Treatment of Muscle Injury with Stem Cells - Experimental Study in Rabbits.

Objective  Histological and macroscopic evaluation of the healing process of acute lesions of the femoral rectus muscle using stem cells derived from adipose tissue-derived stem cells (ADSCs). Method  An experimental study was conducted with 18 hind legs of New Zealand rabbits, which were divided into three study groups according to the intervention to be performed. In group I, no surgical procedure was performed; in group II-SHAN, the experimental lesion was performed without any additional intervention protocol; in group III-Intervention, the addition of ADSCs was performed in the same topography of the experimental lesion. After the proposed period, 2 weeks, the material was collected and submitted to macroscopic and histological evaluation. Results  The quantitative analysis showed that the addition of ADSCs is related to the reduction of inflammatory cells in the 2-week evaluation (164.2 cells in group II - SHAN to 89.62 cells in group III - ADSC). The qualitative analysis of the slides with Picrosirius red, noticed an increase in orange/yellow fibers in group III - ADSC, which evidences a final healing process. The macroscopic evaluation found no difference between the groups. Conclusion  The use of ADSCs in the treatment of acute muscle injury presented histological advantages when compared to their non-use. Sociedade Brasileira de Ortopedia e Traumatologia. This is an open access article published by Thieme under the terms of the Creative Commons Attribution-NonDerivative-NonCommercial License, permitting copying and reproduction so long as the original work is given appropriate credit. Contents may not be used for commecial purposes, or adapted, remixed, transformed or built upon. ( https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ ).

Introduction

Muscle injury represents approximately one third of injuries related to sports activity; it mainly affects the lower limbs and has an important relationship with withdrawal from sports activities. 1 2 3 For an adequate diagnosis, we opted for a clinical evaluation, with the use of imaging tests reserved for diagnostic confirmation, qualification, and quantification of the lesion. 4

There are some etiological factors with a well-established association with an increased risk of muscle injuries. Among them, we can mention age, previous muscle injury, ethnicity, overload, and imbalance of muscle forces. 5 The therapeutic management of these lesions has not presented substantial changes over the last few years, and the RICE (rest, ice, compression, and elevation) protocol is the most widely used treatment. 4 6 7

Even after performing an appropriate treatment protocol, the high rate of re-injury and prolonged absence from sports activities 3 8 motivates the constant search for new therapies that can improve the results. Seeking to fill this space, the use of orthobiologicals has been gaining space in the treatment of various orthopedic lesions, including muscle injuries. 9 Among the available orthobiologicals, the use of adult mesenchymas stem cells, especially those derived from adipose tissue, already presents consistent results in terms of differentiation capacity, 10 11 rapid growth, 12 ease of obtaining, 13 good experimental results 14 15 and promising clinical results. 16 17

Thus, in the search for alternatives for muscle repair, the present study proposes to evaluate the hypothesis that muscle healing can be optimized using adipose tissue-derived stem cells (ADSCs), in an experimental model of muscle injury reproduced in rabbits. It precisely aims at the histological and macroscopic evaluation of the healing process of acute lesions of the femoral rectus muscle using ADSCs.

Material and Method

Experimental Design

An experimental study was conducted with 9 pure New Zealand male rabbits, aged 28 to 32 weeks and with approximate weight between 3 and 3.5 kg. The animals were acquired from a commercial establishment and kept in the development center of experimental models for biology and medicine throughout the study. During this period, the animal was kept in an individualized environment, 12/12 hrs dark-light cycle, with food and water ad libitum. The hind legs of the animals (18 legs) were randomly divided (using specific software and opaque envelopes) in the study groups according to the intervention to be performed ( Figure 1 ). In the group I–control, the hind legs were kept intact, in group II–SHAN, the experimental lesion was performed without association with additional treatments, and in group III – ADSCs, the experimental lesion was performed and the addition of ADSCs to the lesion site, as a treatment intervention ( Figure 1 ). The study had its initial version and subsequent reports approved by the ethics committee for the use of animals (CEUA, in the Portuguese acronym) of our institution and followed the guidelines for the use and management of animals proposed by our institution besides meeting the criteria proposed in the animal research: reporting of in vivo experiments (ARRIVE) guidelines. 18

Fig. 1

General experimental design. Description: The image represents the general division of the groups from the first stage of the procedure, when the collection of fat took place, to the respective evaluations.

Procedures

To perform the experiments, whether fat collection, lesion protocol, or material collection, the animals were submitted to the following analgesic and anesthetic protocol: To start the procedures, the animal was submitted to analgesia and preoperative antibiotic therapy with tramadol (5 mg/kg) and terramycin (50 mg/kg); after 30 minutes anesthesia, ketatamine (50 mg/kg) and xylazine (10 mg/kg) were started. As a method of postoperative analgesia, meloxican (0.5 mg/kg) and tramadol (5 mg/kg) were maintained until the end of the 3 rd postoperative day, and these same medications were administered in case of pain or discomfort of the animal after this period. Evaluations regarding stress, discomfort, and pain were performed daily at the development center of experimental models for biology and medicine.

Experimental Model of Acute Muscle Injury

After an anesthetic protocol already presented, the animals with paws belonging to the group II—SHAN or to the group III—ADSC' were submitted to trichotomy, antisepsis, asepsis, anterior skin incision in the thigh, dilvulsion by planes, and exposure of the femoral rectus throughout its extension ( Figure 2A ). Next, partial injury in the 1/3 middle of the femoral rectus was performed ( Figure 2B ), with coldblade, and marking of the extremities ( Figure 2C ) with nylon 6-0 (Nylon 6-0, Shalon, Alto da Boa Vista, GO, Brazil), at approximately 0.5 cm proximal and distal to the lesion. 19 20 After performing the procedures and anesthetic recovery, the animal was encouraged to apply load to the limb, without restrictions.

Fig. 2

Experimental model of muscle injury. Description: ( A ) Exposure of the recto femoral muscle to its full extent. ( B ) Experimental lesion in the middle third of the femoral rectus muscle. ( C ) Marking the extremities of the femoral rectus muscle injury with non-absorbable point.

ADSCs—Fat Collection to implant ADSCs

For the preparation and implantation of ADSCs, all animals were submitted to abdominal fat collection 2 weeks before the experimental lesion. To collect fat, the animals were anesthetized with the same protocol, and then a lower abdominal median incision was performed, with dissection by planes until aponeurosis of the rectum muscle. Identification of the left superficial epigastric artery in the inguinal region was performed, and a fat fragment with weight ranging from 2 +/- 0.5 grams was collected. 10 11 21

The fat fragment was transported, in PBS buffer solution, from the collection site to the laboratory to follow the specific procedures of preparation of ADSCs.

Preparation of ADSCs

The preparation of the cells followed a protocol that had been previously published. 10 11 21 Briefly, the fat was washed extensively with phosphate buffer saline (PBS), minced, and enzymatically digested at 37 °C for approximately 30 min using 0.075% collagenase type IA (Sigma; St. Louis, MO). The digested tissue was filtered using 100 mm strain to obtain a cell suspension containing the stromal vascular fraction. After centrifugation, the pellet was resuspended in culture media (CM) consisting of Dulbecco's modified Eagle's media (DMEM; Mediatech, Herndon, VA), 10% fetal bovine serum (FBS Gibco; Grand Island, NY), and 1% of a solution of antibiotic/antimycotic (penicillin G 10,000 U/ml, amphotericin B 25 mg/ml and streptomycin 10,000 mg/ml). Cells were allowed to adhere to the flask for 24 h, after which fresh media was added. The cells were incubated at 37 °C and 5% CO 2 in CM until they reached semi-confluence. The cellular confluence was avoided to prevent potential spontaneous differentiation. Culture media was changed every 2–3 days. Cells were rinsed with PBS and incubated with 1:100 dilution of dialkylcarbocyanine solution, a fluorescent cell membrane marker, (Vybrant DiI; Molecular Probes, Eugene, OR) for 30 min at 37 °C in accordance with the manufacturer's protocol. The labeled cells were harvested with 0.25% trypsin/ 1mM EDTA solution. To perform the autologous transplantation, cells were suspended to a concentration of 1-2 × 10 6 labeled cells.

ADSCs Implant

The paws included in group III—ADSCs were initially submitted to the protocol of experimental muscle injury and then submitted to the application of ADSCs directly on the site of the lesion. 15 The application occurred through direct visualization with intramuscular infiltration of the 1-2 × 10 6 of marked ADSCs.

Muscle Tissue Collection

After the 2-week postintervention period, the animals were anesthetized and then submitted to painless death through overdose of anesthetics (ketamine 200 mg/kg + xylazine 40 mg/kg and tramadol 10 mg/kg). For collection, a cutaneous incision was performed according to the previous route and divulsion by planes until exposure of the previously injured region in the femoral recto muscle (previously marked with nylon 6-0). Then, the femoral recto muscle incision was performed in the region between the 6-0 nylon points (site of muscle injury). The collected material was stored in a formaldehyde solution at 10% to follow the entire histological evaluation protocol.

Histological Analysis

Material Preparation

The muscle fragments were fixed in 10% formaldehyde for 24 hours and dehydrated in increasing concentrations of ethyl alcohol, diaphanized by xylol and impregnated by liquid paraffin in a greenhouse, regulated at 60 °C. In sequence, the blocks were cut into minot microtome, adjusted to 4 μm with a 50 μm distance between the cuts. The cuts thus obtained were placed on slides previously greased with Mayer albumin and kept in a regulated oven at 37 °C, for 24 hours, for drying and gluing. After preparation, the slides were stained with hematoxylin and eosin (H&E) and picrosirius red techniques.

Quantitative Evaluation of inflammatory process

In view of the existence of inflammatory processes resulting from tissue lesions, five images of each slide were obtained through an Olympus IX 81 optical microscope (Olympus Corporation, Shinjuku-ku, Tokyo, Japan) coupled to an Olympus DP72 camera (Olympus Corporation, Shinjuku-ku, Tokyo, Japan). These images, obtained with an increase of 40X, were analyzed with the help of ImageJ Software (ImageJ 1.53h, National Institutes of Health, Bethesda MA, USA).

For analysis, the cells related to the scar inflammatory process were isolated through the plugin segmentation , thus excluding the nuclei referring to muscle fibers, and then the plugin counter cell was applied to quantify the number of total cells remaining in each image. The data obtained were compiled and later separated between the groups (Group II—SHAN or Group III—ADSCs). At the end, a comparative analysis was performed regarding the effects of treatment with ADSCs on muscle healing.

Qualitative Assessment of Muscle Healing

Considering the healing process of muscle injury and collagen changes that occur over time, a qualitative methodology was performed using as reference the muscle healing process and the respective color changes over this period. For this analysis, we used the images obtained through the microscope Zeiss AX10 (Zeiss, Jena, Thuringia, Germany) coupled to a Zeiss AxioCam ICc5 camera (Zeiss, Jena, Thuringia, Germany) of the slides colored in red picrosirius. In a simplified way, a descriptive analysis was performed on the proportion of fibers in an advanced healing aspect, that is, with yellow/orange coloration.

Macroscopic Analysis

The evaluation of the local morphology was performed at the immediate moment of material collection. In this evaluation, the following aspects were analyzed: changes in color, solidity, level of fibrosis, presence of infectious signs, and local inflammatory response. 22 Additionally the images were also documented through Canon photographs (Canon EOS Rebel T5; Canon, Manaus, AM, Brazil) for further verification and presentation of results.

Sample Calculation and Statistical Analysis

Considering the pioneering of the study, the number of animals was decided after analysis of the relevant literature. 15 23 The data obtained in the quantitative analysis of the inflammatory response were tabled and statistically analyzed with the BioStat 2009 program (AnalystSoft Inc., Alexandria, VA, USA). First, the data were submitted to the Shapiro-Wilk test to verify the normality of the groups and after the analysis of variance (ANOVA)/Tukey test for parametric data, and Kruskal-Wallis/Dunn for non-parametric data, to determine the significance of the results. The level for rejection of the null hypothesis was set at 5% ( p ≤ 0.05), with an asterisk marking the significant values.

Results

The inflammatory process of muscle healing was ongoing in both groups, given the presence of inflammatory tissue in the sample analyzed. However, the quantitative analysis showed that the addition of ADSCs is related to a decrease in the number of inflammatory cells per field in the 2-week evaluation ( Figure 3 ). On the quantitative analysis, we noticed a decrease from 164.2 cells in the group without the addition of ADSCs to 89.62 cells per field in the group with the addition of ADSCs, representing a 46% decrease in the number of inflammatory cells after the addition of ADSCs ( Figure 4 ). Considering that the control group did not present any evidence of inflammatory process, it did not enter this quantification.

Fig. 3

Microscopic histology of muscle healing—Inflammatory evaluation. Description: Images representative of muscle healing in different groups. Group I—Control: Hematoxylin and eosin (H&E) image with an increase of 40X, representative of the original muscle tissue, not submitted to injury or intervention protocols, presenting muscle tissue with habitual appearance. Group II—SHAN: H&E image with an increase of 40X, representative of the group submitted only to experimental lesion with two weeks of evolution, presenting a large amount of inflammatory tissue and muscle tissue in the initial phase of healing. Group III—ADSCs: H&E image with an increase of 40X, representative of the group submitted to experimental injury and treatment with the use of ADSCs, showing a decrease in the number of inflammatory cells, and muscle tissue in the early process of healing.

Fig. 4

Graphic image of inflammatory analysis. Description: Images representative of the average number of cells per group. In blue, the number of cells per field of the group submitted to treatment with ADSCs and, in orange, of the group not submitted to any treatment is represented. In this analysis, there is an important decrease in the number of inflammatory cells after the addition of ADSCs in the treatment of acute muscle injury.

The picrosirius red technique, under polarization, showed that the treated group had more orange/yellow fibers, which evidences accumulation of thicker collagen fibers compatible with the final healing process ( Figure 5 ).

Fig. 5

Microscopic histology of muscle healing - muscle evaluation. Description: Images representing collagen modifications in groups submitted to experimental injury and treatment with ADSCs. Group II—SHAN: Picrosirius image, representative of the initial phase of collagen modification with minimal number of fibers colored in orange or yellow. Group III—ADSCs: Picrosirius image, representative of more advanced phase of collagen modification with a greater number of fibers colored in orange or yellow.

There was no change in the general state of the animal or infectious signs in the hind legs submitted to experimental injury or intervention with the addition of ADSCs. The animals were able to walk in the cage in the first postoperative days and at no time presented modification in the acceptance of the diet or water. In both groups, the animals' muscle tissue already presented a healing aspect in the final phase, with remarkable fibrotic changes on its surface. The macroscopic evaluation did not show any differences between the group submitted and the one not submitted to intervention ( Figure 6 ).

Fig. 6

Macroscopic evaluation using ADSCs. Description: Experimental injury - aspect of the experimental model immediately after muscle injury and marking with nylon 6-0. Group II—SHAN: Representative image of the macroscopic aspect after 2 weeks postoperatively. Group III—ADSC: Representative image of the macroscopic aspect of the group submitted to injury and intervention (addition of ADSCs) after 2 weeks postoperatively.

Discussion

The main findings of the present study refer to the achievement of good histological results after the use of ADSCs in the treatment of acute muscle injury. These findings are added to recent studies published by our group, which show promising results for the use of different orthobiologics, (i) stem cells 15 and (ii) scaffolds. 22 These first studies were able to satisfactorily reproduce well-established results in other research groups and are functioning as motivators for continuity in the development, improvement, and use of orthobiologics.

In the experimental model presented, with an acute, cutting lesion of muscle tissue, we hope that the use of ADSCs will be able to optimize muscle healing through three mechanisms, 24 (i) production of growth factors, with optimization of angiogenesis and reduction of pathways that favor cellular apoptosis; (ii) immunosuppressive action by decreasing activity in T and B lymphocytes; and (iii) induction in the differentiation of fibroblasts into myocytes.

The choice of an acute injury with early evaluation was motivated by greater functionality and performance of stem cells in the first days after the intervention. Thus, we tried to evaluate a probable acceleration in the functional recovery over time, after the use of ADSCs. In this sense, the great innovation of this work was precisely to present the first study using ADSCs in the treatment of acute muscle injury in an experimental model.

Among the limitations of the present study, we can mention the difficulties for sample calculation, given the pioneering of the study; the use of an experimental model that is not reproducible in clinical practice, since the scathing lesions are not the most frequent; and the lack of additional evaluation with other methods, such as biomechanics and functional evaluation. As prospects for the future, we hope to maintain pioneering and continue the work with development, production, and evaluation of the most diverse orthobiologics available.

Conclusion

The use of ADSCs in the treatment of acute muscle injury showed histological advantages when compared to their non-use.

Introdução

A lesão muscular representa aproximadamente um terço das lesões relacionadas à atividade esportiva; ela acomete principalmente os membros inferiores e possui relação importante com o afastamento do esporte. 1 2 3 Para um diagnóstico adequado, optamos por uma avaliação clínica, ficando a utilização de exames de imagem reservada para confirmação diagnóstica, qualificação e quantificação da lesão. 4

Existem alguns fatores etiológicos com associação bem estabelecida para um risco de aumento de lesões musculares; dentre eles, podemos citar idade, lesão muscular pregressa, etnia, e a sobrecarga e o desequilíbrio de forças musculares. 5 O manejo terapêutico dessas lesões não apresentou modificações substanciais ao longo dos últimos anos, sendo o protocolo rest, ice, compression, and elevation (RICE) o tratamento mais utilizado. 4 6 7

Mesmo após a realização de um protocolo de tratamento adequado, o alto índice de re-lesão e o período prolongado de afastamento das atividades esportivas 3 8 motivam a busca constante por novas terapias que consigam melhorar os resultados. Buscando preencher esse espaço, a utilização de ortobiológicos vem ganhando espaço no tratamento das mais diversas lesões ortopédicas, inclusive as lesões musculares. 9 Dentre os ortobiológicos disponíveis, a utilização de células-tronco adultas mesenquimais, principalmente as derivadas de tecido adiposo, já apresentam resultados consistentes em relação a sua capacidade de diferenciação, 10 11 rápido crescimento, 12 facilidade de obtenção, 13 bons resultados experimentais 14 15 e promissores resultados clínicos. 16 17

Desta forma, na busca de alternativas para reparação muscular, este trabalho propõe avaliar a hipótese de que a cicatrização muscular pode ser otimizada através da utilização de células-troncos derivadas de tecido adiposo (ADSCs, na sigla em inglês) em um modelo experimental de lesão muscular reproduzido em coelhos, e possui como objetivo justamente a avaliação histológica e macroscópica do processo de cicatrização das lesões agudas do músculo reto femoral, com utilização de ADSCs.

Delineamento experimental

Foi realizado um estudo experimental com 9 coelhos Nova Zelândia puros, machos, com idade de 28 a 32 semanas e peso aproximado entre 3 e 3,5 kg. Os animais foram adquiridos de um estabelecimento comercial e mantidos no centro de desenvolvimento de modelos experimentais para biologia e medicina durante todo o estudo. Nesse período, os animais foram mantidos em ambiente individualizado, ciclo claro escuro 12/12 hrs, com ração e água ad libitum . As patas traseiras dos animais (18 patas) foram divididas de forma randômica (utilizando software específico e envelopes opacos) nos grupos do estudo de acordo com a intervenção a ser realizada ( Figura 1 ). No grupo I - controle, as patas traseiras foram mantidas intactas; no grupo II – SHAN, foi realizada a lesão experimental sem associação com tratamentos adicionais, e no grupo III – ADSC, foi realizada a lesão experimental com adição de ADSCs no local da lesão, como intervenção de tratamento ( Figura 1 ). O estudo teve sua versão inicial e relatórios subsequentes aprovados pelo comitê de ética para uso de animais da nossa instituição (CEUA) e seguiu as diretrizes para uso e manejo de animais propostos pela nossa instituição além de preencher os critérios propostos pelas diretrizes do animal research: reporting of in vivo experiments (ARRIVE). 18

Fig. 1

Delineamento experimental geral. Descrição: A imagem representa a divisão geral dos grupos desde a coleta de gordura na primeira etapa do procedimento até a realização das respectivas avaliações.

Procedimentos

Para a realização dos experimentos (seja coleta de gordura, realização do protocolo de lesão ou coleta do material), os animais foram submetidos ao seguinte protocolo analgésico e anestésico: Para início dos procedimentos, o animal foi submetido a analgesia e antibioticoterapia pré-operatória com tramadol (5 mg/kg) e terramicina (50 mg/kg); após 30 minutos, foi iniciada a anestesia com quetamina 50 (mg/kg) e xilazina (10 mg/kg). Como método de analgesia pós-operatória, o animal era mantido com meloxican (0,5 mg/kg) e tramadol (5 mg/kg) até completar o 3° dia de pós-operatório, sendo essas mesmas medicações administradas no caso de dor ou desconforto após esse período. As avaliações com relação ao stress, desconforto e dor eram realizadas diariamente no centro de desenvolvimento de modelos experimentais para biologia e medicina.

Modelo experimental de lesão muscular aguda

Após protocolo anestésico já apresentado, os animais com patas pertencentes ao grupo II - SHAN ou ao grupo III - ADSCs' foram submetidos a tricotomia, antissepsia, assepsia, incisão cutânea anterior na coxa, divulsão por planos e exposição do reto femoral em toda a sua extensão ( Figura 2A ). Na sequência, foi realizada lesão parcial no 1/3 médio do reto femoral ( Figura 2B ), com lâmina fria, e marcação das extremidades ( Figura 2C ) com nylon 6-0 (Nylon 6-0, Shalon, Alto da Boa Vista, GO, Brazil), a uma distância aproximada de 0,5 cm proximal e distal à lesão. 19 20 Após a realização dos procedimentos e recuperação anestésica, o animal foi estimulado a aplicar carga no membro, sem restrições.

Fig. 2

Modelo experimental de lesão muscular. Descrição: ( A ) Exposição do músculo reto femoral em toda a sua extensão. ( B ) Lesão experimental no terço médio de músculo reto femoral. ( C ) Marcação das extremidades da lesão do músculo reto femoral com ponto não absorvível.

ADSCs – coleta de gordura ao implante das ADSCs

Para preparo e implante de células-tronco oriunda de tecido adiposo autólogo, todos os animais eram submetidos a coleta de gordura abdominal duas semanas antes da realização da lesão experimental. Para coleta de gordura os animais eram anestesiados com o mesmo protocolo e então realizado incisão mediana abdominal inferior, com dissecção por planos até a aponeurose do músculo reto abdominal. Identificação da artéria epigástrica superficial esquerda na região inguinal, e coletado um fragmento de gordura com peso variando entre 2 +/- 0,5 gramas. 10 11 21

O fragmento de gordura, era transportado, em solução tampão PBS, do local de coleta até o laboratório para seguir com os procedimentos específicos de preparação da ADSC.

Preparo das ADSCs

A preparação das células seguiu o protocolo que já havia sido publicado previamente; 10 11 21 de forma resumida, a preparação das ADSCs seguiu as seguintes etapas: Após a coleta de tecido gorduroso autólogo, o fragmento de tecido adiposo foi pesado e lavado extensivamente com solução salina (PBS), cortado em pequenos pedaços e enzimaticamente digerido utilizando colagenase crua tipo IA (Sigma, St Louis, MO, USA) 0,075% por 30 minutos em constante agitação a uma temperatura de 37° C. O tecido digerido foi peneirado (100 µm) para obter a fração celular estromal-vascular, que foi ressuspendida em meio de Dulbecco's modificado (DMEM, Mediatech, Herndon, VA, USA) suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS Gibco, Grand Island, NY, USA) e 1% de solução antibiótica (Penicilina G 10.000 U/mL, anfotericina B 25µg/ml e estreptomicina 10.000 µg/ml). Após observar a viabilidade celular, as células foram semeadas em pratos de 100 mm na concentração de 1 × 10 5 . Após 24 a 36 horas, as células não aderentes e eritrócitos foram removidos por meio da troca do meio de cultura. As células foram cultivadas até atingirem aproximadamente 80% de confluência, quando eram tripsinizadas usando tripsina a 0,25% e plaqueadas. As células eram ainda identificadas com marcador de superfície (Vybrant Dil, Molecular Probes, Eugene, OR, USA) utilizando protocolo específico preconizado pelo fabricante. Na realização da intervenção, foram aplicadas aproximadamente 1–2 × 10 6 de ADSCs marcadas.

Implante de ADSC

As patas incluídas no grupo III – ADSCs foram inicialmente submetidas ao protocolo de lesão experimental muscular e então submetidas à aplicação de ADSCs diretamente no local da lesão. 15 A aplicação ocorreu através de visualização direta com infiltração intramuscular de o 1–2 × 10 6 de ADSCs marcadas.

Coleta do tecido muscular

Após o período de 2 semanas pós-intervenção, os animais foram anestesiados, e então submetidos à morte indolor através de superdosagem dos anestésicos (quetamina 200 mg/kg + xilazina 40 mg/kg e tramadol 10 mg/kg). Para a coleta, foi realizada uma incisão cutânea conforme via prévia e divulsão por planos até a exposição da região previamente lesionada no músculo reto femoral (marcado previamente com nylon 6-0). Foi realizada então a incisão do músculo reto femoral na região compreendida entre os pontos de nylon 6-0 (local da lesão muscular). O material coletado foi adicionado a uma solução de formaldeído 10% para seguir com todo o protocolo de avaliação histológica.

Preparo do material

Os fragmentos musculares foram fixados em formaldeído a 10% por 24 horas e desidratados em concentrações crescentes de álcool etílico, diafanizados pelo xilol e impregnados pela parafina líquida em estufa, regulada à temperatura de 60 °C. A inclusão foi realizada de tal maneira que pode ser observada nas lâminas histológicas, cortes transversais da região medial do músculo reto femoral. Em sequência, os blocos foram cortados em micrótomo do tipo Minot, ajustado para 4 µm com distância entre os cortes de 50 µm. Os cortes assim obtidos foram colocados em lâminas previamente untadas com albumina de Mayer e mantidos em estufa regulada à temperatura de 37 °C, durante 24 horas, para secagem e colagem. Após preparação, as lâminas foram submetidas a coloração com técnicas de hematoxilina e eosina (H&E) e picrosirius red.

Avaliação quantitativa do processo inflamatório

Tendo em vista a existência de processos inflamatórios resultantes de lesões teciduais, cinco imagens de cada lâmina foram obtidas através de microscópio óptico Olympus IX 81 (Olympus Corporation, Shinjuku-ku, Tóquio, Japão), com câmera Olympus DP72 (Olympus Corporation, Shinjuku-ku, Tóquio, Japão) acoplada. Essas imagens, obtidas com aumento de 40X, foram analisadas com o auxílio do Software ImageJ (ImageJ 1.53h, National Institutes of Health, Bethesda MA, EUA).

Para análise, as células relativas ao processo inflamatório cicatricial foram isoladas através do plugin Segmentation , excluindo-se dessa forma os núcleos referentes as fibras musculares, e na sequência foi aplicado o plugin Counter Cell para quantificação do número de células totais restantes em cada imagem. Os dados obtidos foram compilados e posteriormente separados entre os grupos (grupo II – SHAN ou grupo III – ADSCs). Ao final, foi realizada uma análise comparativa relativa aos efeitos do tratamento com ADSCs na cicatrização muscular.

Avaliação qualitativa da cicatrização muscular

Levando em consideração o processo de cicatrização da lesão muscular e as alterações do colágeno que ocorrem ao longo do tempo, foi realizada uma análise de metodologia qualitativa usando como referência o processo de cicatrização muscular e as respectivas modificações de cor ao longo desse período. Para tal análise utilizamos as imagens obtidas através do microscópio Zeiss AX10 (Zeiss, Jena, Turíngia, Alemanha) com câmera Zeiss AxioCam ICc5 (Zeiss, Jena, Turíngia, Alemanha) acoplada, com lâminas coradas em picrosirius red. De forma simplificada, foi realizada uma análise descritiva sobre a proporção de fibras em aspecto avançado de cicatrização, ou seja, com coloração amarela/laranja.

Análise macroscópica

A avaliação da morfologia local foi realizada no momento imediato da coleta do material; nessa avaliação, foram analisados os seguintes aspectos: alterações na coloração, solidez, nível de fibrose, presença de sinais infecciosos e resposta inflamatória local. 22 De forma adicional, as imagens também foram documentadas através de fotografias obtidas com câmera Canon (Canon EOS Rebel T5; Canon, Manaus, AM, Brasil) para posterior verificação e apresentação dos resultados.

Cálculo amostral e análise estatística

Levando em consideração o pioneirismo do estudo, o número de animais foi decidido após análise da literatura relevante. 15 23 Os dados obtidos na análise quantitativa da resposta inflamatória foram tabelados e analisados estatisticamente pelo programa BioStat 2009 (AnalystSoft Inc., Alexandria, VA, EUA). Primeiramente, os dados foram submetidos ao teste de Shapiro-Wilk para verificar a normalidade dos grupos e posteriormente ao teste de análise de variância (ANOVA)/Tukey para dados paramétricos, e Kruskal-Wallis/Dunn para dados não paramétricos, para determinar a significância dos resultados. Foi fixado em 5% ( p ≤ 0,05) o nível para rejeição da hipótese de nulidade, assinalando-se com asterisco os valores significantes.

Análise histológica

O processo inflamatório de cicatrização muscular estava em curso em ambos os grupos, visto a presença de tecido inflamatório na amostra analisada. Todavia, a análise quantitativa demonstrou que a adição de ADSCs está relacionada com diminuição da quantidade de células inflamatórias por campo na avaliação com 2 semanas ( Figura 3 ). Sobre a análise quantitativa, notamos diminuição de 164,2 células no grupo sem adição de ADSCs, para 89,62 células por campo no grupo com adição de ADSCs, representando uma diminuição de 46% na quantidade de células inflamatórias após a adição de ADSCs ( Figura 4 ). Tendo em vista que o grupo controle não apresentou qualquer indício de processo inflamatório, ele não entrou nesta quantificação.

Fig. 3

Histologia microscópica da cicatrização muscular – Avaliação inflamatória. Descrição: Imagens representativas da cicatrização muscular nos diferentes grupos. Grupo I – Controle: Imagem em hematoxilina e eosina (H&E) com aumento de 40X representativa do tecido muscular original, não submetido a protocolos de lesão ou de intervenção, apresentando tecido muscular com aspecto habitual. Grupo II - SHAN: Imagem, em H&E com aumento de 40X, representativa do grupo submetido apenas a lesão experimental com duas semanas de evolução, apresentando grande quantidade de tecido inflamatório e tecido muscular em fase inicial de cicatrização. Grupo III - ADSCs: Imagem, em H&E com aumento de 40X, representativa do grupo submetido a lesão experimental e tratamento com utilização de ADSCs, apresentando diminuição na quantidade de células inflamatórias, e tecido muscular em processo adiantado de cicatrização.

Fig. 4

Imagem gráfica da análise inflamatória. Descrição: Imagens representativa da média do número de células por grupo. Em azul está representado o número de células por campo do grupo submetido ao tratamento com ADSCs e em laranja do grupo não submetido a nenhum tratamento. Nessa análise nota-se uma diminuição importante na quantidade de células inflamatórias após adição de ADSCs no tratamento de lesão muscular aguda.

A técnica de picrosirius red, sob polarização, evidenciou que o grupo tratado apresentou mais fibras de cor laranja/amarela, o que evidencia acúmulo de fibras colágenas mais grossas compatíveis com o processo final de cicatrização ( Figura 5 ).

Fig. 5

Histologia microscópica da cicatrização muscular – Avaliação muscular. Descrição: Imagens representativas das modificações do colágeno nos grupos submetidos a lesão experimental e ao tratamento com ADSCs. Grupo II - SHAN: Imagem em picrosirius representativa da fase inicial de modificação do colágeno com mínima quantidade de fibras coradas em laranja ou amarelo. Grupo III - ADSCs: Imagem, em picrosirius, representativa de fase mais avançada de modificação do colágeno com quantidade maior de fibras corada em laranja ou amarelo.

Não foi observada nenhuma alteração no estado geral do animal ou sinais infecciosos nas patas traseiras submetidas à lesão experimental ou à intervenção com adição de ADSCs. Os animais foram capazes de deambular na gaiola nos primeiros dias de pós-operatório e em nenhum momento apresentaram modificação na aceitação da dieta ou de água. Em ambos os grupos, o tecido muscular já se apresentava com aspecto de cicatrização em fase final, com alterações fibróticas notáveis em sua superfície. A avaliação macroscópica não foi capaz de notar diferenças entres os grupos submetidos ou não à intervenção ( Figura 6 ).

Fig. 6

Avaliação macroscópica com utilização de ADSCs. Descrição: Lesão experimental: Aspecto do modelo experimental logo após a lesão muscular e marcação com nylon 6-0. Grupo II - SHAN: Imagem representativa do aspecto macroscópico após 2 semanas de pós-operatório. Grupo III - ADSCs: Imagem representativa do aspecto macroscópico do grupo submetido a lesão e intervenção (adição de ADSCs) após 2 semanas de pós-operatório.

Discussão

Os principais achados desse estudo fazem referência à obtenção de bons resultados histológicos após a utilização de ADSCs no tratamento de lesão muscular aguda. Esses achados estão somados aos recentes trabalhos publicados por nosso grupo, que mostram resultados promissores para utilização de diferentes ortobiológicos: (i) células-tronco 15 e (ii) scaffolds . 22 Esses primeiros estudos conseguiram reproduzir de forma satisfatória resultados já bem estabelecidos em outros grupos de pesquisa, e estão funcionando como motivadores para a continuidade no desenvolvimento, aperfeiçoamento e utilização de ortobiológicos.

No modelo experimental apresentado, com uma lesão aguda, cortante do tecido muscular, esperamos que a utilização de ADSCs consiga otimizar a cicatrização muscular através de três mecanismos 24 : (i) produção de fatores de crescimento, com otimização da angiogênese e diminuição das vias que favorecem a apoptose celular; (ii) ação imunossupressora através da diminuição da atividade nos linfócitos T e B; (iii) indução na diferenciação de fibroblastos em miócitos.

A opção por uma lesão aguda e com avaliação precoce foi motivada pela maior funcionalidade e atuação das células-tronco nos primeiros dias pós-intervenção. Dessa maneira, procuramos avaliar uma provável aceleração na recuperação funcional ao longo do tempo, após utilização de ADSCs. Nesse sentido, a grande inovação desse trabalho foi justamente apresentar o primeiro estudo com utilização de ADSCs no tratamento de lesão muscular aguda em um modelo experimental.

Dentre as limitações deste estudo podemos citar as dificuldades para o cálculo amostral, visto o pioneirismo do estudo; a utilização de um modelo experimental pouco reprodutível na prática clínica, visto que as lesões cortantes não são as mais frequentes; e ausência de avaliação adicional com outros métodos, como a biomecânica e a avaliação funcional. Como perspectivas para o futuro, esperamos manter o pioneirismo e continuar os trabalhos com desenvolvimento, produção e avaliação dos mais diversos ortobiológicos disponíveis.

Conclusão

A utilização de ADSCs no tratamento de lesão muscular aguda apresentou vantagens histológicas quando comparado a sua não utilização.