Identifying activating mutations in the EGFR gene: prognostic and therapeutic implications in non-small cell lung cancer.

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths worldwide. Promising new therapies have recently emerged from the development of molecular targeted drugs; particularly promising are those blocking the signal transduction machinery of cancer cells. One of the most widely studied cell signaling pathways is that of EGFR, which leads to uncontrolled cell proliferation, increased cell angiogenesis, and greater cell invasiveness. Activating mutations in the EGFR gene (deletions in exon 19 and mutation L858R in exon 21), first described in 2004, have been detected in approximately 10% of all non-squamous non-small cell lung cancer (NSCLC) patients in Western countries and are the most important predictors of a response to EGFR tyrosine-kinase inhibitors (EGFR-TKIs). Studies of the EGFR-TKIs gefitinib, erlotinib, and afatinib, in comparison with platinum-based regimens, as first-line treatments in chemotherapy-naïve patients have shown that the EGFR-TKIs produce gains in progression-free survival and overall response rates, although only in patients whose tumors harbor activating mutations in the EGFR gene. Clinical trials have also shown EGFR-TKIs to be effective as second- and third-line therapies in advanced NSCLC. Here, we review the main aspects of EGFR pathway activation in NSCLC, underscore the importance of correctly identifying activating mutations in the EGFR gene, and discuss the main outcomes of EGFR-TKI treatment in NSCLC.

Introduction

Because of its high incidence and high mortality, lung cancer represents a major challenge for modern oncology. In Brazil, there were an estimated 27,330 new cases of lung cancer in 2014.1 Recent global estimates indicate that there are 1.6 million new cases and 1.4 million lung cancer deaths each year, the majority of cases (55%) occurring in developing countries.(2,3) Historically, non-small cell lung cancer (NSCLC) presents response rates to classical cytotoxic chemotherapy in the range of 20-30%, the median overall survival typically being 8-10 months.4 The recent development of novel therapeutic agents directed at targets that are aberrantly activated in cancer cells, particularly those within the signal transduction machinery, has opened new vistas for the treatment of NSCLC.

Among the components of the neoplastic phenotype, potential therapeutic targets include cell surface receptors, which have been the focus of intensive research because they play an important role in the processes of cell proliferation, survival, and invasiveness. Remarkable progress has been achieved with the advent of EGFR tyrosine-kinase inhibitors (EGFR-TKIs), which are able to inhibit EGFR signal transduction. Among patients with NSCLC, those with tumors that harbor activating mutations in the EGFR gene can benefit from treatment with an EGFR-TKI. It is therefore important that such patients are correctly identified in clinical practice. Ten years after activating mutations in the EGFR gene were recognized as being the most important predictors of a response to EGFR-TKIs,(5,6) the present article will review the literature related to the EGFR signaling pathway and to activating mutations in the EGFR gene, as well as discussing the implications of this knowledge for daily practice.

EGFR and its signaling pathways

Cell surface receptors, which are proteins located in the plasma membrane, play a key role in cellular and tissue physiology. These receptors are activated by stimuli that originate from the external environment (ligands), generating intracellular signals that are transduced by multiple molecular cascades, in which successive phosphorylation of substrates activates the transcription of genes involved in cell proliferation, differentiation, invasion, angiogenesis, metastasis, and resistance to apoptosis. The ErbB receptor family, also known as the c-erb-B or human EGFR (HER) family, has four members: EGFR (or c-erb-B1 or HER-1), c-erb-B2 (or HER-2/neu), c-erb-B3 (or HER-3), and c-erb-B4 (or HER-4). The structure of EGFR, first described in the 1960s by Cohen,7 comprises three domains: the extracellular domain (the N-terminal portion); the transmembrane domain; and the intracellular C-terminal domain (a hydrophobic portion with tyrosine-kinase activity). The extracellular domain confers binding specificity, ligands including EGF itself as well as TGF-α, amphiregulin, and betacellulin.8 The intracellular domain is capable of phosphorylating tyrosine residues within the receptor itself (autophosphorylation) and within proteins involved in signal transduction.

The interaction between EGFR ligands and the extracellular domain of the receptor leads to its dimerization,9 which promotes the activation of the tyrosine-kinase domain located in the intracellular domain of the receptor. Once active, the latter domain promotes autophosphorylation of specific sites within the C-terminal domain of EGFR.10 Signal transduction is then continued by the interaction of those autophosphorylation sites with proteins that contain a Src homology 2 domain or a phosphotyrosine binding domain.11 Various phosphorylation sites have been identified in the C-terminal domain of EGFR, each leading to interaction with different types of molecules and activation of various cellular pathways. Foremost among these is the Ras/Raf/mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway, in which the adaptor protein Grb2 binds to phosphorylated tyrosine residues of EGFR, thus activating the Son of sevenless protein.12 This protein in turn activates the G-protein Ras, which initiates a cascade of phosphorylation of MAPKs, which are specific serine/threonine kinases. Those proteins in turn activate gene transcription related to various regulatory functions, including cell division, motility, and adhesion.13 Another important pathway related to EGFR and activated in NSCLC is that mediated by PI3K, which is responsible for activation of serine/threonine kinase Akt. Together with the mammalian target of rapamycin, Akt participates in the regulation of many cellular processes, such as glycolytic metabolism, apoptosis, proliferation, and angiogenesis.14

The role that EGFR plays in carcinogenesis became clearer after the identification (in the 1980s) of the v-erb-B oncogene protein, which is related to avian erythroblastosis virus and structurally similar to EGFR.15 The mechanisms leading to increases in proliferative activity, invasiveness, and angiogenesis, as well as in resistance to chemotherapy and radiotherapy, include paracrine and autocrine stimulation in the tumor microenvironment through increased production of ligands (mainly EGF and TGF-α), overexpression of EGFR molecules on the membrane of tumor cells, and activating mutations in the EGFR gene, all of which affect their signal transduction pathways.16

The development of EGFR-TKIs for the treatment of NSCLC

As studies have clarified the role of EGFR in carcinogenesis, interest in inhibiting the tyrosine-kinase activity of EGFR has grown. The first EGFR-TKIs were synthesized in the 1990s. The 4-anilinoquinazoline derivative gefitinib (ZD1839; AstraZeneca, London, England) was the first EGFR-TKI to obtain approval from the US Food and Drug Administration (FDA). In 2003, the FDA approved gefitinib for the treatment of advanced NSCLC after failure of conventional therapy.17 In 2004, another EGFR-TKI, erlotinib (OSI-774; Genentech, Roche Group, South San Francisco, CA, USA) was approved by the FDA for the treatment of NSCLC after failure of cytotoxic chemotherapy.18 More recently (in 2014), the irreversible ErbB family blocker afatinib (BIBW-2992; Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Ingelheim am Rhein, Germany) was also approved by the FDA for clinical use in chemotherapy-naïve patients whose tumors harbor activating mutations in the EGFR gene.19

Mechanisms of action

Inhibition of the tyrosine-kinase activity of EGFR, whether reversibly (by gefitinib and erlotinib) or irreversibly (by afatinib), is due to the competition of these drugs with ATP molecules for binding sites in the C-terminal domain (catalytic sites) of the receptor. Blocking the phosphorylation of those sites prevents signal transduction through downstream components of the pathway by blocking activation of, for example, the MAPK and PI3K/Akt/mammalian target of rapamycin pathways.20 As a result, these TKIs interfere with important aspects of tumor viability, leading to reduced proliferation, survival, and angiogenesis of cancer cells, as well as promoting their apoptosis by increasing their sensitivity to the toxic effects of chemotherapy and radiotherapy.21

Results from clinical trials in unselected populations

Before activating mutations in the EGFR gene had been identified as predictors of a response to EGFR-TKIs,(5,6) clinical trials were conducted in unselected populations of patients with advanced NSCLC. Two sequential phase II trials evaluating the activity of gefitinib in patients with NSCLC previously treated with cytotoxic chemotherapy showed response rates of up to 19%, median overall survival of approximately 8 months, and one-year survival of up to 35%.(22,23) However, in two sequential phase III trials, the combination of gefitinib and platinum-based conventional chemotherapy, as a first-line treatment, was not found to be superior to placebo plus chemotherapy, with no significant differences being found in terms of response rates or overall survival.(24,25) Likewise, two separate phase III trials showed that the combination of erlotinib and cytotoxic chemotherapy did not improve response rates or overall survival in comparison with chemotherapy alone.(26,27)

An international, randomized, placebo-controlled trial of treatment with erlotinib after the failure of standard chemotherapy for NSCLC, involving 731 patients with advanced NSCLC that had previously been treated with first- or second-line platinum-based chemotherapy, was conducted between August of 2001 and January of 2003. 28 Among those patients (some of whom were treated in Brazil), erlotinib led to improvements in overall survival (median of 6.7 months in the erlotinib-treated group vs. 4.7 months in the placebo group; hazard ratio [HR] = 0.70; p < 0.001) and in one-year survival (31% vs. 22%). The response rate was also higher in the erlotinib group (8.9% vs. < 1%; p < 0.001). It is of note that the authors of that study identified specific subgroups of patients in which treatment with erlotinib provided greater benefit: those with adenocarcinoma; those who were female; those of Asian descent; and those with no smoking history. Those results corroborated the emerging body of literature regarding which patients are most likely to derive clinical benefit from the use of EGFR-TKIs.(22,23,29) A study using a similar design compared gefitinib with placebo in 1,692 patients with advanced refractory NSCLC and demonstrated that the median progression-free survival was significantly longer in the gefitinib-treated group (2.2 months vs. 1.8 months; HR = 0.61; p < 0.001).30 However, that was considered a negative study, because there was no significant difference in the primary endpoint, i.e., overall survival. Another phase III trial involving an unselected population compared gefitinib with docetaxel in 1,443 patients with advanced NSCLC after failure of platinum-based, first-line chemotherapy.31 In that study, gefitinib was not found to be inferior to docetaxel in terms of median overall survival (7.6 months vs. 8.0 months; HR = 1.02). It is noteworthy that pemetrexed has also been shown to be comparable to docetaxel in this setting.32

Activating mutations in the EGFR gene and response to EGFR-TKIs

Independent work by two groups led to the seminal discovery that tumors responding to an EGFR-TKI typically harbor activating mutations, most often located in exon 19 (del19) or exon 21 (L858R) of the EGFR gene.(5,6) These mutations cause structural alterations in the ATP-binding site of the intracellular domain of EGFR, thus increasing the affinity for TKIs and leading to clinical responses. Although the first four exons encoding the tyrosine-kinase domain of EGFR (exons 18 through 21) have been identified as major sites for activating mutations, small deletions in exon 19 and point mutations in exon 21 account for over 90% of such mutations.33 Other, less common mutations have also been identified, including specific nucleotide substitutions at codon 719 of exon 18 (G719S) and insertions at codon 20.34 Exon 19 deletions and the L858R mutation lead to a constitutively activated receptor state, as well as to a greater response upon ligand stimulation.35 It has also been shown that these mutations lead to constitutive activation of Akt, which translates to greater survival.36 Activating mutations in the EGFR gene have been observed in 8-15% of all NSCLC patients worldwide and in 25-30% of those in Brazil.(37,38)

Some patients who show an initial response to first-generation TKIs (erlotinib and gefitinib) experience disease progression, and many of those patients display secondary EGFR mutations or MET amplification. Approximately 50% of such patients have tumors that harbor the T790M mutation, and another ≈20% have tumors with MET amplifications.(39,40) Specific inhibitors of the T790M mutation (AZD9291 and CO1696) are under study, as are potential MET inhibitors (onartuzumab and tivantinib).40 However, none of those have proven to be clinically effective in this scenario.41 The second-generation EGFR-TKI afatinib is an irreversible ErbB family blocker that is effective in patients with the more common mutations and seems to be effective even in patients with the less common mutations, including the T790M mutation in exon 20, which is one of the main mechanisms of resistance to first-generation EGFR-TKIs.39

Clinical studies in mutation-rich populations

The findings described above paved the way for a novel generation of clinical trials that aimed to evaluate the performance of EGFR-TKIs in populations selected for activating mutations in the EGFR gene. The results from the main studies are summarized in Table 1.

Table 1

Randomized trials of EGFR-TKIs in selected populations rich in activating mutations in the EGFR gene.

Reference	N	Prevalence of EGFR mutations	TKI	Response rate*		Progression-free survival*
				(%)		(median in months)
		(%)		TKI	CT	p	TKI	CT	HR	p
Mok et al.42	1,217	60	G	71	47	< 0.001	10.0	6.0	0.48	< 0.001
Maemondo et al.43	230	100	G	74	31	< 0.001	10.8	5.4	0.36	< 0.001
Mitsudomi et al.44	177	100	G	62	32	< 0.0001	9.2	6.3	0.49	< 0.0001
Zhou et al.45	165	100	E	83	36	< 0.0001	13.0	4.6	0.16	< 0.0001
Rosell et al.46	174	100	E	58	15	< 0.0001	9.7	5.2	0.37	< 0.0001
Sequist et al.47	345	100	A	56	23	0.001	11.1	6.9	0.58	0.001
Wu et al.48	364	100	A	67	23	< 0.001	11.0	5.6	0.28	< 0.0001

A: afatinib; CT: chemotherapy; E: erlotinib; G: gefitinib; HR: hazard ratio; and TKI: tyrosine-kinase inhibitor. *Among patients with EGFR mutations.

A phase III clinical trial of the EGFR-TKI gefitinib, in comparison with the carboplatin-paclitaxel combination, in patients with advanced lung adenocarcinoma (designated the IPASS study, conducted in Asia) included patients with clinical features known to be associated with a higher rate of response to TKIs.42 The patients, all of whom were nonsmokers or former light smokers, were randomized to first-line treatment with gefitinib or with carboplatin plus paclitaxel. The one-year progression-free survival rate was higher in the gefitinib arm than in the carboplatin-paclitaxel arm (24.9% vs. 6.7%). In addition to achieving its primary objective of demonstrating the non-inferiority of gefitinib as a first-line treatment for advanced lung adenocarcinoma in clinically selected patients, the IPASS study also demonstrated the superiority of gefitinib in this setting. In addition, retrospective evaluation of the EGFR mutation status in tumor samples demonstrated that even within the clinically selected IPASS population, a response to gefitinib correlated strongly with the presence of activating mutations in the EGFR gene, corroborating their predictive role. Among the mutation-positive patients, the objective response rate to gefitinib was 71.2%, compared with 47.3% for the carboplatin-paclitaxel combination, whereas the inverse was observed among the patients with no mutations, who showed objective response rates to gefitinib and to the carboplatin-paclitaxel combination of 1.1% and 23.5%, respectively. The IPASS data also demonstrate that tumors harboring activating mutations in the EGFR gene are more chemosensitive, showing higher response rates than do wild-type tumors. Maemondo et al.43 also evaluated gefitinib, in comparison with the carboplatin-paclitaxel combination, as first-line therapy in patients whose tumors harbored activating mutations in the EGFR gene. The authors found that the median progression-free survival among the patients treated with gefitinib was 10.8 months, double the 5.4 months observed among the patients treated with the carboplatin-paclitaxel combination. In addition, the one- and two-year progression-free survival rates were 42.1% and 3.2%, respectively, in the gefitinib group, compared with 8.4% and 0%, respectively, in the carboplatin-paclitaxel group. Finally, the objective response rate was significantly higher in the gefitinib group than in the carboplatin-paclitaxel group (73.7% vs. 30.7%).43 In a similar study, Mitsudomi et al.44 compared gefitinib with cisplatin plus docetaxel as the first-line treatment of patients with mutations. As in the other studies cited, the median progression-free survival and objective response rate were better in the gefitinib group (9.2 months vs. 6.3 months and 62.1% vs. 32.2%, respectively).

A phase III trial comparing the EGFR-TKI erlotinib with the gemcitabine-carboplatin combination showed that the former provided significant gains in progression-free survival (median, 13.1 months vs. 4.6 months) and in the objective response rate (83% vs. 36%).45 Another phase III trial of erlotinib, designated the EURTAC study,46 was the first to compare it with platinum-based chemotherapy as a first-line therapy in Caucasian patients with activating mutations in the EGFR gene. The authors of that study also reported that, in comparison with the cytotoxic chemotherapy, treatment with erlotinib provided significant gains in progression-free survival (median, 9.7 months vs. 5.2 months) and in the objective response rate (58% vs. 15%).

In a phase III trial designated the LUX-Lung 3 study,47 afatinib was compared with the current standard of cisplatin plus pemetrexed in the first-line treatment of Asian and non-Asian patients with adenocarcinoma. The authors found that progression-free survival was significantly better in the afatinib group (median, 11.1 months vs. 6.9 months). In that study, the superiority of afatinib over the cisplatin-pemetrexed combination was found to be even greater in patients with common mutations, such as del19 and L858R. It is noteworthy that the LUX-Lung 3 study used the cisplatin-pemetrexed combination, which is considered more effective, as a reference treatment. In a subsequent phase III trial, designated the LUX-Lung 6 trial,48 afatinib was compared with gemcitabine plus cisplatin in Asian patients with tumors harboring EGFR mutations. Median progression-free survival and the response rate were better in the afatinib group than in the gemcitabine-cisplatin group (11 months vs. 5.6 months and 67% vs. 23%, respectively).48 Cross-trial comparisons indicate that afatinib provides the longest progression-free survival. A recent combined analysis of the LUX-Lung 3 and LUX-Lung 6 studies (the largest of such trials) suggested an overall survival gain for afatinib over chemotherapy, mainly in patients whose tumors harbor exon 19 deletions.49

Despite the markedly better activity of first- and second-generation EGFR-TKIs, when compared with traditional chemotherapy, no difference in overall survival has been found among mutation-rich populations. In the majority of patients with EGFR mutations, second-line treatment with an EGFR-TKI was used in those who had disease progression after chemotherapy, thus obscuring the treatment effect of these agents on overall survival, something that has been demonstrated for the IPASS and EURTAC trials. (46,50) Consequently, when EGFR genotype results are not available, we suggest starting conventional cytotoxic platinum-based chemotherapy in patients with tumor-related symptoms and introducing an EGFR-TKI only after a mutation has been detected. An EGFR-TKI could also be used as maintenance therapy, or even as a second-line treatment, given that EGFR-TKIs have been shown to have no negative impact on survival.51

One of the common adverse effects of EGFR-TKIs is papulopustular (acneiform) rash, which is in fact a favorable prognostic and predictive factor of a response to such drugs. Other reported adverse effects include gastrointestinal symptoms (such as hyperbilirubinemia, diarrhea, nausea, and anorexia), dyspnea, fatigue, and edema, although all of these effects are generally well tolerated and manageable.52

All EGFR-TKIs have some penetration across the blood-brain barrier and are therefore effective modes of therapy for patients with central nervous system metastases, as well as being well tolerated by such patients.53 Treatment with an EGFR-TKI is particularly helpful when such metastases are small, because it can (in some cases) allow radiation therapy or surgery to be postponed.53 A recent phase II study confirmed that it is feasible to continue treatment with an EGFR-TKI (erlotinib) in patients with asymptomatic progressive disease-as determined on the basis of the response evaluation criteria in solid tumors-and showed that such treatment has no impact on overall survival.54 However, antacids that modify gastric pH can affect absorption and thus reduce the efficacy of EGFR-TKIs.55

Diagnosing EGFR mutations

Given the role of activating mutations as predictors of a benefit from EGFR-TKIs, there is a clear need to accurately genotype tumor samples obtained from patients with NSCLC. In some studies, large-scale screening for such mutations has proven feasible. The most widely studied activating mutations (EGFR mutations, Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog mutations, and echinoderm microtubule-associated protein-like 4-anaplastic lymphoma kinase rearrangement) are usually mutually exclusive. Therefore, in day-to-day practice, physicians can discontinue the molecular investigation when one such mutation is identified. It is of note that, because these types of mutations occur in only 5% of patients with squamous cell carcinoma, such patients are not routinely screened for them. In addition, even if an activating mutation is identified, there is no clear evidence that treatment with EGFR-TKIs provides a benefit in cases of squamous cell carcinoma.56

General recommendations

At present, there are guidelines recommending screening for EGFR mutations in patients with advanced pulmonary adenocarcinoma who are candidates for first-line therapy with erlotinib, gefitinib, or afatinib, regardless of performance status or smoking history. However, in the adjuvant therapy scenario, it is not recommended to incorporate such screening into the clinical routine, because of the scarcity of data regarding the use of EGFR-TKIs in patients with localized or locally advanced disease.57 It is recommended that greater attention be paid to patients with adenocarcinoma and to those who are never-smokers. Ideally, sample collection for molecular testing should be done at the time of the histological classification of the tumor, the ideal turnaround time being ≤ 7 days. It should be borne in mind that mutation screening in blood samples is still considered experimental.58 Careful consideration should be given to the type of biopsy, taking into account the number of malignant cells likely to be present in the sample, because some mutation-detection techniques require large fractions of tumor cells in the sample. Tissue for molecular testing can be obtained by bronchoscopy, mediastinoscopy, thoracoscopy, pleural biopsy (for malignant pleural effusion), or CT-guided percutaneous biopsy. Endobronchial ultrasound with transbronchial biopsy can also be helpful in select cases. Obtaining bone samples is feasible, although they must be processed only by laboratories with experience, in order to avoid losses. However, other biopsy sites are preferred, if available.

Direct DNA sequencing

First described by Sanger in 1977,59 direct DNA sequencing has contributed greatly to the development of biotechnology, culminating in the sequencing of a large part of the human genome. The method relies on the so-called dideoxy reaction, in which dideoxynucleotides (ddNTPs) are used in order to interrupt the replication of the genetic material, thus generating segments of different sizes. Fluorescently labeled ddNTPs can reveal the sequence of DNA bases in the sample through the analysis of the various bands thus generated. Although well established and reliable, direct sequencing requires samples containing a large fraction of tumor cells, usually more than 30% of the sample, a proportion not easily obtained, given that non-neoplastic tissue often comprises most of the biopsy material. Newer sequencing methods show great potential for future application; among them, pyrosequencing deserves mention, because it can detect mutations in samples containing only 0.2% tumor cells. This extremely sensitive technique can be used in order to detect EGFR mutations in pleural effusion samples containing only 10% of neoplastic cells. However, the method is still not widely available and requires sophisticated, expensive equipment.60

Methods based on PCR

The PCR technique can be used not only to amplify genetic material but also to detect mutations of interest. One of the PCR methods most commonly used for the latter purpose is the amplification refractory mutation system (ARMS), which is based on the differential activity of the enzyme Taq DNA polymerase during amplification of sequences that have mismatch points at 3'. The primers used in the ARMS reaction, when pairing with mutated sequences, generate mismatch points, allowing detection of mutations through the identification of differences in the band patterns generated. Kimura et al.61 reported interesting results from the use of the ARMS technique in samples comprising less than 1% mutant EGFR-containing material. According to the College of American Pathologists, laboratories should use EGFR tests that are able to identify mutations in specimens with at least 50% cancer cells, although it has recently encouraged the use of more sensitive tests that can detect mutations in specimens with less than 10% cancer cells.62 The technique known as TaqMan PCR uses probes that are specific for the wild-type and mutant sequences of EGFR. The presence of mutated sequences is indicated by the fluorescence peaks generated. Jian et al.63 were able to identify mutations in samples comprising at least 10% mutant EGFR-containing material.63 This approach facilitates testing by using a single step, no post-PCR processing being required. Variations of the PCR technique include other sensitive methods that apply selective amplification of mutated sequences. Such variations, which display high sensitivity in samples with low proportions of mutant EGFR-containing material, include mutant-enriched PCR assay, peptide nucleic acid-locked nucleic acid PCR clamping, and the smart-amplification process. Using mutant-enriched PCR assay, Asano et al.64 detected mutations that were present in only 0.05% of the tumor samples evaluated. These techniques provide new possibilities for developing diagnostic tests that will be capable of detecting mutations in a less invasive manner, often using small samples.

RFLP

The RFLP technique is based on the use of restriction enzymes, which cleave sequences of genetic material at specific sites. As a result, DNA segments of different sizes are generated according to the presence of mutations. Those segments in turn present different patterns of electrophoretic mobility, which allows the detection of mutations through the analysis of the band patterns observed. Using this method, Pan et al.65 detected mutations that were present in proportions as low as 6.25% for exon 19 deletions and 3.25% for L858R.

Other techniques

Several other methods for the detection of EGFR mutations have been described. Probes designed specifically for the detection of mutated alleles, such as the cycleave probe, emit a fluorescence peak in the presence of the mutation and have shown good results with samples in which at least 5% of the cells harbor mutations.66 Other methods include the so-called loop-hybrid mobility shift assay, the single-strand conformation polymorphism technique, and HPLC. The latter technique, which is a means of comprehensively characterizing the DNA sequence under study and not only previously known mutations, has shown good sensitivity in samples with only 1% mutated material.67 Finally, if labeled antibodies are directed against mutant EGFR proteins resulting from the transcription of EGFR genes with known activating mutations, immunohistochemistry can be used to detect mutations of interest. The validation of mutation-specific immunohistochemistry in clinical practice is eagerly awaited, because this technique could greatly facilitate the identification of the patients most likely to benefit from treatment with EGFR-TKIs.68

Final considerations and perspectives

The latest guidelines for the classification of lung adenocarcinoma recommend including EGFR genotyping in the diagnostic algorithm.69 The appropriate selection of patients who are potential candidates for EGFR-TKI therapy becomes even more critical when one considers other genetic alterations observed in lung adenocarcinomas, such as RAS mutations, anaplastic lymphoma kinase translocations, and HER-2 amplification. Some of these alterations seem to be mutually exclusive and can also be targeted by specific therapies under development or already in clinical use.70 Genome-wide projects evaluating multiple genetic changes in patient samples have shown promising results and might lead to the identification of relevant targets for future intervention.71 Data in the Cancer Genome Atlas suggest that pulmonary adenocarcinoma could be classified by molecular subtype based on next-generation sequencing reads, the new nomenclature for the transcriptional subtypes being terminal respiratory unit (formerly bronchioid), proximal-inflammatory (formerly squamoid), and proximal-proliferative (formerly magnoid). Adenocarcinomas that present activating mutations in the EGFR gene are clustered in the terminal respiratory unit subtype. The other two subtypes (proximal-inflammatory and proximal-proliferative) do not seem to be associated with EGFR-mutated tumors.72

In advanced NSCLC patients with EGFR-wild type tumors, the use of EGFR-TKIs cannot be considered a valid second-line treatment option after failure of a platinum-based regimen.73 In patients with known activating mutations, a TKI can be used as a first-line treatment and should be maintained until there is clinically documented disease progression.(74,75) This "personalized medicine" approach represents a new frontier in modern oncology, in which the treatment of each cancer patient will be targeted according to genetic alterations present in the tumors-treating the right patient with the right drug, at the right dose, and at the right time.

Introdução

Em virtude de sua elevada incidência e mortalidade, o câncer de pulmão é um grande desafio para a oncologia moderna. Estima-se que tenha havido 27.330 novos casos de câncer de pulmão em 2014 no Brasil.1 Estimativas globais recentes indicam que haja 1,6 milhões de novos casos e 1,4 milhões de mortes por câncer de pulmão a cada ano; a maioria (55%) dos casos ocorre em países em desenvolvimento.(2,3) Historicamente, as taxas de resposta do carcinoma pulmonar de células não pequenas (CPCNP) à quimioterapia citotóxica clássica variam de 20 a 30%; a mediana da sobrevida global é tipicamente de 8-10 meses.4 O recente desenvolvimento de novos agentes terapêuticos cujos alvos são ativados de modo aberrante em células cancerosas, particularmente nas vias de transdução de sinais, abriu novas perspectivas de tratamento de CPCNP.

Dentre os componentes do fenótipo neoplásico, os receptores de superfície celular são potenciais alvos terapêuticos e têm sido o foco de intensa pesquisa, pois desempenham um papel importante nos processos de proliferação, sobrevivência e invasão celular. Alcançou-se notável progresso com o advento dos tyrosine-kinase inhibitors (inibidores de tirosina quinase) do EGFR (EGFR-TKIs), que são capazes de inibir a transdução de sinais do EGFR. Dentre os pacientes com CPCNP, aqueles com tumores que abrigam mutações ativadoras do gene EGFR podem se beneficiar do tratamento com um EGFR-TKI. É, portanto, importante que esses pacientes sejam corretamente identificados na prática clínica. Dez anos depois de as mutações ativadoras do gene EGFR terem sido reconhecidas como sendo os mais importantes preditores de resposta a EGFR-TKIs,(5,6) o presente artigo irá revisar a literatura relativa à via de sinalização do EGFR e a mutações ativadoras do gene EGFR, além de discutir as implicações desse conhecimento na prática diária.

EGFR e as suas vias de sinalização

Os receptores de superfície celular, que são proteínas localizadas na membrana plasmática, desempenham um papel fundamental na fisiologia celular e tissular. Esses receptores são ativados por estímulos provenientes do ambiente externo (ligantes), gerando sinais intracelulares que são transduzidos por múltiplas cascatas moleculares, em que a fosforilação sucessiva de substratos ativa a transcrição de genes envolvidos na proliferação, diferenciação, invasão, angiogênese, metástase e resistência à apoptose celular. A família de receptores ErbB, também conhecida como família c-erb-B ou família de human EGFRs (HERs, receptores do fator de crescimento epidérmico humano), tem quatro membros: EGFR (ou c-erb-B1 ou HER-1), c-erb-B2 (ou HER-2/neu), c-erb-B3 (ou HER-3) e c-erb-B4 (ou HER-4). A estrutura do EGFR, descrita pela primeira vez na década de 1960 por Cohen,7 compreende três domínios: o domínio extracelular (a porção N-terminal); o domínio transmembrana e o domínio C-terminal intracelular (uma porção hidrofóbica com atividade de tirosina quinase). O domínio extracelular confere especificidade de ligação; os ligantes incluem o próprio EGF, TGF-α, anfirregulina e betacelulina.8 O domínio intracelular é capaz de fosforilar resíduos de tirosina dentro do próprio receptor (autofosforilação) e de proteínas envolvidas na transdução de sinais.

A interação entre ligantes do EGFR e o domínio extracelular do receptor leva a sua dimerização,9 que promove a ativação do domínio tirosina quinase localizado no domínio intracelular do receptor. Uma vez ativado, este último domínio promove a autofosforilação de locais específicos dentro do domínio C-terminal do EGFR.10 A transdução de sinais então continua por meio da interação entre esses locais de autofosforilação e proteínas que contêm um domínio SH2 ou um domínio de ligação à fosfotirosina.11 Vários sítios de fosforilação foram identificados no domínio C-terminal do EGFR, cada qual levando à interação com diferentes tipos de moléculas e à ativação de diversas vias celulares. A principal delas é a via Ras/Raf/mitogen-activated protein kinase (MAPK, proteína quinase ativada por mitógeno), na qual a proteína adaptadora Grb2 liga-se a resíduos fosforilados de tirosina do EGFR, ativando assim a proteína Son of sevenless.12 Essa proteína por sua vez ativa a proteína G Ras, o que inicia uma cascata de fosforilação de MAPKs, que são quinases serina/treonina específicas. Essas proteínas por sua vez ativam a transcrição gênica relacionada com diversas funções reguladoras, incluindo a divisão, motilidade e adesão celular.13 Outra importante via relacionada com o EGFR e ativada no CPCNP é a via mediada pela PI3K, responsável pela ativação da quinase serina/treonina Akt. Com o alvo da rapamicina em mamíferos, a Akt participa da regulação de muitos processos celulares, tais como o metabolismo glicolítico, a apoptose, a proliferação e a angiogênese.14

O papel que o EGFR desempenha na carcinogênese tornou-se mais claro após a identificação (na década de 1980) da proteína oncogênica v-erb-B, relacionada com o vírus da eritroblastose aviária e estruturalmente semelhante ao EGFR.15 Dentre os mecanismos que levam a um aumento da atividade proliferativa, da capacidade de invasão, da angiogênese e da resistência à quimioterapia e à radioterapia estão a estimulação parácrina e autócrina no microambiente tumoral por meio do aumento da produção de ligantes (principalmente de EGF e TGF-α), da superexpressão de moléculas de EGFR na membrana de células tumorais e de mutações ativadoras do gene EGFR, todos os quais afetam suas vias de transdução de sinais.16

O desenvolvimento de EGFR-TKI para o tratamento de CPCNP

Como estudos esclareceram o papel do EGFR na carcinogênese, tem crescido o interesse na inibição da atividade de tirosina quinase do EGFR. Os primeiros EGFR-TKIs foram sintetizados na década de 1990. O gefitinibe (ZD1839; AstraZeneca, Londres, Inglaterra), um derivado da 4-anilinoquinazolina, foi o primeiro EGFR-TKI a obter a aprovação do Food and Drug Administration (FDA) dos EUA. Em 2003, o FDA aprovou o uso do gefitinibe para o tratamento de CPCNP avançado após o insucesso da terapia convencional.17 Em 2004, outro EGFR-TKI, o erlotinibe (OSI-774; Genentech, Roche Group, South San Francisco, CA, EUA) foi aprovado pelo FDA para o tratamento de CPCNP após o insucesso da quimioterapia citotóxica.18 Mais recentemente (em 2014), o afatinibe (BIBW-2992; Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Ingelheim am Rhein, Alemanha), um bloqueador irreversível da família ErbB, também foi aprovado pelo FDA para uso clínico em pacientes que nunca foram submetidos a quimioterapia e cujos tumores abrigam mutações ativadoras do gene EGFR.19

Mecanismos de ação

A inibição da atividade de tirosina quinase do EGFR, reversivelmente (pelo gefitinibe ou erlotinibe) ou irreversivelmente (pelo afatinibe), ocorre em virtude da competição entre essas drogas e moléculas de ATP por sítios de ligação no domínio C-terminal (sítios catalíticos) do receptor. O bloqueio da fosforilação desses sítios impede a transdução de sinais através de componentes a jusante da via por meio do bloqueio da ativação das vias MAPK e PI3K/Akt/alvo da rapamicina em mamíferos, por exemplo.20 Consequentemente, esses ITQ interferem em aspectos importantes da viabilidade tumoral, levando a redução da proliferação, sobrevivência e angiogênese de células cancerosas e promovendo sua apoptose por meio do aumento de sua sensibilidade aos efeitos tóxicos da quimioterapia e radioterapia.21

Resultados de ensaios clínicos em populações não selecionadas

Antes da identificação de mutações ativadoras do gene EGFR como preditoras de resposta a EGFR-TKIs,(5,6) foram realizados ensaios clínicos em populações não selecionadas de pacientes com CPCNP avançado. Dois ensaios de fase II sequenciais em que se avaliou a atividade do gefitinibe em pacientes com CPCNP previamente tratados com quimioterapia citotóxica mostraram taxas de resposta de até 19%, mediana de sobrevida global de aproximadamente 8 meses e sobrevida em um ano de até 35%.(22,23) No entanto, em dois ensaios de fase III sequenciais, o uso do gefitinibe com quimioterapia convencional baseada em platina como tratamento de primeira linha não se mostrou superior ao placebo com quimioterapia, sem diferenças significativas no tocante às taxas de resposta ou à sobrevida global.(24,25) Da mesma forma, dois ensaios de fase III independentes mostraram que o uso do erlotinibe com quimioterapia citotóxica não melhorou nem as taxas de resposta nem a sobrevida global em comparação com o uso da quimioterapia apenas.(26,27)

Entre agosto de 2001 e janeiro de 2003, foi realizado um ensaio internacional randomizado controlado por placebo, em que se examinou o tratamento com erlotinibe após o insucesso da quimioterapia-padrão para CPCNP em 731 pacientes com CPCNP avançado anteriormente tratados com quimioterapia de primeira ou segunda linha baseada em platina.28 Naqueles pacientes (alguns dos quais foram tratados no Brasil), o erlotinibe resultou em melhora na sobrevida global [mediana de 6,7 meses no grupo erlotinibe vs. 4,7 meses no grupo placebo; razão de risco (RR) = 0,70; p < 0,001] e na sobrevida em um ano (31% vs. 22%). A taxa de resposta foi também mais alta no grupo erlotinibe (8,9% vs. < 1%; p < 0,001). É digno de nota que os autores do estudo supracitado identificaram subgrupos específicos de pacientes nos quais o tratamento com erlotinibe proporcionou maior benefício: pacientes com adenocarcinoma; pacientes do sexo feminino; pacientes de ascendência asiática e pacientes sem história de tabagismo. Esses resultados corroboraram a literatura emergente a respeito de quais pacientes são mais propensos a obter benefício clínico com o uso de EGFR-TKIs.(22,23,29) Um estudo com desenho semelhante comparou o gefitinibe com placebo em 1.692 pacientes com CPCNP avançado refratário e demonstrou que a mediana da sobrevida livre de progressão foi significativamente maior no grupo de pacientes tratados com gefitinibe (2,2 meses vs. 1,8 meses; RR = 0,61; p < 0,001).30 No entanto, o estudo supracitado foi considerado um estudo negativo, pois não houve diferença significativa no desfecho primário, isto é, na sobrevida global. Outro ensaio de fase III com uma população não selecionada comparou o gefitinibe com o docetaxel em 1.443 pacientes com CPCNP avançado após o insucesso da quimioterapia de primeira linha baseada em platina.31 Naquele estudo, o gefitinib não se mostrou inferior ao docetaxel no tocante à mediana da sobrevida global (7,6 meses vs. 8,0 meses; RR = 1,02). É digno de nota que o pemetrexede também se mostrou comparável ao docetaxel nesse cenário.32

Mutações ativadoras do gene EGFR e resposta a EGFR-TKIs

O trabalho independente de dois grupos levou à seminal descoberta de que os tumores que respondem a EGFR-TKIs tipicamente abrigam mutações ativadoras, na maioria das vezes localizadas no éxon 19 (del19) ou no éxon 21 (L858R) do gene EGFR.(5,6) Essas mutações provocam alterações estruturais no sítio de ligação à ATP do domínio intracelular do EGFR, aumentando assim a afinidade com ITQ e levando a respostas clínicas. Embora os quatro primeiros éxons que codificam o domínio tirosina quinase do EGFR (éxons 18 a 21) tenham sido identificados como os principais locais de mutações ativadoras, pequenas deleções no éxon 19 e mutações pontuais no éxon 21 correspondem a mais de 90% dessas mutações. 33 Outras mutações, menos comuns, também foram identificadas, incluindo substituições de nucleotídeos específicos no códon 719 do éxon 18 (G719S) e inserções no códon 20.34 Deleções no éxon 19 e a mutação L858R levam a um estado receptor constitutivamente ativado, bem como a uma maior resposta após a estimulação com ligantes.35 Demonstrou-se também que essas mutações levam à ativação constitutiva da Akt, o que se traduz em maior sobrevida.36 Mutações ativadoras do gene EGFR foram observadas em 8-15% de todos os casos de CPNPC em todo o mundo e em 25-30% dos casos no Brasil.(37,38)

Alguns dos pacientes que exibem resposta inicial a ITQ de primeira geração (erlotinibe e gefitinibe) apresentam progressão da doença, e muitos deles apresentam mutações secundárias do gene EGFR ou amplificação de MET. Aproximadamente 50% desses pacientes têm tumores que abrigam a mutação T790M, e outros 20%, aproximadamente, têm tumores com amplificações de MET.(39,40) Estão sendo estudados inibidores específicos da mutação T790M (AZD9291 e CO1696) e potenciais inibidores de MET (onartuzumabe e tivantinibe).40 No entanto, nenhum deles mostrou-se clinicamente eficaz nesse cenário.41 O afatinibe, um EGFR-TKI de segunda geração, é um bloqueador irreversível da família ErbB que é eficaz em pacientes com as mutações mais comuns e parece ser eficaz inclusive em pacientes com as mutações menos comuns, incluindo a mutação T790M no éxon 20, que é um dos principais mecanismos de resistência a EGFR-TKIs de primeira geração.39

Estudos clínicos em populações ricas em mutações

Os achados descritos acima prepararam o caminho para uma nova geração de ensaios clínicos cujo objetivo foi avaliar o desempenho de EGFR-TKIs em populações selecionadas por apresentarem mutações ativadoras do gene EGFR. Os resultados dos principais estudos estão resumidos na Tabela 1.

Em um ensaio clínico de fase III no qual o EGFR-TKI gefitinibe foi comparado com a associação carboplatina-paclitaxel em pacientes com adenocarcinoma pulmonar avançado - o estudo IPASS, realizado na Ásia - foram incluídos pacientes com características clínicas sabidamente associadas a uma maior taxa de resposta a ITQ.42 Os pacientes, todos os quais eram não fumantes ou ex-fumantes leves, foram aleatoriamente divididos de modo a receber tratamento de primeira linha com gefitinibe ou com a associação carboplatina-paclitaxel. A taxa de sobrevida livre de progressão em um ano foi maior no grupo gefitinibe do que no grupo carboplatina-paclitaxel (24,9% vs. 6,7%). Além de alcançar seu objetivo primário de demonstrar a não inferioridade do gefitinibe como tratamento de primeira linha para adenocarcinoma pulmonar avançado em pacientes clinicamente selecionados, o estudo IPASS também demonstrou a superioridade do gefitinibe nesse cenário. Além disso, a avaliação retrospectiva da mutação EGFR em amostras tumorais demonstrou que, mesmo na população clinicamente selecionada do IPASS, a resposta ao gefitinibe apresentou forte correlação com a presença de mutações ativadoras do gene EGFR, corroborando seu papel preditivo. Nos pacientes nos quais as mutações foram confirmadas, a taxa de resposta objetiva ao gefitinibe foi de 71,2%, contra 47,3% para a associação carboplatina-paclitaxel, ao passo que o inverso foi observado nos pacientes sem mutações, que apresentaram taxas de resposta objetiva ao gefitinibe e à associação carboplatina-paclitaxel de 1,1% e 23,5%, respectivamente. Os dados do IPASS também demonstram que tumores que abrigam mutações ativadoras do gene EGFR são mais quimiossensíveis, com taxas de resposta mais altas que as de tumores selvagens. Maemondo et al.43 também avaliaram o gefitinibe, comparando-o à associação carboplatina-paclitaxel, como terapia de primeira linha em pacientes cujos tumores abrigavam mutações ativadoras do gene EGFR. Os autores observaram que a mediana da sobrevida livre de progressão nos pacientes tratados com gefitinibe foi de 10,8 meses, o dobro dos 5,4 meses observados nos pacientes tratados com a associação carboplatina-paclitaxel. Além disso, as taxas de sobrevida livre de progressão em um e dois anos foram de 42,1% e 3,2%, respectivamente, no grupo gefitinibe, contra 8,4% e 0%, respectivamente, no grupo carboplatina-paclitaxel. Finalmente, a taxa de resposta objetiva foi significativamente maior no grupo gefitinibe do que no grupo carboplatina-paclitaxel (73,7% vs. 30,7%).43 Em um estudo semelhante, Mitsudomi et al.44 compararam o gefitinibe com a associação cisplatina-docetaxel como tratamento de primeira linha para pacientes com mutações. Como nos outros estudos citados, a mediana da sobrevida livre de progressão e a taxa de resposta objetiva foram melhores no grupo gefitinibe (9,2 meses vs. 6,3 meses e 62,1% vs. 32,2%, respectivamente).

Um ensaio de fase III no qual o EGFR-TKI erlotinibe foi comparado à associação gemcitabina-carboplatina mostrou que o erlotinibe proporcionou ganhos significativos na sobrevida livre de progressão (mediana: 13,1 meses vs. 4,6 meses) e na taxa de resposta objetiva (83% vs. 36%).45 Outro ensaio de fase III com o erlotinibe, chamado estudo EURTAC,46 foi o primeiro a compará-lo com quimioterapia baseada em platina como terapia de primeira linha em pacientes brancos com mutações ativadoras do gene EGFR. Os autores do estudo também relataram que, em comparação com a quimioterapia citotóxica, o tratamento com erlotinibe proporcionou ganhos significativos na sobrevida livre de progressão (mediana: 9,7 meses vs. 5,2 meses) e na taxa de resposta objetiva (58% vs. 15%).

Em um ensaio de fase III denominado estudo LUX-Lung 3,47 o afatinibe foi comparado com o padrão atual (a associação cisplatina-pemetrexede) para o tratamento de primeira linha de pacientes asiáticos e não asiáticos com adenocarcinoma. Os autores observaram que a sobrevida livre de progressão foi significativamente melhor no grupo afatinibe (mediana: 11,1 meses vs. 6,9 meses). Naquele estudo, a superioridade do afatinibe em relação à associação cisplatina-pemetrexede foi ainda maior em pacientes com mutações comuns, tais como del19 e L858R. É digno de nota que o estudo LUX-Lung 3 tenha usado a associação cisplatina-pemetrexede, que é considerada mais eficaz, como tratamento de referência. Em um ensaio de fase III subsequente, denominado ensaio LUX-Lung 6,48 o afatinibe foi comparado à associação gemcitabina-cisplatina em pacientes asiáticos com tumores que abrigavam mutações EGFR. A mediana da sobrevida livre de progressão e a taxa de resposta foram melhores no grupo afatinibe do que no grupo gemcitabina-cisplatina (11 meses vs. 5,6 meses e 67% vs. 23%, respectivamente).48 Comparações entre ensaios indicam que o afatinibe proporciona a maior sobrevida livre de progressão. Uma análise combinada recente dos estudos LUX-Lung 3 e LUX-Lung 6 (o maior dos ensaios do tipo) sugeriu um ganho global de sobrevida com o afatinibe em comparação com a quimioterapia, principalmente em pacientes cujos tumores abrigam deleções no éxon 19.49

Embora a atividade dos EGFR-TKIs de primeira e segunda geração seja evidentemente melhor que a da quimioterapia tradicional, não se observou diferença na sobrevida global entre populações ricas em mutações. Na maioria dos pacientes com mutações EGFR, o tratamento de segunda linha com um EGFR-TKI foi usado naqueles que apresentaram progressão da doença após a quimioterapia, obscurecendo assim o efeito que o tratamento com esses agentes teve na sobrevida global, algo que se observou nos ensaios IPASS e EURTAC.(46,50) Consequentemente, quando os resultados dos genótipos do EGFR não estiverem disponíveis, sugerimos que se inicie a quimioterapia citotóxica convencional baseada em platina em pacientes com sintomas relacionados com o tumor e que se introduza um EGFR-TKI somente após a detecção de uma mutação. Um EGFR-TKI pode também ser usado como terapia de manutenção ou mesmo como tratamento de segunda linha, já que se demonstrou que os EGFR-TKIs não têm nenhum impacto negativo na sobrevida.51

Um dos efeitos adversos comuns dos EGFR-TKIs é a erupção cutânea papulopustular (acneiforme), que é na verdade um fator prognóstico e preditivo favorável de resposta a essas drogas. Outros efeitos adversos relatados incluem sintomas gastrintestinais (tais como hiperbilirrubinemia, diarreia, náusea e anorexia), dispneia, fadiga e edema, embora todos esses efeitos sejam geralmente bem tolerados e controláveis.52

Todos os EGFR-TKIs penetram, em maior ou menor grau, a barreira hematoencefálica e são, portanto, eficazes no tratamento de pacientes com metástases do sistema nervoso central, além de serem bem tolerados por esses pacientes.53 O tratamento com um EGFR-TKI é particularmente útil quando essas metástases são pequenas, pois em alguns casos permite que se adie a radioterapia ou a cirurgia.53 Um recente estudo de fase II confirmou que é viável continuar o tratamento com EGFR-TKIs (erlotinibe) em pacientes com doença progressiva assintomática - com base nos critérios de avaliação de resposta em tumores sólidos - e mostrou que esse tratamento não tem impacto na sobrevida global.54 No entanto, os antiácidos que modificam o pH gástrico podem afetar a absorção e, assim, reduzir a eficácia dos EGFR-TKIs.55

Diagnóstico de mutações EGFR

Como as mutações ativadoras podem prever os benefícios dos EGFR-TKIs, é claramente necessário realizar a genotipagem precisa das amostras tumorais obtidas de pacientes com CPCNP. Em alguns estudos, provou-se que é possível realizar o rastreio em larga escala dessas mutações. As mutações ativadoras mais estudadas (mutações EGFR, mutações KRAS e o rearranjo EML4-ALK) geralmente são mutuamente exclusivas. Portanto, na prática diária, os médicos podem interromper a investigação molecular quando uma dessas mutações é identificada. Vale notar que não se investiga rotineiramente a presença dessas mutações em pacientes com carcinoma de células escamosas, pois elas ocorrem em apenas 5% deles. Além disso, mesmo que uma mutação ativadora seja identificada, não há nenhuma evidência clara de que o tratamento com EGFR-TKIs traga benefícios em casos de carcinoma de células escamosas.56

Recomendações gerais

Atualmente, existem diretrizes que recomendam o rastreio de mutações EGFR em pacientes com adenocarcinoma pulmonar avançado candidatos a terapia de primeira linha com erlotinibe, gefitinibe ou afatinibe, independentemente do performance status (estado de desempenho) ou da história de tabagismo. No entanto, no cenário da terapia adjuvante, não se recomenda que se incorpore esse rastreio à rotina clínica, em virtude da escassez de dados sobre o uso de EGFR-TKIs em pacientes com doença localizada ou localmente avançada. 57 Recomenda-se que se dê maior atenção aos pacientes com adenocarcinoma e àqueles que nunca fumaram. Idealmente, as amostras para teste molecular devem ser coletadas no momento da classificação histológica do tumor; o tempo ideal para a entrega dos resultados é ≤ 7 dias. Deve-se ter em mente que o rastreio de mutações em amostras de sangue ainda é considerado experimental.58 Deve-se considerar cuidadosamente o tipo de biópsia, levando-se em conta o número de células malignas que provavelmente estarão presentes na amostra, pois algumas técnicas de detecção de mutações exigem grandes frações de células tumorais na amostra. O tecido para teste molecular pode ser obtido por meio de broncoscopia, mediastinoscopia, toracoscopia, biópsia pleural (para derrame pleural maligno) ou biópsia percutânea guiada por TC. A ultrassonografia endobrônquica com biópsia transbrônquica também pode ser útil em casos seletos. A obtenção de amostras de osso é possível, embora devam ser processadas apenas por laboratórios com experiência, de modo a evitar perdas. No entanto, deve-se dar preferência a outros locais de biópsia, caso estejam disponíveis.

Sequenciamento direto do DNA

Descrito pela primeira vez por Sanger em 1977,59 o sequenciamento direto do DNA tem contribuído muito para o desenvolvimento da biotecnologia, culminando com o sequenciamento de uma grande parte do genoma humano. O método baseia-se na chamada reação de didesoxi, na qual didesoxinucleotídeos (ddNTPs) são usados a fim de interromper a replicação do material genético, gerando, assim, segmentos de diferentes tamanhos. Os ddNTPs marcados com fluorescência são capazes de revelar a sequência de bases do DNA na amostra por meio da análise das diversas bandas assim geradas. Embora esteja bem estabelecido e seja confiável, o sequenciamento direto exige amostras que contenham uma grande fração de células tumorais, geralmente mais de 30% da amostra, uma porcentagem que não é facilmente obtida, pois a maior parte do material obtido por meio de biópsia frequentemente compõe-se de tecido não neoplásico. Novos métodos de sequenciamento têm grande potencial de aplicação no futuro; dentre eles, o pirossequenciamento é digno de nota, pois é capaz de detectar mutações em amostras que contenham apenas 0,2% de células tumorais. Essa técnica extremamente sensível pode ser usada para detectar mutações EGFR em amostras de derrame pleural que contenham apenas 10% de células neoplásicas. No entanto, o método ainda não está amplamente disponível e exige equipamento sofisticado e caro.60

Métodos baseados em PCR

A técnica de PCR pode ser usada não apenas para amplificar o material genético, mas também para detectar mutações de interesse. Um dos métodos de PCR mais comumente usados para este último fim é o amplification refractory mutation system (ARMS, sistema de mutação refratária à amplificação), que se baseia na atividade diferencial da enzima Taq DNA polimerase durante a amplificação de sequências que têm pontos de incompatibilidade em 3'. Os primers (iniciadores) usados na reação de ARMS, quando se emparelham com sequências que sofreram mutação, geram pontos de incompatibilidade, permitindo a detecção de mutações por meio da identificação de diferenças nos padrões de bandas gerados. Kimura et al.61 relataram resultados interessantes a partir do uso da técnica ARMS em amostras com menos de 1% de material contendo EGFR mutante. De acordo com o Colégio Americano de Patologia, os laboratórios devem usar testes de EGFR que sejam capazes de identificar mutações em espécimes com pelo menos 50% de células cancerosas, embora tenha recentemente incentivado o uso de testes mais sensíveis que possam detectar mutações em espécimes com menos de 10% de células cancerosas.62 A técnica conhecida como TaqMan PCR usa sondas que são específicas para as sequências selvagens e mutantes do EGFR. A presença de sequências que sofreram mutação é indicada pelos picos de fluorescência gerados. Jian et al.63 conseguiram identificar mutações em amostras com pelo menos 10% de material contendo EGFR mutante.63 Essa abordagem facilita o teste porque há apenas uma etapa, sem necessidade de processamento pós-PCR. Variações da técnica de PCR incluem outros métodos sensíveis que empregam a amplificação seletiva de sequências que sofreram mutação. Essas variações, que apresentam elevada sensibilidade em amostras com baixas proporções de material contendo EGFR mutante, incluem o ensaio de PCR enriquecido com mutantes, peptide nucleic acid-locked nucleic acid PCR clamping e o processo de amplificação inteligente. Por meio do ensaio de PCR enriquecido com mutantes, Asano et al.64 detectaram mutações que estavam presentes em apenas 0,05% das amostras tumorais avaliadas. Essas técnicas oferecem novas possibilidades para a elaboração de testes diagnósticos que sejam capazes de detectar mutações de modo menos invasivo, muitas vezes com amostras pequenas.

A técnica de RFLP baseia-se no uso de enzimas de restrição, que clivam sequências de material genético em locais específicos. Consequentemente, segmentos de DNA de diferentes tamanhos são gerados de acordo com a presença de mutações. Esses segmentos por sua vez apresentam diferentes padrões de mobilidade eletroforética, o que permite a detecção de mutações por meio da análise dos padrões de bandas observados. Por meio desse método, Pan et al.65 detectaram mutações que estavam presentes em baixas proporções (6,25% para deleções no éxon 19 e 3,25% para L858R).

Outras técnicas

Já foram descritos vários outros métodos para detectar mutações EGFR. Sondas concebidas especificamente para detectar alelos que sofreram mutação, tais como a sonda cycleave, emitem um pico de fluorescência na presença da mutação e apresentaram bons resultados com amostras nas quais pelo menos 5% das células abrigavam mutações.66 Outros métodos incluem o chamado ensaio de alteração de mobilidade de loop-hybrids, a técnica de polimorfismo de conformação de fita simples e a HPLC. A HPLC, que é um meio de caracterizar de maneira abrangente a sequência de DNA que está sendo estudada, e não apenas as mutações já conhecidas, apresentou boa sensibilidade em amostras com apenas 1% de material mutante.67 Finalmente, se anticorpos marcados forem voltados contra proteínas EGFR mutantes resultantes da transcrição de genes EGFR com mutações ativadoras conhecidas, a imuno-histoquímica pode ser usada para detectar mutações de interesse. A validação da imuno-histoquímica para mutações específicas na prática clínica é ansiosamente aguardada, pois essa técnica poderia facilitar sobremaneira a identificação dos pacientes com maior probabilidade de se beneficiar do tratamento com EGFR-TKIs.68

Considerações finais e perspectivas

As mais recentes diretrizes para a classificação de adenocarcinoma pulmonar recomendam que se inclua a genotipagem do EGFR no algoritmo de diagnóstico.69 A seleção adequada de pacientes que sejam potenciais candidatos à terapia com EGFR-TKIs torna-se ainda mais importante quando se consideram outras alterações genéticas observadas em adenocarcinomas pulmonares, tais como mutações RAS, translocações da quinase do linfoma anaplásico e amplificação de HER-2. Algumas dessas alterações parecem ser mutuamente exclusivas e também podem ser alvo de terapias específicas em desenvolvimento ou já em uso clínico.70 Projetos de escala genômica que avaliem múltiplas alterações genéticas em amostras de pacientes têm apresentado resultados promissores e podem levar à identificação de alvos relevantes para futura intervenção.71 Dados do Cancer Genome Atlas sugerem que o adenocarcinoma pulmonar pode ser classificado pelo subtipo molecular com base em leituras de sequenciamento de nova geração; a nova nomenclatura para os subtipos transcricionais é a seguinte: unidade respiratória terminal (anteriormente denominado bronquioide), proximal-inflamatório (anteriormente denominado escamoide) e proximal-proliferativo (anteriormente denominado magnoide). Os adenocarcinomas que apresentam mutações ativadoras do gene EGFR estão agrupados no subtipo unidade respiratória terminal. Os outros dois subtipos (proximal-inflamatório e proximal-proliferativo) não parecem estar associados a tumores com EGFR mutante.72

Em pacientes com CPCNP avançado com tumores com EGFR selvagem, o uso de EGFR-TKIs não pode ser considerado uma opção válida de tratamento de segunda linha após o insucesso de um esquema baseado em platina.73 Em pacientes com mutações ativadoras conhecidas, um ITQ pode ser usado como tratamento de primeira linha e deve ser mantido até que haja progressão da doença clinicamente documentada.(74,75) Essa abordagem típica da "medicina personalizada" representa uma nova fronteira na oncologia moderna, em que o tratamento de cada paciente com câncer será escolhido de acordo com as alterações genéticas presentes nos tumores, o que significa tratar o paciente certo com a droga certa, na dose certa e no momento certo.

Tabela 1

Ensaios randomizados com EGFR-TKI em populações selecionadas ricas em mutações ativadoras do gene EGFR.

Referência	N	Prevalência de mutações EGFR	TKI	Taxa de resposta*		Sobrevida livre de progressão*
				(%)		(mediana em meses)
		(%)		TKI	QT	p	TKI	QT	RR	p
Mok et al.42	1.217	60	G	71	47	< 0,001	10,0	6,0	0,48	< 0,001
Maemondo et al.43	230	100	G	74	31	< 0,001	10,8	5,4	0,36	< 0,001
Mitsudomi et al.44	177	100	G	62	32	< 0,0001	9,2	6,3	0,49	< 0,0001
Zhou et al.45	165	100	E	83	36	< 0,0001	13,0	4,6	0,16	< 0,0001
Rosell et al.46	174	100	E	58	15	< 0,0001	9,7	5,2	0,37	< 0,0001
Sequist et al.47	345	100	A	56	23	0,001	11,1	6,9	0,58	0,001
Wu et al.48	364	100	A	67	23	< 0,001	11,0	5,6	0,28	< 0,0001

A: afatinibe; QT: quimioterapia; E: erlotinibe; G: gefitinibe; RR: razão de risco; e TKI: tyrosine-kinase inhibitor (inibidor de tirosina quinase). *Em pacientes com mutações EGFR.