Detection of Mycobacterium tuberculosis complex by nested polymerase chain reaction in pulmonary and extrapulmonary specimens.

OBJECTIVE: To compare the performance of nested polymerase chain reaction (NPCR) with that of cultures in the detection of the Mycobacterium tuberculosis complex in pulmonary and extrapulmonary specimens.
METHODS: We analyzed 20 and 78 pulmonary and extrapulmonary specimens, respectively, of 67 hospitalized patients suspected of having tuberculosis. An automated microbial system was used for the identification of Mycobacterium spp. cultures, and M. tuberculosis IS6110 was used as the target sequence in the NPCR. The kappa statistic was used in order to assess the level of agreement among the results.
RESULTS: Among the 67 patients, 6 and 5, respectively, were diagnosed with pulmonary and extrapulmonary tuberculosis, and the NPCR was positive in all of the cases. Among the 98 clinical specimens, smear microscopy, culture, and NPCR were positive in 6.00%, 8.16%, and 13.26%, respectively. Comparing the results of NPCR with those of cultures (the gold standard), we found that NPCR had a sensitivity and specificity of 100% and 83%, respectively, in pulmonary specimens, compared with 83% and 96%, respectively, in extrapulmonary specimens, with good concordance between the tests (kappa, 0.50 and 0.6867, respectively).
CONCLUSIONS: Although NPCR proved to be a very useful tool for the detection of M. tuberculosis complex, clinical, epidemiological, and other laboratory data should also be considered in the diagnosis and treatment of pulmonary and extrapulmonary tuberculosis.

Introduction

The World Health Organization estimates that there were between 8.8 and 9.2 million new tuberculosis cases in 2010.() In addition, it is estimated that 1.2 million of those cases are infected by HIV. Furthermore, it is estimated that 1.1 million deaths occurred in HIV-negative tuberculosis patients, which equates to 15 deaths per 100,000 population. Mortality is the most sensitive indicator of tuberculosis control measures(); tuberculosis remains among the top ten causes of death worldwide. The goal of curing 85% of tuberculosis cases, set by the World Health Assembly in 1991, was not achieved in 2009 in 7 of the 22 countries with the highest burden of the disease, including Brazil (at 72%).()

Diagnosis in an early stage of the disease is of paramount importance for treatment initiation, with direct consequences for individual disease control and, therefore, for public health initiatives aimed at the prevention of tuberculosis transmission. Therefore, it is necessary that clinical microbiology laboratories be able to quickly identify mycobacteria by means of microscopy and culture. However, sputum smear tests, although rapid and cost-effective, have low sensitivity and specificity, particularly in paucibacillary samples, and culture, even though it is considered the gold standard due to its high sensitivity, requires several weeks to produce a result.(-)

Currently, Brazil is one of the countries that, together, accounts for 80% of tuberculosis cases, with an incidence of 70,977 cases in 2010.(,) For the majority of those cases, the diagnosis was based only on sputum smear test results; chest X-rays, cultures, and biochemical tests for Mycobacterium spp. were only carried out in patients with negative sputum smear results but with respiratory symptoms.(,) These diagnostic limitations have encouraged the use of molecular tools with improved sensitivity, specificity, and speed, in order to detect mycobacteria in all clinical specimens.(-,) The new technologies that are being developed have recently redefined the diagnosis of tuberculosis, providing a basis for diagnostic laboratory techniques.(5,8) The molecular diagnosis of tuberculosis by polymerase chain reaction (PCR) and primers with high specificity (98%), with high variations in sensitivity (20-100%), has been used in order to identify genetic targets in the bacillus.(,,)

Despite the widespread use of conventional PCR, modifications in the technique, such as the addition of one extra reaction (nested PCR), have increased its sensitivity and specificity.() This might be due to the fact that it dilutes potential PCR inhibitors, which are commonly present in biological samples.() Therefore, the possibility of having access to a molecular tool that leads to a more rapid diagnosis and that is effective for the detection of cases that are difficult to elucidate by conventional tests certainly helps decrease morbidity and improve tuberculosis control. The aim of the present study was to evaluate the technique of nested PCR targeting the insertion sequence IS6110 in Mycobacterium tuberculosis and to compare the results with those obtained in cultures of samples from patients suspected of having pulmonary or extrapulmonary tuberculosis.

Methods

This study was carried out between February and December of 2009. The patients included in the study were submitted to physical evaluation and sample collection at the Hospital de Base, a referral center for the diagnosis and treatment of tuberculosis located in the city São José do Rio Preto, Brazil. Epidemiological and clinical data were obtained from medical records in accordance with a protocol approved by the Research Ethics Committee of Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (São José do Rio Preto School of Medicine; Protocol no. 064/2009). The presence of HIV antibodies, identified by ELISA and confirmed by Western blot, indicated HIV seropositivity.

All of the patients included in the study were over 18 years of age, were immunosuppressed (due to immunosuppression therapy, autoimmune disease, organ transplantation, or HIV-positivity), and presented with clinical symptoms and signs suggestive of pulmonary or extrapulmonary tuberculosis. Our sample comprised 67 hospitalized patients, and 98 clinical specimens were collected, of which 20 were pulmonary specimens (sputum, BAL fluid, or gastric lavage fluid), and 78 were extrapulmonary specimens (blood, cerebrospinal fluid, lymph node aspirate, urine, pleural fluid, secretion from ganglia, pleura fragment, liver fragment, ascitic fluid, bone marrow aspirate, or biopsy specimens). The number of specimens collected from the patients ranged from one to three, according to physician requests. The diagnostic confirmation of tuberculosis was based on the following criteria: clinical and radiological evidence of tuberculosis confirmed by laboratory tests, isolation of M. tuberculosis in clinical specimens by direct smear microscopy or culture (gold standard), and evident clinical improvement after antimycobacterial treatment.

In brief, direct smear microscopy was performed using Ziehl-Neelsen staining, and an automated microbial system (BacT/ALERT MP; Organon Teknika Corp., Durham, NC, USA) was used for the identification of Mycobacterium spp. in cultures. The strains were identified by phenotypic methods. () Genotyping was carried out by PCR-restriction enzyme analysis in accordance with Chimara et al.,() although with modifications.

Blood samples were collected in 5-mL tubes containing EDTA, and peripheral blood mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation (Ficoll-Histopaque) for future extraction of the DNA.(-) For solid organs, 2.0-mm punch biopsy samples were collected. All clinical samples were kept at −20°C until DNA extraction, which was performed in accordance with the method described by Rossetti et al.() with modifications by Lima et al.(,,) In brief, a 500-µL aliquot of the sample was centrifuged at 13,000 rpm for 10 min and washed three times in Tris-EDTA (TE). The pellet was resuspended in 100 µL of TE and heated at 100°C for 10 min. The supernatant was transferred to a different tube, and 5 µL of resin were added (Sephaglas BandPrep Kit; Amersham-Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden); an aliquot of sodium iodide solution (0.9 g/mL) was added to the final volume. The tube was shaken for 5 min and incubated at room temperature for 5 min. After centrifuging the tube for 1 min and discarding the supernatant, we added 200 µL of iced 70% ethanol; the tube was then shaken, after which it was centrifuged for 1 min. The resulting pellet was kept at room temperature for 60 min, in order to complete the drying process, and resuspended in 40 µL of 1×TE. The tube was incubated in a water bath at 50°C for 10 min. Subsequently, the tube was centrifuged for 1 min, and the supernatant was transferred to another tube and stored at −20°C until processing.(,)

For the nested PCRs, IS6110 of M. tuberculosis was used as the target sequence (GenBank accession no. 215310.1). The reactions were performed in accordance with Ritis et al.() The following primers were used: sense (TJ3 5'-ATC CCC TAT CCG TAT GGT G-3'); antisense (TJ5 5'-CCG CAA AGT GTG GCT AAC-3'); sense (STAN3 5'-GTC GAG TAC GCC TTC TTG TT-3'); and antisense (OLI 5 5'-AAC GGC TGA TGA CCA AAC-3'). The PCR used a final volume of 50 µL (1× buffer, 50 mM MgCl2, 10 pmol/µL of each oligonucleotide, 0.2 µM dNTP, and 2 U Taq DNA polymerase [Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA]). The amplification process consisted of an initial denaturation step of 94°C for 3 min, 30 denaturing cycles (at 94°C for 1 min, 57°C for 1 min, and 72°C for 1 min), followed by a final extension at 72°C for 5 min. The second PCR was performed using 3 µL of the product of the first PCR under similar conditions to those described above, but with an annealing temperature of 60°C. DNA of the H37Rv strain of M. tuberculosis and PCR mix alone were used as positive and negative controls, respectively. The result was analyzed by electrophoresis on 2% agarose gel, stained with ethidium bromide, and visualized in an ultraviolet transilluminator (Fisher-Biotech, Fairlawn, NJ, USA), resulting in a 316-bp fragment.

Statistical analyses were performed with the Epi Info statistical package, version 6.0. The kappa statistic was used in order to assess the level of agreement among the results.() The level of significance was set at 5%.

Results

Our sample comprised 67 individuals, 63.7% being male. The mean age of the patients was 40.10 ± 3.66 years (range, 18-87 years). The most common comorbidity was HIV/AIDS, in 41 patients.

Tuberculosis was diagnosed in 11 individuals (16.41%), 5 being diagnosed with pulmonary tuberculosis and the remaining with extrapulmonary tuberculosis (pleural tuberculosis in 3, meningeal tuberculosis in 2, and miliary tuberculosis in 1). All culture isolates were confirmed by M. tuberculosis genotyping. Nested PCR was positive in all of the cases of confirmed tuberculosis, as shown in Table 1. In 4 of the tuberculosis patients, positive laboratory results were obtained only by the molecular technique (p = 0.110; Fisher's exact test).

Table 1

Clinical, epidemiological, and laboratory data of the eleven patients with confirmed pulmonary or extrapulmonary tuberculosis.

Of the 98 clinical specimens analyzed, 6.00%, 8.16%, and 13.26%, respectively, showed positive results in smear microscopy, culture, and nested PCR, as summarized in Table 1. Culture was negative in 2 of the samples with positive smear microscopy results, whereas smear microscopy was negative in 4 of the samples with positive culture results.

By comparing the results of nested PCR with those of cultures in pulmonary samples (Table 2), we found that the sensitivity and specificity of nested PCR were 100% and 83%, respectively. The positive and negative predictive values were 40% and 100%, respectively, with good concordance between the tests (kappa = 0.50; p = 0.25; McNemar's test). Regarding extrapulmonary samples (Table 2), sensitivity, specificity, positive predictive value, and negative predictive value were, respectively, 83.0%, 96.0%, 62.5%, and 98.5%, with good concordance between the tests (kappa = 0.6867; p = 0.625; McNemar's test).

Table 2

Culture and nested polymerase chain reaction for the detection of Mycobacterium tuberculosis in pulmonary and extrapulmonary samples.

Discussion

The early diagnosis of tuberculosis is essential for prompt treatment and effective control of the disease.() This is particularly true in cases of extrapulmonary tuberculosis, because various factors can complicate the diagnosis of the disease. Due to the paucibacillary nature of extrapulmonary tuberculosis, studies have shown a variability in positive culture results (from 12% to 80%) and a variety of clinical samples/biological tissues, which implies a non-uniform distribution of the bacillus, as well as the presence of nonspecific signs and symptoms.(,,-) In our study, pleural tuberculosis was diagnosed in 2 HIV-negative patients, corroborating the findings of a study reporting that pleural tuberculosis is prevalent in extrapulmonary cases in HIV-negative patients.() Approximately 50% of HIV-positive individuals with tuberculosis develop extrapulmonary forms. (,,,) Despite the small number of HIV-positive patients included in the present study, our results show a predominance of extrapulmonary tuberculosis (57%).

Various tests based on PCR techniques using commercial kits and in-house tests are being evaluated. The nested PCR technique, by targeting IS6110 in order to identify the M. tuberculosis complex,() provides variable sensitivity and specificity, depending on the laboratory, clinical specimen, bacillary load, cell lysis, and technical parameters.() Molecular techniques have greatly improved the detection of mycobacteria in lymph nodes and in various body fluids (aspirates, cerebrospinal fluid, ascitic fluid, and pleural fluid). However, due to the variable sensitivity and specificity in different studies, positive results should be interpreted in conjunction with clinical findings.() In the present study, the proportion of positive results in the individuals diagnosed with pulmonary or extrapulmonary tuberculosis using nested PCR (100%) was higher than in other studies using the same target gene and carried out in Brazil,() India,() and Greece.()

The discordance between the molecular method and smear microscopy in pulmonary and extrapulmonary samples in our study (in 1 and in 6 samples, respectively) might be directly related to the low sensitivity of the phenotyping technique, the paucibacillary nature of samples, or even the absence of infection by AFB, as observed by other authors.(,,) Negi et al.() reported that a molecular technique targeting IS6110 showed high positivity in pulmonary and extrapulmonary samples (90% and 77%, respectively), whereas smear microscopy showed low positivity (49% and 24%, respectively). Similarly, Barani et al.,() when studying 19 pulmonary and 104 extrapulmonary samples, obtained higher positivity with a molecular technique targeting IS6110 and TCR4 than with the smear method (17 similar and 12 divergent results). It is of note that a reported 50% of tuberculosis cases are classified as negative on the basis of smear microcopy results.() In addition, smear microcopy was not performed in 32.43% of the reported cases of tuberculosis in Brazil in 2010.()

When we compared nested PCR and culture results in pulmonary samples, we found that 3 of the samples showed positive nested PCR results but negative culture results. The negative results in the cultures might be due to co-infection with HIV in 2 of the patients and kidney transplantation in 1 (Table 1) or to the characteristics of paucibacillary infections.(,) Various factors can influence the result of cultures, such as the number of organisms present in the specimen, the methods of sample collection, previous treatments, and the processing method. In addition, the solutions used for digestion/decontamination of the samples can damage the mycobacteria.(,)

In the present study, the molecular results supported the clinical and diagnostic criteria widely accepted for the diagnosis of tuberculosis. The sensitivity and specificity found for nested PCR in our study (100% and 83%, respectively) are higher than those reported in previous studies using molecular techniques targeting the IS6110 gene in sputum samples (88-98% and 15-100%, respectively).(,,) This difference might be attributable to the volume and type of samples, as well as to the different molecular typing protocols employed in different laboratories. (,,) Hence, the correlation of the results with the clinical profile of the patient is essential for the diagnosis of tuberculosis, and the definition of the disease can therefore be established from negative cultures after the therapeutic test.() This was found in 3 of our patients who had positive nested PCR results and negative culture results in their pulmonary samples, 2 of whom were cured after treatment and 1 of whom was noncompliant with the treatment. In addition, 2 patients died before the beginning of the recommended tuberculosis treatment. As to the concordance between nested PCR and culture, although the kappa coefficient (0.50) was lower than that reported in other studies, carried out in India (kappa = 0.6-0.8) and in Brazil (kappa = 0.78), the concordance was good.

Regarding extrapulmonary samples, nested PCR was positive in 3 of the blood samples with negative culture results, and negative in 1 of the cerebrospinal fluid samples with a positive culture result. This false-negative result in a cerebrospinal fluid sample (Table 1) might be related to the absence of copies of the IS6110 gene, as previously described in studies conducted in southeast Asia, Denmark, Tunisia, India, and Vietnam, indicating the need to incorporate additional targets, such as TRC4, in order to improve molecular detection.(,) However, to our knowledge, no study to date has reported the absence of this element in M. tuberculosis strains in Brazil, and various studies have reported that this sequence is the most sensitive in order to detect the M. tuberculosis complex.(,) Another factor could be the presence of molecular reaction inhibitors in up to 18.6% of extrapulmonary specimens.()

In Brazil, the prevalence of M. tuberculosis isolated in cultures ranges from 15.0% to 25.6%,(,) the highest values being obtained prior to the highly active antiretroviral therapy era. Positive nested PCR results in blood samples led to the diagnosis of pulmonary tuberculosis in 2 HIV-negative patients and in 1 HIV-positive patient, as well as to the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis in 1 HIV-negative patient and in 1 HIV-positive patient. In those blood samples, smear microscopy and culture were positive in only 1 and 2 samples, respectively; this might be due to the small number of bacilli in the circulation.(,) In fact, the sensitivity of PCR in peripheral blood mononuclear cells, as used here, has been reported to be better than is that of culture, both having similar specificity.(,,) In addition, clinical specimens, such as cerebrospinal fluid, blood, and sputum, have been described as good substrates for PCR() with good concordance (kappa = 0.6867; p = 0.625; McNemar's test), as in our results, in which the level of positivity in extrapulmonary samples was higher when nested PCR was used (p = 0.0042), thus corroborating the findings of Noussair et al.() Different rates of sensitivity were described using the molecular methodology for this type of sample in studies conducted in France() and India() (86.6% and 90%, respectively). If standardization studies using the same molecular target, DNA extraction method, and PCR optimization were validated in different laboratories, the sensitivity of the test could be improved and, consequently, so could its concordance.

In the present study, a positive nested PCR result, associated with the clinical features, was used as the single laboratory criterion for the diagnosis of 4 patients (2 with pulmonary tuberculosis and 2 with extrapulmonary tuberculosis), because it was the only test producing positive results (Table 1); the lack of isolates in cultures might be mainly due to the paucibacillary character of the samples. Although the difference is not significant in this situation, diagnosis is often established only by clinical and radiological data, even if the culture and sputum smear testing are negative. In such cases, molecular analysis can help establish specific antimycobacterial therapy and, consequently, contribute to reduce empirical treatment, which has been currently used in almost 27% of suspected pulmonary tuberculosis cases. In addition, it can help control the spread of the bacillus() and prevent more severe clinical evolution, mainly in HIV-positive patients. However, the current Brazilian guidelines on tuberculosis do not include positive molecular results in the definition of tuberculosis cases; as a rule, the use of this method has been restricted to certain referral and research centers in Brazil.()

It is worth mentioning that clinical screening that is carefully designed to study the disease caused by mycobacteria, together with similar attention to the collection and transport of biological samples, are factors that contributed to the isolation of a higher rate of M. tuberculosis strains than was expected at our hospital. The present study corroborates the results obtained at a referral center for the diagnosis of tuberculosis in the city of São José do Rio Preto (XV Subdivision of the São Paulo State Health Department), in which a 50% increase in the number of isolates was observed during the study period.()

The results of the nested PCR assay revealed good agreement with those of the culture. The specificity and sensitivity achieved with this relatively simple molecular approach can be seen as an important contribution to the future establishment of a protocol for the molecular detection of M. tuberculosis complex in pulmonary and extrapulmonary samples. In addition, this methodology could reduce the time required for the appropriate diagnosis of tuberculosis.

Introdução

A Organização Mundial da Saúde estima que houve entre 8,8 e 9,2 milhões de casos novos de tuberculose em 2010.() Além disso, estima-se que 1,2 milhão desses casos estejam infectados pelo HIV. Ademais, estima-se que 1,1 milhão de óbitos ocorreram em pacientes com tuberculose HIV negativos, o que equivale a 15 óbitos por 100.000 habitantes. A mortalidade é o indicador mais sensível de medidas de controle da tuberculose(); a tuberculose continua a figurar entre as dez principais causas de óbito em todo o mundo. A meta de cura de 85% dos casos de tuberculose, estabelecida pela Assembleia Mundial da Saúde em 1991, não foi alcançada em 2009 em 7 dos 22 países com maior carga da doença, incluindo o Brasil (72%).()

O diagnóstico em fase precoce da doença é de suma importância para o início do tratamento, com consequências diretas para o controle individual da doença e, consequentemente, para ações de saúde pública voltadas à prevenção da transmissão da tuberculose. Portanto, é necessário que os laboratórios de microbiologia clínica sejam capazes de identificar rapidamente as micobactérias por meio de microscopia e cultura. Porém, o exame de escarro, embora rápido e custo-efetivo, tem baixa sensibilidade e especificidade, particularmente em amostras paucibacilares, e a cultura, embora seja considerada o padrão ouro em razão de sua alta sensibilidade, requer várias semanas para produzir um resultado.(-)

Atualmente, o Brasil é um dos países que, juntos, concentram 80% dos casos de tuberculose no mundo, com uma incidência de 70.977 casos em 2010.(,) Para a maioria desses casos, o diagnóstico foi baseado apenas nos resultados dos exames de escarro; radiografias de tórax, culturas e testes bioquímicos para Mycobacterium spp. apenas foram realizados em pacientes com exames de escarro negativos mas com sintomas respiratórios.(,) Essas limitações diagnósticas têm estimulado o uso de ferramentas moleculares com maior sensibilidade, especificidade e velocidade com o objetivo de detectar micobactérias em todos os espécimes clínicos.(-,) As novas tecnologias que estão sendo desenvolvidas redefiniram recentemente o diagnóstico de tuberculose, fornecendo uma base para técnicas laboratoriais de diagnóstico. (,) O diagnóstico molecular da tuberculose por polymerase chain reaction (PCR, reação em cadeia da polimerase) com primers de alta especificidade (98%), com amplas variações de sensibilidade (20-100%), tem sido utilizado para a identificação de alvos genéticos no bacilo.(,,)

Apesar do uso difundido da PCR convencional, modificações na técnica, tais como o acréscimo de uma reação adicional (nested PCR), aumentaram sua sensibilidade e especificidade.() É possível que isso se deva ao fato de que são diluídos potenciais inibidores da PCR, que comumente estão presentes em amostras biológicas.() Portanto, a possibilidade de acesso a uma ferramenta molecular que leva a um diagnóstico mais rápido e que é eficaz na detecção de casos difíceis de elucidar por meio de testes convencionais certamente ajuda a diminuir a morbidade e melhorar o controle da tuberculose. O objetivo do presente estudo foi avaliar a técnica de nested PCR dirigida à sequência de inserção IS6110 no Mycobacterium tuberculosis e comparar os resultados com aqueles obtidos em culturas de amostras de pacientes com suspeita de tuberculose pulmonar ou extrapulmonar.

Métodos

Este estudo foi realizado entre fevereiro e dezembro de 2009. Os pacientes incluídos no estudo foram submetidos a avaliação física e coleta de amostras no Hospital de Base, um centro de referência para o diagnóstico e tratamento da tuberculose localizado na cidade de São José do Rio Preto (SP). Os dados epidemiológicos e clínicos foram obtidos de prontuários médicos de acordo com um protocolo aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (Protocolo nº 064/2009). A presença de anticorpos anti-HIV, identificada por ELISA e confirmada por Western blot, foi indicativa de soropositividade para HIV.

Todos os pacientes incluídos no estudo eram maiores de 18 anos de idade, eram imunossuprimidos (em razão de terapia de imunossupressão, doença autoimune, transplante de órgãos ou positividade para HIV) e apresentavam sintomas e sinais clínicos sugestivos de tuberculose pulmonar ou extrapulmonar. Nossa amostra foi composta por 67 pacientes hospitalizados, e 98 espécimes clínicos foram coletados, dos quais 20 eram espécimes pulmonares (escarro, LBA ou lavado gástrico) e 78 eram espécimes extrapulmonares (sangue, líquido cefalorraquidiano, aspirado de linfonodo, urina, líquido pleural, secreção ganglionar, fragmento pleural, fragmento hepático, líquido ascítico, aspirado de medula óssea ou espécimes de biópsia). O número de espécimes coletados dos pacientes variou de um a três, de acordo com as solicitações médicas. A confirmação do diagnóstico de tuberculose baseou-se nos seguintes critérios: evidências clínicas e radiológicas de tuberculose confirmadas por testes laboratoriais, isolamento de M. tuberculosis em espécimes clínicos por baciloscopia direta ou cultura (padrão ouro) e melhora clínica evidente após tratamento com agentes antimicobacterianos.

Em suma, a baciloscopia direta foi realizada com a coloração de Ziehl-Neelsen, e utilizou-se um sistema automatizado de detecção microbiana (BacT/ALERT MP; Organon Teknika Corp., Durham, NC, EUA) para a identificação do Mycobacterium spp. nas culturas. As cepas foram identificados por métodos fenotípicos.() A genotipagem foi realizada por meio de análise por enzimas de restrição por PCR de acordo com Chimara et al.,() embora com modificações.

Amostras de sangue foram coletadas em tubos de 5 mL contendo EDTA, e células mononucleares de sangue periférico foram isoladas por centrifugação em gradiente de densidade (Ficoll-Histopaque) para futura extração de DNA. (-) Para órgãos sólidos, foram coletadas amostras de punção de biópsia (2.0 mm). Todas as amostras clínicas foram mantidas a −20°C até a extração do DNA, que foi realizada de acordo com o método descrito por Rossetti et al.() com modificações por Lima et al.(,,) Em suma, uma alíquota de 500 µL da amostra foi centrifugada a 13.000 rpm por 10 min e submetida a três lavagens com Tris-EDTA (TE). O sedimento foi ressuspenso em 100 µL de TE e aquecido a 100°C por 10 min. O sobrenadante foi transferido para um tubo diferente, e foram adicionados 5 µL de resina (Sephaglas BandPrep Kit; Amersham-Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia); uma alíquota de solução de iodeto de sódio (0,9 g/mL) foi adicionada ao volume final. O tubo foi agitado por 5 min e incubado à temperatura ambiente por 5 min. Após a centrifugação do tubo por 1 min e o descarte do sobrenadante, foram adicionados 200 µL de etanol gelado a 70%; o tubo foi então agitado, sendo posteriormente centrifugado por 1 min. O sedimento resultante foi mantido à temperatura ambiente por 60 min, para completar o processo de secagem, e ressuspenso em 40 µL de 1×TE. O tubo foi incubado em banho de água a 50°C por 10 min. Em seguida, o tubo foi centrifugado por 1 min, e o sobrenadante foi transferido para outro tubo e armazenado a −20°C até o processamento.(,)

Para as nested PCRs, utilizou-se IS6110 do M. tuberculosis como sequência alvo (GenBank nº de acesso NP 215310.1). As reações foram realizadas de acordo com Ritis et al.() Os seguintes primers foram utilizados: sense (TJ3 5'-ATC CCC TAT CCG TAT GGT G-3'); antisense (TJ5 5'-CCG CAA AGT GTG GCT AAC-3'); sense (STAN3 5'-GTC GAG TAC GCC TTC TTG TT-3'); e antisense (OLI 5 5'-AAC GGC TGA TGA CCA AAC-3'). A PCR utilizou um volume final de 50 µL (1× tampão, 50 mM de MgCl2, 10 pmol/µL de cada oligonucleotídeo, 0,2 µM de dNTP e 2 U de Taq DNA polimerase [Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA]). O processo de amplificação consistiu em uma etapa inicial de desnaturação a 94°C por 3 min, 30 ciclos de desnaturação (a 94°C por 1 min, 57°C por 1 min e 72°C por 1 min), seguidos de uma extensão final a 72°C por 5 min. A segunda PCR foi realizada com 3 µL do produto da primeira PCR em condições semelhantes às descritas anteriormente, mas com temperatura de recozimento de 60°C. DNA da cepa de M. tuberculosis H37Rv e mistura de PCR isoladamente foram utilizados como controles positivo e negativo, respectivamente. O resultado foi analisado por eletroforese em gel de agarose 2%, corado com brometo de etídio e visualizado em transiluminador de luz ultravioleta (Fisher-Biotech, Fairlawn, NJ, EUA), resultando em um fragmento de 316 bp.

As análises estatísticas foram realizadas com o pacote estatístico Epi Info, versão 6.0. A estatística kappa foi utilizada para verificar a concordância entre os resultados.() O nível de significância adotado foi de 5%.

Resultados

Nossa amostra foi composta por 67 indivíduos, sendo que 63,7% eram do sexo masculino. A média de idade dos pacientes foi de 40,10 ± 3,66 anos (variação: 18-87 anos). A comorbidade mais frequente foi HIV/AIDS, em 41 pacientes.

A tuberculose foi diagnosticada em 11 pacientes (16,41%), sendo que 5 foram diagnosticados com tuberculose pulmonar e os restantes, com tuberculose extrapulmonar (tuberculose pleural em 3, tuberculose meníngea em 2 e tuberculose miliar em 1). Todos os isolados de cultura foram confirmados por genotipagem de M. tuberculosis. A nested PCR foi positiva em todos os casos de tuberculose confirmada, como mostra a Tabela 1. Em 4 dos pacientes com tuberculose, resultados laboratoriais positivos foram obtidos apenas pela técnica molecular (p = 0,110; teste exato de Fisher).

Tabela 1

Dados clínicos, epidemiológicos e laboratoriais dos onze pacientes com tuberculose pulmonar ou extrapulmonar confirmada.

Dos 98 espécimes clínicos analisados, 6,00%, 8,16% e 13,26%, respectivamente, apresentaram resultados positivos na baciloscopia, cultura e nested PCR, como resumido na Tabela 1. A cultura foi negativa em 2 das amostras com baciloscopia positiva, enquanto a baciloscopia foi negativa em 4 das amostras com cultura positiva.

Ao se comparar os resultados da nested PCR com aqueles das culturas em amostras pulmonares (Tabela 2), constatou-se que a sensibilidade e a especificidade da nested PCR foram 100% e 83%, respectivamente. Os valores preditivos positivo e negativo foram 40% e 100%, respectivamente, com boa concordância entre os testes (kappa = 0,50; p = 0,25; teste de McNemar). Com relação às amostras extrapulmonares (Tabela 2), a sensibilidade, a especificidade, o valor preditivo positivo e o valor preditivo negativo foram, respectivamente, 83,0%, 96,0%, 62,5% e 98,5%, com boa concordância entre os testes (kappa = 0,6867; p = 0,625; teste de McNemar).

Tabela 2

Cultura e nested polymerase chain reaction para detecção de Mycobacterium tuberculosis em amostras pulmonares e extrapulmonares.

Discussão

O diagnóstico precoce da tuberculose é essencial para o tratamento imediato e o controle efetivo da doença.() Isso é particularmente verdadeiro em casos de tuberculose extrapulmonar, pois vários fatores podem complicar o diagnóstico da doença. Em razão da natureza paucibacilar da tuberculose extrapulmonar, estudos mostram uma variabilidade nos resultados positivos em cultura (de 12% a 80%) e uma variedade de amostras clínicas/tecidos biológicos, o que implica uma distribuição não uniforme do bacilo, bem como a presença de sinais e sintomas não específicos. (,,) Em nosso estudo, a tuberculose pleural foi diagnosticada em 2 pacientes HIV negativos, corroborando os achados de um estudo que revelou que a tuberculose pleural é prevalente em casos extrapulmonares em pacientes HIV negativos. () Cerca de 50% dos indivíduos HIV positivos portadores de tuberculose desenvolvem formas extrapulmonares.(,,,) Apesar do pequeno número de pacientes HIV positivos incluído no presente estudo, nossos resultados mostram uma predominância de tuberculose extrapulmonar (57%).

Vários testes baseados em técnicas de PCR com uso de kits comerciais e testes in house estão sendo avaliados. A técnica nested PCR, ao visarIS6110 com o objetivo de identificar o complexo M. tuberculosis,() proporciona sensibilidade e especificidade variáveis, dependendo do laboratório, do espécime clínico, da carga bacilar, da lise celular e dos parâmetros técnicos. () As técnicas moleculares melhoraram muito a detecção de micobactérias em linfonodos e em vários fluidos corporais (aspirados, líquido cefalorraquidiano, líquido ascítico e líquido pleural). Porém, em razão da sensibilidade e especificidade variáveis em diferentes estudos, os resultados positivos devem ser interpretados em conjunto com os achados clínicos.() No presente estudo, a proporção de resultados positivos na nested PCR nos indivíduos diagnosticados com tuberculose pulmonar ou extrapulmonar (100%) foi maior do que em outros estudos utilizando o mesmo gene alvo realizados no Brasil,() Índia() e Grécia.()

É possível que a discordância entre o método molecular e a baciloscopia nas amostras pulmonares e extrapulmonares em nosso estudo (em 1 e em 6 amostras, respectivamente) esteja diretamente relacionada à baixa sensibilidade da técnica de fenotipagem, à natureza paucibacilar das amostras ou até à ausência de infecção por BAAR, como observado por outros autores.(,,) Negi et al.() relataram que uma técnica molecular direcionada a IS6110 apresentou alta positividade em amostras pulmonares e extrapulmonares (90% e 77%, respectivamente), enquanto a baciloscopia apresentou baixa positividade (49% e 24%, respectivamente). Da mesma forma, Barani et al.,() ao estudarem 19 amostras pulmonares e 104 amostras extrapulmonares, obtiveram maior positividade com uma técnica molecular direcionada a IS6110 e TCR4 do que com o método baciloscópico (17 resultados semelhantes e 12 resultados divergentes). Vale ressaltar que foi relatado que 50% dos casos de tuberculose são classificados como negativos com base em resultados de baciloscopia.() Além disso, a baciloscopia não foi realizada em 32,43% dos casos de tuberculose notificados no Brasil em 2010.()

Quando se compararam os resultados da nested PCR e da cultura em amostras pulmonares, constatou-se que 3 das amostras apresentaram resultados positivos na nested PCR mas negativos na cultura. É possível que os resultados negativos nas culturas se devam a coinfecção pelo HIV em 2 dos pacientes e transplante de rim em 1 (Tabela 1) ou às características das infecções paucibacilares. (,) Vários fatores podem influenciar o resultado das culturas, tais como o número de organismos presentes no espécime, os métodos de coleta de amostras, tratamentos anteriores e o método de processamento. Além disso, as soluções utilizadas para a digestão/descontaminação das amostras podem danificar as micobactérias.(,)

No presente estudo, os resultados moleculares corroboraram os critérios clínicos e diagnósticos amplamente aceitos para o diagnóstico da tuberculose. A sensibilidade e a especificidade encontradas para a nested PCR em nosso estudo (100% e 83%, respectivamente) são maiores do que as relatadas em estudos anteriores utilizando técnicas moleculares direcionadas ao gene IS6110 em amostras de escarro (88-98% e 15-100%, respectivamente).(,,) É possível que essa diferença seja decorrente do volume e tipo de amostras, bem como dos diferentes protocolos de tipagem molecular empregados nos diferentes laboratórios.(,,) Por isso, a correlação dos resultados com o perfil clínico do paciente é essencial para o diagnóstico da tuberculose, e a definição da doença pode, portanto, ser estabelecida a partir de culturas negativas após o teste terapêutico.() Isso ocorreu em 3 de nossos pacientes com resultados positivos na nested PCR e negativos na cultura em amostras pulmonares, 2 dos quais foram curados após o tratamento e 1 dos quais abandonou o tratamento. Além disso, 2 pacientes faleceram antes do início do tratamento recomendado da tuberculose. Quanto à concordância entre nested PCR e cultura, embora o coeficiente kappa (0,50) tenha sido menor do que o relatado em outros estudos, realizados na Índia (kappa = 0,6-0,8) e no Brasil (kappa = 0,78), ela foi boa.

Com relação às amostras extrapulmonares, a nested PCR foi positiva em 3 das amostras de sangue com resultados negativos na cultura e negativa em 1 das amostras de líquido cefalorraquidiano com resultado positivo na cultura. É possível que esse resultado falso-negativo em uma amostra de líquido cefalorraquidiano (Tabela 1) esteja relacionado á ausência de cópias do gene IS6110, como descrito anteriormente em estudos realizados no sudeste da Ásia, Dinamarca, Tunísia, Índia e Vietnã, indicando a necessidade de incorporação de alvos adicionais, tais como TRC4, para que se melhore a detecção molecular. (,) Porém, até onde sabemos, nenhum estudo até hoje relatou a ausência desse elemento nas cepas de M. tuberculosis no Brasil, e vários estudos relataram que essa sequência é a mais sensível para a detecção do complexo M. tuberculosis.(,) Outro fator poderia ser a presença de inibidores para as reações moleculares em até 18,6% dos espécimes extrapulmonares.()

No Brasil, a prevalência de M. tuberculosis isolados em cultura varia de 15,0% a 25,6%,(,) sendo que os maiores valores foram obtidos antes da era da terapia antirretroviral altamente ativa. Resultados positivos na nested PCR em amostras de sangue levou ao diagnóstico de tuberculose pulmonar em 2 pacientes HIV negativos e em 1 paciente HIV positivo, bem como ao diagnóstico de tuberculose extrapulmonar em 1 paciente HIV negativo e em 1 paciente HIV positivo. Naquelas amostras de sangue, a baciloscopia e a cultura foram positivas em apenas 1 e 2 amostras, respectivamente; é possível que isso se deva ao pequeno número de bacilos na circulação.(,) Na verdade, foi relatado que a sensibilidade da PCR em células mononucleares de sangue periférico, como aqui utilizada, é melhor do que a da cultura, sendo que ambas apresentam especificidade semelhante.(,,) Além disso, espécimes clínicos, tais como líquido cefalorraquidiano, sangue e escarro, têm sido descritos como bons substratos para PCR() com boa concordância (kappa = 0,6867; p = 0,625; teste de McNemar), como em nossos resultados, nos quais o nível de positividade nas amostras extrapulmonares foi maior quando a nested PCR foi utilizada, corroborando assim os achados de Noussair et al.() Diferentes taxas de sensibilidade foram descritas utilizando a metodologia molecular para esse tipo de amostra em estudos realizados na França() e Índia() (86,6% e 90%, respectivamente). Se estudos de padronização utilizando o mesmo alvo molecular, método de extração do DNA e otimização da PCR fossem validados em diferentes laboratórios, a sensibilidade do teste poderia ser melhorada e, consequentemente, também sua concordância.

No presente estudo, um resultado positivo na nested PCR, associado a características clínicas, foi utilizado como único critério laboratorial para o diagnóstico de 4 pacientes (2 com tuberculose pulmonar e 2 com tuberculose extrapulmonar), pois ela foi o único teste que produziu resultados positivos (Tabela 1); é possível que a ausência de isolados na cultura seja principalmente devida ao caráter paucibacilar das amostras. Embora a diferença não seja significativa nessa situação, o diagnóstico é geralmente estabelecido apenas com base em dados clínicos e radiológicos, mesmo que a cultura e o exame de escarro sejam negativos. Em tais casos, a análise molecular pode ajudar a estabelecer a terapia específica com agentes antimicobacterianos e, consequentemente, contribuir para a redução do tratamento empírico, que tem sido utilizado atualmente em quase 27% dos casos suspeitos de tuberculose pulmonar. Além disso, ela pode ajudar a controlar a disseminação do bacilo() e evitar uma evolução clínica mais grave, principalmente em pacientes HIV positivos. Porém, as atuais diretrizes brasileiras para a tuberculose não incluem resultados moleculares positivos na definição dos casos de tuberculose; em regra, o uso desse método tem sido restrito a certos centros de referência e pesquisa no Brasil.()

Vale mencionar que a triagem clínica cuidadosamente elaborada para o estudo da doença causada por micobactérias, juntamente com atenção semelhante à coleta e transporte das amostras biológicas, são fatores que contribuíram para o isolamento de uma maior taxa de cepas de M. tuberculosis do que era esperado em nosso hospital. O presente estudo corrobora os resultados obtidos em um centro de referência para o diagnóstico da tuberculose na cidade de São José do Rio Preto (XV Divisão Regional de Saúde do Estado de São Paulo), no qual se observou um aumento de 50% no número de isolados durante o período de estudo.()

Os resultados do ensaio de nested PCR mostraram boa concordância com aqueles da cultura. A especificidade e a sensibilidade alcançadas com essa abordagem molecular relativamente simples podem ser vistas como uma importante contribuição para o futuro estabelecimento de um protocolo para a detecção molecular do complexo M. tuberculosis em amostras pulmonares e extrapulmonares. Além disso, essa metodologia poderia reduzir o tempo necessário para o diagnóstico adequado da tuberculose.