR(1)-AML after allo-HSCT. MRD by MFC can be used to assess the prognosis of CR(1)-AML after allo-HSCT.

异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）是部分急性髓系白血病（AML）细胞形态学达到第1次完全缓解（CR1）后的治愈手段，但复发仍然是其治疗失败的主要原因。急性淋巴细胞白血病（ALL）移植前存在微小残留病（MRD）与MRD阴性患者相比复发率高、总生存率低[1]–[2]。但是移植前MRD是否同样对AML移植预后存在影响目前尚无定论。有研究报道AML患者预处理前多参数流式细胞术（MFC）监测到MRD提示allo-HSCT后复发率高、无病生存（DFS）率低[2]。但是也有研究报道MRD对AML移植预后的影响可以被allo-HSCT的移植物抗白血病（GVL）效应所减弱[3]。本研究中，我们回顾性分析2012年4月至2015年4月186例在我中心进行allo-HSCT的CR1-AML患者，主要评估预处理前MFC监测的MRD对AML移植预后的影响。

病例与方法

1．病例：回顾性分析2012年4月至2015年4月在本中心进行allo-HSCT的186例AML患者，预处理前均获CR1。按照2008年WHO造血及淋巴组织肿瘤分类来定义AML，细胞遗传学分层参照文献[4]标准。危险分层按照2015年美国国立综合癌症网络（NCCN）AML标准，移植时机和供者选择参照文献[5]标准。

2．MFC监测MRD：采用8色FACS CantoⅡ流式细胞仪（购自美国BD公司）对预处理前AML患者骨髓标本进行MRD检测。以下情况判断MRD阳性：①CD34、CD117、HLA-DR阳性的髓系原始细胞出现CD7、CD56、CD19、CD96等淋系表达或出现CD15/CD11b的早晚共表达；②CD34/CD117/HLA-DR/CD45/SSc这些正常表达标志和参数荧光强度发生改变。

3．预处理方案：175例患者采用静脉白消安（Bu）（0.8 mg/kg，每6 h 1次，−9~−6 d）联合环磷酰胺（Cy）（1.8 g·m−2·d−1，−5~−4 d）或氟达拉滨（Flu）30 mg·m−2·d−1，−6~−2 d）方案。11例采用TBI（总量1 200 cGy）联合Cy（1.8 g·m−2·d−1，−5~−2 d）或Flu（30 mg·m−2·d−1，−6~−2 d）方案。全相合无关供者移植和半相合移植在此基础上加用兔抗人淋巴细胞球蛋白（5 mg·kg−1·d−1，−5~−2 d，总量20 mg/kg）[安斯泰来制药（中国）有限公司产品]或者兔抗人胸腺细胞球蛋白（2.5 mg·kg−1·d−1，−4~−2 d）（法国赛诺菲制药有限公司产品）。

4．造血干细胞输注方式：采用G-CSF（7.5~10.0 µg/kg）动员供者干细胞连续5 d，动员第4天采集供者骨髓，第5天采集外周血干细胞。如果采集单个核细胞（MNC）数和CD34 +细胞数未达到预期（MNC>5.0×108/kg，CD34+细胞>2.5×106/kg），第6天再次采集。

5．干细胞植活标准：中性粒细胞绝对值连续3 d≥ 0.5×109/L的第1天为粒细胞植活。在不输注血小板情况下，PLT连续7 d≥20×109/L的第1天为血小板植活。供受者性别不同者以FISH方法进行性染色体检查鉴定供者细胞植入情况，性别相同者采用短串联重复序列基因位点和性染色体基因位点AMEL的DNA测序分析鉴定供者细胞植入情况。

6．移植物抗宿主病（GVHD）预防和诊治：采用环孢素A（CsA）或他克莫司（FK506）+吗替麦考酚酯（MMF）+短程甲氨蝶呤（MTX）进行GVHD的预防和治疗，根据个体化状况调整剂量或停药。急性GVHD（aGVHD）与慢性GVHD（cGVHD）诊断和分级分别采用文献[6]–[7]标准。当出现Ⅱ级以上aGVHD时，加用甲泼尼龙1~2 mg/kg，疗效欠佳时联合CD25单抗、间充质干细胞、TNF-α单抗治疗。

7．随访：采用门诊、住院病历查阅和电话联系方式进行随访，随访截至2015年12月30日，中位随访18（5~41）个月。主要观察指标为DFS时间（回输完干细胞至复发或随访截止日期的时间）、复发与非复发死亡（移植后28 d内任何原因引起的死亡或移植28 d后非复发原因所造成的死亡）。复发定义为骨髓原始细胞比例大于5%或外周血出现原始细胞或出现髓外白血病变。次要观察指标为GVHD与感染发生情况。

8．统计学处理：MRD阴性组与阳性组临床特征、累积GVHD发生率及感染情况的比较，连续变量采用Mann-Whitney U检验，分类变量采用χ2检验。采用Kaplan-Meier曲线计算DFS率、复发率、非复发死亡率（NRM）及GVHD发生率；采用Kaplan-Meier曲线的Log-rank检验进行单因素分析，采用Cox回归模型进行多因素分析。

结果

1．患者临床特征及移植情况：186例AML患者中151例MRD阴性；35例MRD阳性，其中25例MRD<1%，10例MRD为1%~3%。MRD阴性与MRD阳性患者临床特征及移植情况见表1，基线情况差异均无统计学意义。

表1

186例移植前多参数流式细胞术检测有无微小残留病（MRD）急性髓系白血病（AML）患者基本临床特征比较

临床特征	MRD阴性组（151例）	MRD阳性组（35例）	z值/χ2值	P值
中位年龄[岁，M（范围）]	22（2~50）	33（1.8~64）	2.376	0.063
移植前病程[月，M（范围）]	6（2~31）	6（1~26）	1.416	0.243
性别（例，男/女）	83/68	22/13	2.624	0.141
初诊时WBC[例（%）]			3.231	0.085
≥50×109/L	37（14.6）	10（28.6）
<50×109/L	114（75.4）	25（71.4）
达CR1所需化疗疗程数[例（%）]			4.623	0.092
1个	93（61.6）	12（34.3）
2个	43（28.5）	9（25.7）
≥3个	15（9.9）	14（40.0）
AML类型[例（%）]			2.818	0.153
原发性	142（94.0）	29（82.9）
继发性	9（6.0）	6（17.1）
巩固化疗疗程数[例（%）]			3.214	0.130
0个	22（14.6）	16（45.7）
1个	27（17.9）	7（20.0）
2个	34（22.5）	2（5.7）
≥3个	68（45.0）	10（28.6）
NCCN危险分层[例（%）]			2.312	0.323
低危	38（25.2）	5（14.3）
中危	60（39.7）	16（45.7）
高危	53（35.1）	14（40.0）
移植前ANC与 PLTa [例（%）]			2.631	0.181
正常	75（49.7）	11（31.4）
异常	76（50.3）	24（68.6）
预处理方案[例（%）]			1.741	0.432
TBI+Cy /Flu	9（6.0）	2（5.7）
Bu+Cy /Flu	142（94.0）	33（94.3）
移植类型[例（%）]			4.132	0.091
同胞全相合移植	38（25.2）	8（22.9）
无关供者移植	22（14.6）	5（14.3）
半相合移植	91（60.2）	22（62.8）
干细胞来源[例（%）]			1.471	0.215
骨髓+外周血	136（90.0）	30（85.7）
外周血	15（10.0）	5（14.3）
输注MNC中位数[×108/kg，M（范围）]	8.2（3.2~22.4）	8.2（3.0~21.4）	2.513	0.324
输注CD34+细胞中位数[106/kg，M（范围）]	4.29（1.01~18.68）	4.32（0.81~17.68）	2.742	0.346

注：CR1：第1次完全缓解；NCCN：美国国立综合癌症网络；TBI：全身照射；Cy：环磷酰胺；Flu：氟达拉滨；Bu：白消安；MNC：单个核细胞。a ANC≥2.0×109/L且PLT≥100×109/L为正常，其他情况为异常

2．造血重建：中性粒细胞植入中位时间为14（8~23）d，血小板植入中位时间为12（4~56）d。2例患者（1例无关供者移植、1例半相合移植）原发植入失败，其中1例（无关供者移植）自行骨髓恢复，1例（半相合移植）在第1次移植后43 d进行了二次半相合移植。

3．预后因素分析：186例AML患者2年总体DFS率为80.0%（95%CI 68.5%~92.3%）。对影响DFS、复发、及NRM的因素进行单因素分析，结果见表2。与MRD阴性组比较，MRD阳性组DFS率低[62.9%（95% CI 50.6%~75.2%）对88.9%（95% CI 76.6%~100.0%），P<0.001]、复发率高[11.4%（95% CI 4.1%~29.0%）对3.3%（95%CI 0.6%~20.9%），P=0.003]、NRM高[25.7%（95% CI 8.1%~43.3%）对7.9%（95% CI 1.3%~26.5%），P=0.001]；与原发性AML比较，继发性AML组DFS率低[60.0%（95% CI 42.4%~76.6%）对86.0%（95% CI 68.4%~100.0%），P=0.004]、NRM高[33.3%（95%CI 15.7%~50.9%）对9.4%（95%CI 2.0~27.0），P=0.003]；初诊时WBC≥50×109/L组复发率高于<50×109/L[6.5%（95%CI 2.3%~24.1%）对0，P=0.052]；巩固化疗1个疗程复发率为14.3%（95%CI 3.0%~31.9%），高于其他各组（P=0.009）。将上述因素纳入Cox回归模型，分别进行DFS、复发及非复发死亡的多因素分析，结果见表3，预处理前MFC检测的MRD阳性是DFS、复发及NRM的独立危险因素。

表2

影响186例急性髓系白血病患者预后的单因素分析（P值）

影响因素	无病生存	复发	非复发死亡
年龄（<14岁/≥14岁）	0.159	0.301	0.314
初诊时WBC（≥50×109/L/<50×109/L）	0.086	0.052	0.452
达CR1所需化疗疗程数（1个/2个/≥3个）	0.174	0.158	0.590
疾病类型（原发性/继发性）	0.004	0.524	0.003
巩固化疗疗程数（0个/1个/2个/≥3个）	0.171	0.009	0.727
NCCN危险分层（低危/中危/高危）	0.573	0.313	0.724
移植前ANC与PLT（正常/异常）a	0.747	0.822	0.594
MRD（阴性/阳性）	<0.001	0.003	0.001
预处理方案（TBI+Cy /Flu/ Bu+Cy /Flu）	0.322	0.474	0.475
供者类型（同胞全相合/无关供者/半相合）	0.976	0.801	0.797

注：CR1：第1次完全缓解；NCCN：美国国立综合癌症网络；MRD：微小残留病；TBI：全身照射；Cy：环磷酰胺；Flu：氟达拉滨；Bu：白消安。a ANC≥2.0×109/L且PLT≥100×109/L为正常，其他情况为异常

表3

影响186例急性髓系白血病患者预后的多因素分析

因素	无病生存			复发			非复发死亡
	HR	95%CI	P值	HR	95%CI	P值	HR	95%CI	P值
MRD（阴性/阳性）	4.565	2.918~9.482	<0.001	5.854	1.538~22.288	0.010	3.379	1.361~8.391	0.009
疾病类型（原发性/继发性）	3.542	1.453~7.654	0.076	1.142	0.012~4.231	0.285	2.821	0.985~8.078	0.053
初诊时WBC（≥50×109/L/<50×109/L）	3.074	0.978~6.543	0.080	2.432	0.432~5.341	0.987	1.302	0.432~5.214	0.254
巩固化疗疗程数	2.207	0.762~5.432	0.137	3.458	1.132~7.142	0.063	1.543	0.543~6.412	0.741

注：MRD：微小残留病

年龄（是否≥14岁）、达CR1诱导化疗疗程数、NCCN危险因素分层、预处理前ANC与PLT是否正常、供者类型、预处理方案并非DFS、复发和非复发死亡的影响因素。

4．GVHD发生情况：总体Ⅱ~Ⅳ度aGVHD和Ⅲ~Ⅳ度aGVHD累积发生率分别为23.6%（95%CI 6.0%~41.2%）和12.2%（95%CI 3.1%~29.8%）；局限型cGVHD和广泛型cGVHD累积发生率分别为46.5%（95% CI 28.9%~64.1%）和23.4%（95% CI 5.8%~42.0%）。其中MRD阴性组Ⅱ~Ⅳ度aGVHD [20.5%（95% CI 2.9%~18.1%）对37.1%（95% CI 20.0%~54.7%），P=0.033]和Ⅲ~Ⅳ度aGVHD[8.71%（95% CI 0.6%~26.3%）对26.9%（95% CI 10.0%~44.0%），P=0.002]累积发生率明显低于MRD阳性组；MRD阴性组局限型cGVHD[45.4%（95% CI 27.8%~63.0%）对52.3%（95%CI 34.7%~69.9%），P=0.414]和广泛型cGVHD[24.7%（95% CI 7.1%~42.3%）对15.4%（95%CI 1.2%~33.0%），P=0.700]累积发生率与MRD阳性组比较差异无统计学意义。

5．感染情况：127例（68.2%）患者发生CMV血症，26例（13.9%）发生EBV血症；81例（43.5%）发生出血性膀胱炎。45例患者新发肺部感染，52例新发其他部位感染。MRD阴性与阳性组各种感染发生率差异均无统计学意义（表4）。

表4

移植前多参数流式细胞术检测有无微小残留病（MRD）急性髓系白血病患者感染发生情况[例数（%）]

组别	例数	CMV血症	EBV血症	出血性膀胱炎	肺部感染	其他部位感染
MRD阳性组	35	25（71.4）	9（25.7）	18（52.4）	12（34.2）	13（37.1）
MRD阴性组	151	102（67.5）	17（11.2）	63（41.7）	33（21.8）	39（25.8）
χ2值		2.653	3.542	1.231	0.009	0.643
P值		0.567	0.063	0.783	0.963	0.348

讨论

Allo-HSCT是部分AML的治愈手段，但是即便是移植前达到了传统评估疗效的细胞形态学缓解，复发仍然是其治疗失败的主要原因，提示细胞形态学缓解不足以精确评估残留肿瘤负荷。尽管PCR是目前监测MRD最敏感的方法，但是仅有50%左右的AML有分子生物学标志，无法对每例患者进行分子水平MRD监测[8]。与PCR相比，几乎每例AML患者都可以采用MFC来进行MRD检测，且MFC结果回报快[9]，因此，MFC被越来越多应用于AML患者MRD监测[10]。在AML诱导及巩固治疗过程中监测到MRD以及allo-HSCT后出现MRD阳性提示复发率高已经被广泛证实[11]–[13]。但是移植前MRD阳性是否同样对移植后的AML预后产生影响目前尚无统一定论。

Walter等[2]首次在2011年报道了进行清髓allo-HSCT的99例CR1-AML患者，移植前MFC检测的MRD阳性与阴性患者相比，2年总生存（OS）率分别为30.2%和76.6%，复发率分别为64.9%和17.6%，提示移植前MFC监测到的MRD阳性组复发率高、OS率低，是影响预后的独立危险因素。紧接着Walter等[14]又报道了183例CR1和70例第2次CR（CR2）接受allo-HSCT的AML患者，与CR1-AML相似，CR2-AML患者MFC监测的MRD阳性与阴性组2年OS率分别为44%和73%，复发率分别为68%和19%，提示同样在CR2-AML中，移植前MFC监测的MRD阳性是allo-HSCT预后的影响因素。但是Leung等[3]认为与在ALL中不一样，移植前MFC监测的MRD不同水平对allo-HSCT治疗AML的影响不大，考虑对AML GVL强于ALL，allo-HSCT可以减弱移植前MRD对AML的影响。Tian等[15]在2014年报道allo-HSCT治疗CR1-AML研究中，MFC监测的MRD阴性与阳性组OS率分别为51%和41%，差异无统计学意义（P=0.37）。

本研究中，allo-HSCT治疗CR1-AML的2年总体DFS率达到了80.0%，特别是在预处理前MRD阴性患者，2年DFS率达到了88.9%，复发率仅为4.3%；而在MRD阳性患者中，2年DFS率则明显降低为62.9%，复发率增高至11.8%，同时MRD阳性患者NRM明显高于MRD阴性患者，而且单因素和多因素分析均提示预处理前MRD是否阳性是影响DFS、复发率、NRM的预后因素，与Walter等[2],[14]报道的基本一致。与其他影响预后因素例如年龄、诱导CR1所需的疗程、移植前ANC与PLT是否恢复正常、NCCN危险分层、预处理方案、移植类型无明显相关性，说明allo-HSCT可以减弱这些因素对CR1-AML预后的影响。

既然预处理前MFC检测出MRD阳性是影响allo-HSCT治疗CR1-AML独立预后危险因素，因此，在今后治疗AML过程中，首先尽量争取预处理前达到MRD阴性；其次，对于不能达到MRD阴性而持续阳性的患者，有必要通过加强预处理强度、移植后快速减免疫抑制剂、主动输注供者淋巴细胞等干预措施去减低复发的风险。

总而言之，本研究结果提示预处理前MFC检测的MRD阳性是影响allo-HSCT治疗CR1-AML独立危险因素；allo-HSCT治疗CR1-AML获得了较高的DFS率，特别是在预处理前MRD阴性患者中；allo-HSCT减弱了细胞遗传学和分子生物学对CR1-AML预后的影响。