Detection of Microorganisms in Clinical Sonicated Orthopedic Devices Using Conventional Culture and qPCR.

Objective  To evaluate the sensitivity and specificity of the quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) for 16S rDNA gene screening using sonicated fluid from orthopedic implants. Methods  A retrospective study was conducted on 73 sonicated fluids obtained from patients with infection associated with orthopedic implants. The samples were subjected to conventional culture and molecular testing using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and qPCR for 16S rDNA . The cycle threshold values were used to define a cut-off of the qPCR of the 16S rDNA for negative and positive cultures. Results  No statistical differences were observed between the positive and negative culture groups based on the time from the first surgery to infection ( p  = 0.958), age ( p =  0.269), or general comorbidities. Nevertheless, a statistical difference was found between the mean duration of antibiotic use before device removal (3.41 versus 0.94; p =  0.016). Bacterial DNA was identified in every sample from the sonicated fluids. The median cycle thresholds of the positive and negative cultures were of 25.6 and 27.3 respectively ( p  < 0.001). As a diagnostic tool, a cycle threshold cut-off of 26.89 demonstrated an area under the curve of the receiver operating characteristic of 0.877 ( p  ≤ 0.001). Conclusion  The presence of antimicrobial agents for more than 72 hours decreased culture positivity, but did not influence the qPCR results. Despite this, amplification of the 16S rDNA may overestimate infection diagnosis. Sociedade Brasileira de Ortopedia e Traumatologia. This is an open access article published by Thieme under the terms of the Creative Commons Attribution-NonDerivative-NonCommercial License, permitting copying and reproduction so long as the original work is given appropriate credit. Contents may not be used for commecial purposes, or adapted, remixed, transformed or built upon. ( https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ ).

Introduction

Orthopedic implant-associated infections (OIAIs) and periprosthetic joint infections (PJIs) are associated with high morbidity, mortality, and costs. 1 Biofilm-associated microorganisms are the main etiological agents of OIAIs and PJIs, including Staphylococcus spp., Pseudomonas aeruginosa , and some species of Enterobacterales . 2 3 The structure of biofilms develops after an initial attachment of microorganisms to a substratum, wherein the microorganisms adhere irreversibly to the surface and produce extracellular polymers, forming a structural matrix that plays an essential role in the pathogenesis of OIAIs and PJIs. 4 Biofilm formation is not only prevalent in prosthetic devices; it also occurs in bone and/or bone cement, synovial fluid, and fibrous tissue. 5

The accurate diagnosis and early identification of infectious agents are vital for a successful treatment. Multiple cultures of the periimplant tissue are the gold standard for microbial detection in OIAI and PJI. 6 7 However, this method has low sensitivity, with only 62% of detection of the infectious bacteria, 6 8 and requires at least 24 hours until the microbial growth can be assessed. 9 Additionally, conventional culture is associated with false-negative results in low-grade infections or in patients undergoing antimicrobial treatment. 10 However, implant sonication, which dislodges the biofilm from the device, increases the culture sensitivity when compared with periimplant tissue biopsy or culture. 1

Modern techniques, such as molecular testing, have redefined the methods of microbiological investigation. Several techniques have been described for the molecular examination of sonicated fluids, with the aim of improving the diagnostic sensitivity or detection of periprosthetic infection. 11 12 13 14 15 For instance, the polymerase chain reaction (PCR), broad-range 16S ribosomal DNA (rDNA) PCR, or multiplex PCR, offer significant advantages in the detection of active as well as non-viable microorganisms (even in cases in which antibiotics were administered before sampling). 16 However, the results can be controversial due to DNA contamination (while detecting mixed infections) when using broad-range PCR, but they are less controversial with multiplex PCR. 17 In addition, matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) has been used in various settings for the direct detection of biological samples for the early and reliable identification of the microorganisms, as an alternative to culture. 18 19 20

The aim of the present study was to evaluate the sensitivity and specificity of the quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) to screen the 16S rDNA gene from the sonicated fluid samples obtained from orthopedic implants.

Methods

Setting

The present was a single-center, retrospective study following the implementation of a sonication method after orthopedic surgery. The study evaluated a period of 12 months (from December 2018 to December 2019) in a tertiary care, medical, surgical, and academic teaching hospital with a capacity of 206 beds. The hospital is a referral center for trauma patients, admitting approximately 1,100 inpatients, with 4,800 patient-days per month.

Patients and Devices

Different types of orthopedic devices were obtained under surgical conditions after medical recommendation (suspicion of infection). Infection criteria met the definitions of the International Consensus Group on Periprosthetic Joint and of the International Consensus Meeting on musculoskeletal infection. 21 22 Patients with external fixation devices were excluded from the study. Clinical data were evaluated for a group analysis.

Sonication of the Orthopedic Devices

All explanted devices were placed into sterile and nuclease-free polyethylene sampling bags with a removable seal and a wire closure system (Labplas, Sainte-Julie, Quebec, Canada), and immediately sent for sonication. The sonication was performed in a 0.9% NaCl solution in an amount sufficient to cover the device; the solution was sonicated for 5 min in an ultrasonic bath using a Soniclean 15 (Sanders Medical, Santa Rita da Sapucaí, MG, Brazil) at a frequency of approximately 40 kHz and 35°C. 1 One aliquot was used for microbiological tests, and 50-mL aliquots were stored at -20°C for molecular tests. In total, 39 samples with bacterial growth (detected by conventional culture) and 34 samples without bacterial growth were used.

Laboratory Tests

For the conventional culture, 100 μL of the sonicated fluid were spread onto tryptic soy agar plates supplemented with 5% sheep blood and MacConkey agar (Laborclin, Pinhais, PR, Brazil), and incubated for 5 days at 35°C. The anaerobic culture was performed for 14 days in a standard anaerobic medium (Bactec, BD, Franklin Lakes, NJ, US). Colony growth was evaluated using a direct detection protocol with MALDI-TOF MS.

Direct detection of microorganisms using MALDI-TOF MS was performed on the Vitek MS equipment (bioMérièux, Durham, NC, US). The sample-extraction process was adapted from a previously-described protocol. 23 Briefly, 4 mL of the sonication fluid were centrifuged at 367 × g for 5 minutes, and the pellet obtained was washed with deionized water. The pellet was resuspended in 50 μL of deionized water, followed by the addition of 900 μL of absolute alcohol. After vortexing, the tube was centrifuged at 18,000 × g for 2 minutes, and the supernatant was discarded. A total of 50 µL of formic acid (70% v/v) and 50 μL of acetonitrile were added to the pellet. After vortexing, the tube was centrifuged at 18,000 × g for 2 minutes. Then, 1 μL of the supernatant was spotted directly onto the target plate. After drying, each inoculum was covered with 1 μL of the alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid (HCCA) matrix solution (bioMérièux). After drying, the samples were analyzed on the VITEK MS system. Quality control was performed using a reference strain of Escherichia coli ATCC 8739 . All procedures were performed in duplicate.

Microbial genomic DNA (gDNA) was detected by performing qPCR for the 16S rDNA gene screening (broad-range qPCR). Microbial DNA was extracted using the PureLink Genomic DNA Mini Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, US) according to the manufacturer's instructions, using 1 mL of the sonication fluid, and 50 μL of DNA were extracted. For the molecular detection of 16S rDNA , the TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, US) was used; the detection was adapted from a previously-described protocol, 24 using forward and reverse primers, and a probe with the following sequences: 5'-TGGAGCATGTGGTTTAATTCGA-3' , 5'-TGCGGGACTTAACCCAACA-3' , and (CY5)-5'-CACGAGCTGACGACARCCATGCA-3'-(BHQ . 25 The reaction was performed in triplicate for each sample, using 12.5 μL of the TaqMan Universal PCR Master Mix, 8.7 μL of ultrapure water, 0.6 μL of each primer (forward and reverse; 20 mM), 0.6 μL of probe (10 mM), and 2 μL of DNA, with a total volume of 25 μL per well. Furthermore, no template controls (NTC, using water instead of DNA) and positive controls were included, and the reactions were run on the ABI-7500 Fast real-time PCR instrument (Applied Biosystems, Inc.) using the following steps: 50°C for 2 minutes, 95°C for 10 minutes, 40 cycles of 95°C for 15 seconds, and 60°C for 1 minute.

Standard curves using Gram-negative bacterium, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (Laborclin), and Gram-positive bacterium, Staphylococcus aureus ATCC 25923 (Laborclin) were generated for 16S rDNA to determine the efficiency and analytical sensitivity of the assay. Briefly, the saline solution was inoculated with S. aureus and P. aeruginosa at progressive dilutions, from 10 8 to 10 2 CFU/mL (performed in triplicate), to determine the standard curve. The cycle threshold (Ct) values were used to calculate the performance of 16S rDNA qPCR. The last three concentrations detected in the standard curve (10 2  ± 1) were amplified with 30 repetitions to define the limit of detection (LOD), which must amplify 100% of molecular targets to ensure minimal detection with a 95% confidence interval (95%CI). Dilutions were made before each experiment. The standard curve was plotted from the Cq × log 10 plot of target gene concentration/reaction based on the determination of the copy number of the 16S gene in S. aureus and P. aeruginosa strains. After the linear regression of the obtained points, R 2 and the equation of a straight line (y = mx + n) were determined using the following equation:

Cq = slope x log (n) + y-intercept,

in which: Cq  = cycle of quantification;

slope  = angular coefficient of the line;

log (n)  = logarithmic base 10 of the gene copies per reaction; and

y-intercept  = linear coefficient.

Statistical Analysis

The continuous variables were expressed as means with standard deviations (SDs), and they were analyzed using the Student t -test. The categorical variables were expressed as absolute frequencies and proportions, and they were analyzed using the Chi-squared or Fisher tests. The sensitivity, specificity, and positive and negative predictive values were calculated using the culture as a reference (culture-positive infection versus Culture-negative infection). The Ct was determined to improve the accuracy of the PCR using the cultures as the gold standard. The area under the receiver operating characteristic (ROC) curve was calculated to quantify the discriminative ability of the qPCR. The statistical significance was set at p  < 0.05. The Statistical Package for the Social Sciences (SPSS, IBM Corp., Armonk, NY, US) software was used for the statistical analysis.

Results

General Characteristics

In total, 148 sonicated fluids were collected. The clinical characteristics were present in 132 samples (52 positive cultures; 80 negative cultures). However, 59 stored samples could not be recovered for the qPCR. Thus, 73 sonicated fluids were included in the final analysis.

The median age was 54 years (range: 39 to 64 years) and 68.4% of patients (n = 50) were male. The median time between the first surgical procedure and infection was of 220 days (range: 30.5 to 962 days). The sonicated implants consisted of parts of the prosthesis (hip and knee) and fixation devices (screws, plates, wires, and pins). The main comorbidities were arterial hypertension (n=30; 41%), trauma (n=27; 36.9%), and diabetes mellitus (n=11; 15%). Before samples were collected, 30 patients (41%) received antimicrobial therapy. The main clinical characteristics of the patients are listed in Table 1 .

Table 1

Clinical and laboratory characteristics of patients with infection and negative or positive cultures of sonicated orthopedic devices

	Negative culture			Positive culture
	n = 34			n = 39
	Mean or N	Standard deviation or %	Median	Mean or N	Standard deviation or %	Median	p -value
Cycle threshold	27.22	0.89	27.35	24.51	3.14	25.64	< 0.001
Time from surgery to infection (days)	1,649	7,355	126	2,715	9,158	240	0.958
Age (years)	55.82	18.58	57.50	51.12	17.37	48.00	0.269
Duration of the antibiotic therapy before implant removal (days)	3.41	5.96	1.00	0.94	1.65	1.00	0.016
Sonicated device
Hip prosthesis	15	44%		9	23%
Knee prosthesis	3	9%		5	13%
Shoulder prosthesis	0	0%		1	3%
Plate and screws	4	12%		9	23%
Only screws	8	24%		9	23%
Only plate	3	9%		6	15%
Wires	1	3%		0	0%
Male gender	23	68%		27	69%		0.542
Trauma	13	38%		14	36%		0.514
Smoking	4	12%		6	15%		0.460
HIV	0	0%		0	0%		−
Diabetes mellitus	5	15%		6	15%		0.274
Chronic renal failure	1	3%		0	0%		−
Hearth failure	2	6%		0	0%		−
Peripheral vascular disease	1	3%		3	8%		0.361
Previous stroke	2	6%		3	8%		0.566
Chronic pulmonary disease	1	3%		0	0%		−
Arterial hypertension	15	44%		13	33%		0.241
Neoplasm	0	0%		1	3%		−
Liver diseases	1	3%		0	0%		−
Antibiotic therapy prior material sampling	16	47%		14	36%		0.233

Cultures and Etiologies

Using the conventional culture method, 39 samples (53.5%) were found positive. Infections due to Staphylococcus spp. were found in 64% (n = 25) samples. Of these, 68% (n = 17) were due to methicillin-susceptible S. aureus (MSSA), and 28% (n = 7) were due to methicillin-resistant S. aureus (MRSA). Gram-negative bacilli (GNBs) were present in 25.6% (n = 10) of the samples, mainly nonfermenting GNBs, such as P. aeruginosa and Acinetobacter baumannii (n = 4). Mixed infections (polymicrobial) were found in 10% (n = 4) of the cases. The major etiologies are listed in Table 2 .

Table 2

Etiology of positive cultures from sonicated orthopedic devices from patients with infection

Microorganism		N
Staphylococcus spp.		25
	Methicillin-susceptible S. aureus	17
	Methicillin-resistant S. aureus	7
	S. epidermidis	1
Gram-negative bacilli		10
	Enterobacter spp.	2
	Morganella morgannii	1
	Proteus spp.	2
	Pseudomonas aeruginosa	2
	Serratia marcescens	1
	Acinetobacter baumannii	2
Mixed		4
	Enterobacter spp.  + S. aureus	1
	Enterococcus spp.  + S. aureus	1
	Klebsiella spp.  + S. pyogenes	1
	Serratia spp.  + P. aeruginosa	1

There were no statistical differences between the positive and negative groups based on the time from the first surgery to infection ( p  = 0.958), age ( p =  0.269), or general comorbidities. Nevertheless, a statistical difference was found between the mean duration of the antibiotic intake before device removal (3.41 versus 0.94; p   =  0.016) ( Table 1 ).

16S rDNA qPCR

Bacterial DNA was identified in all samples from sonicated fluids, regardless of the culture results. The median Ct values of the positive and negative cultures was of 25.6 and 27.3 respectively ( p  < 0.001), and those of S. aureus and GNBs were of 25.07 ± 2.97 and 23.53 ± 3.31 respectively ( p  = 0.123). As a diagnostic tool, a Ct cut-off of 26.89 demonstrated an area under the curve (AUC) of the ROC of 0.877 ( p  ≤ 0.001) ( Fig. 1 ). The Ct cut-off values are listed in Table 3 .

Fig. 1

Receiver operating characteristic curve of the cycle threshold of 26.9 to separate positive and negative cultures from the sonicated fluid of orthopedic devices.

Table 3

Positive predictive value (PPV), negative predictive value (NPV), sensitivity, specificity, and accuracy of different cycle threshold (Ct) values, considering culture positive infections versus culture negative infections

Ct value	26.25	26.89	27.17	27.45
Sensitivity	62%	79%	90%	97%
Specificity	94%	85%	68%	47%
PPV	92%	86%	76%	68%
NPV	68%	78%	85%	94%
Accuracy	77%	82%	79%	74%

In general, we observed that samples from patients who received antimicrobial therapy for more than 3 days before the surgical procedure were more likely to result in negative cultures ( p  = 0.016). However, the 16S rDNA qPCR was positive in all samples, even in patients with negative culture results. Further, the use of the Ct cut-off of 26.89 as a diagnostic tool demonstrated an AUC of 0.877 ( p  ≤ 0.001).

Discussion

Despite the progress made in the diagnosis of infections associated with orthopedic implants, tissue culture remains the gold-standard tool. Therefore, the standard criteria to diagnose PJI are closely related to the type and number of samples collected. Although cultures from pus may present higher sensitivity than that of other samples, no single tissue sample is reliable regarding the PJI criteria. 26 Thus, multiple cultures are traditionally needed to achieve a higher sensitivity. Additionally, culture positivity is directly influenced by the growth medium used. Samples inoculated directly in blood culture during the surgical procedure yielded results within 48 to 72 hours, with a sensitivity comparable to that of the conventional methods. 27 28 However, even with improved sample collection, inoculation, and processing methods such as sonication, the presence of antimicrobial agents at the surgical site for more than three days before the procedure reduces culture positivity.

Given the difficulties associated with the clinical management of PJI, cultures may not always be obtained in the absence of antibiotics. Thus, molecular tools, such as the PCR, may be advantageous compared to traditional culture techniques, once DNA can be amplified during the early clinical treatment phase. 16 However, depending on the molecular technique, specificity may decrease due to contamination. 17 In the present study, all samples were positive for 16S rDNA . Once this technique amplifies any bacterial gene, it is probable that it will present low specificity when used indiscriminately and broadly used. However, when advanced molecular tests, such as 16S rRNA or next-generation sequencing, are used according to clinical and laboratory criteria, they may present benefits. 29 30 Interestingly, compared to traditional methods, 16S rRNA failed to identify polymicrobial infection. 30 Therefore, given the complexities that arise during the evaluation of orthopedic infections (such as misdiagnosed infections and contaminations), a combination of techniques is important to reach a final diagnosis. 31

Tunney et al. 11 stated that the incidence of prosthetic joint infection is grossly underestimated by current culture-detection methods, and that molecular tests should be included in the routine. Despite the recommendation, Ryu et al. 15 confirmed that PCR presents a low sensitivity, but high specificity. Thus, for the etiological diagnosis, we can conclude that PCR may not be the ideal test, but a negative test excludes the presence of infection. In contrast, Gomez et al. 13 reported that PCR is equivalent to culture. We believe that these inconsistent results may be associated with the in-house method used for the qPCR. Unfortunately, the methods used in each study cannot be compared directly.

Improving diagnostic tools is necessary to establish the correct treatment and decrease therapy failure. Once S. aureus , mainly MRSA, has been associated with poor prognosis in PJI, 32 choosing the correct antimicrobial therapy (such as those with anti-biofilm properties) may be considered a treatment cornerstone. Future studies should explore the applicability of molecular tools in patients at a higher risk of treatment failure (such as those with immunosuppression) with a negative culture, despite clinical and laboratory results suggesting the presence of an infection.

The present study has some limitations. First, given the retrospective design, the “suspicion of infection” may have been overestimated. Second, after two to three years, the clinical outcomes were not evaluated to establish the significance of 16S rDNA positivity in patients with negative cultures. Still, the present study highlights the importance of adequate sample collection and the role of specialized laboratory techniques performed by an infectious disease expert. The 16S rDNA qPCR cannot identify the species; it is only used to identify the presence or absence of bacterial DNA. The test should be complemented with gene sequencing to identify the species.

Conclusão

Em conclusão, a presença de agentes antimicrobianos por mais de 72 horas diminuiu a positividade da cultura, sem influenciar os resultados da qPCR. Apesar disso, a amplificação do rDNA 16S pode sobrestimar o diagnóstico da infecção. Mais estudos são necessários para avaliar o papel da qPCR do rDNA 16S no diagnóstico das IAPs.

Conclusion

In conclusion, the presence of antimicrobial agents for more than 72 hours decreased culture positivity without influencing qPCR results. Despite this, 16S rDNA amplification may overestimate the diagnosis infection. Further studies are warranted to evaluate the role of 16S rDNA qPCR in the diagnosis of PJI.

Introdução

As infecções associadas aos implantes ortopédicos (IAIOs) e as infecções articulares periprotéticas (IAPs) estão relacionadas a morbidade e mortalidade altas, e a custos altos. 1 Os microrganismos associados aos biofilmes são os principais agentes etiológicos das IAIOs e das IAPs, incluindo os microrganismos Staphylococcus spp., Pseudomonas aeruginosa e algumas espécies de Enterobacteriales . 2 3 A estrutura dos biofilmes se desenvolve após uma fixação inicial de microrganismos a um substrato, em que os microrganismos aderem irreversivelmente à superfície e passam a produzir polímeros extracelulares, formando uma matriz estrutural que desempenha um papel essencial na patogênese das IAIOs e IAPs. 4 A formação do biofilme não é apenas prevalente em dispositivos protéticos, como também ocorre nos ossos e/ou no cimento ósseo, no líquido sinovial, e no tecido fibroso. 5

O diagnóstico preciso e a identificação precoce do agente infeccioso são vitais para o sucesso do tratamento. Múltiplas culturas de tecido peri-implantar são o padrão-ouro para a detecção microbiana das IAIOs e IAPs. 6 7 No entanto, esse método apresenta baixa sensibilidade, com apenas 62% de detecção de bactérias infecciosas, 6 8 e são necessárias pelo menos 24 horas até que o crescimento microbiano possa ser avaliado. 9 Além disso, a cultura convencional está associada a resultados falsos negativos em infecções de baixo grau ou em pacientes submetidos a tratamento antimicrobiano. 10 No entanto, a sonicação do implante, que desaloja o biofilme do dispositivo, aumenta a sensibilidade da cultura em comparação com a biópsia ou a cultura do tecido peri-implantar. 1

Técnicas modernas, como os testes moleculares, redefiniram os métodos de investigação microbiológica. Várias técnicas foram descritas para a realização do exame molecular de fluidos sonicados, com o objetivo de melhorar a sensibilidade diagnóstica ou a detecção de infecção periprotética. 11 12 13 14 15 A reação em cadeia da polimerase ( polymerase chain reaction , PCR, em inglês), a PCR de DNA ribossômico ( ribosomal DNA , rDNA, em inglês) 16S de amplo alcance, ou a PCR multiplex, por exemplo, oferecem vantagens significativas de detecção de microrganismos ativos e não viáveis (até mesmo nos casos em que os antibióticos foram administrados antes da amostragem). 16 No entanto, os resultados podem ser controversos, devido à contaminação do DNA (durante a detecção de infecções mistas) ao usar a PCR de amplo alcance; porém, são menos controversos com a PCR multiplex. 17 Além disso, a ionização e dessorção a laser assistida por matriz com espectrometria de massa por tempo de voo ( matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry , MALDI-TOF MS, em inglês) tem sido usada em vários ambientes para a detecção direta de amostras biológicas; ela identifica precocemente e de forma confiável os microrganismos, e é uma alternativa à cultura. 18 19 20

O objetivo deste estudo foi avaliar a sensibilidade e a especificidade da reação em cadeia de polimerase em tempo real quantitativa ( quantitative real-time polymerase chain reaction , qPCR, em inglês) em rastrear o gene rDNA 16S , em amostras de fluidos sonicados obtidas de implantes ortopédicos.

Ambiente

Este foi um estudo retrospectivo de centro único acompanhado da implementação de um método de sonicação após cirurgia ortopédica. O estudo levou em consideração o período de dezembro de 2018 a dezembro de 2019, e foi realizado em um hospital universitário com assistência médica e cirúrgica de alta complexidade, com capacidade para 206 leitos. O hospital é referência para pacientes traumatizados, com aproximadamente 1.100 pacientes sob o regime de internação/mês, e atende cerca de 4.800 pacientes por mês.

Pacientes e Dispositivos

Foram obtidos diferentes tipos de dispositivos ortopédicos, mediante condições cirúrgicas, após prévia recomendação médica (suspeita de infecção). Os critérios de infecção atenderam às definições do Grupo de Consenso Internacional sobre Articulação Periprotética e da Reunião de Consenso Internacional sobre infecção musculoesquelética. 21 22 Os pacientes com dispositivos de fixação externa foram excluídos do estudo. Os dados clínicos foram avaliados para se fazer a análise de grupo.

Sonicação de dispositivos ortopédicos

Todos os dispositivos explantados foram colocados em sacos para coleta de amostras, estéreis e sem nuclease, produzidos em polietileno, com selo removível e sistema de fechamento com fio (Labplas, Sainte-Julie, Quebec, Canadá), que foram imediatamente encaminhados para sonicação. A sonicação foi realizada em solução de NaCl 0,9%, em quantidade suficiente para cobrir o dispositivo; ela foi sonicada por 5 min em um banho ultrassônico, usando a lavadora ultrassônica Soniclean 15 (Sanders Medical, Santa Rita da Sapucaí, MG, Brasil) em uma frequência de aproximadamente 40 kHz e 35°C. 1 Uma alíquota foi usada para os testes microbiológicos, e alíquotas de 50 mL foram armazenadas a -20°C para a realização dos testes moleculares. Foram utilizadas 39 amostras com crescimento bacteriano (detectado por cultura convencional), e 34 amostras sem crescimento bacteriano.

Testes laboratoriais

Para a cultura convencional, 100 μL do fluido sonicado foram espalhados em uma placa de ágar tríptico de soja, suplementada com 5% de sangue de ovelha e o meio de cultura ágar MacConkey (Laborclin, Pinhais, PR, Brasil), e incubados durante 5 dias a 35°C. A cultura anaeróbia foi realizada por 14 dias em meio anaeróbio padrão (Bactec, BD, Franklin Lakes, NJ, EUA). O crescimento da colônia foi avaliado usando um protocolo de detecção direta com a tecnologia MALDI-TOF MS.

A detecção direta de microrganismos com o uso de MALDI-TOF MS foi realizada em equipamento Vitek MS (bioMérièux, Durham, NC, EUA). O processo de extração da amostra foi adaptado a partir de um protocolo previamente descrito. 23 Resumidamente, 4 mL do fluido de sonicação foram centrifugados a 367 × g por 5 minutos, e o sedimento obtido foi lavado com água desionizada. O sedimento foi ressuspenso em 50 μL de água desionizada, e a ressuspensão foi seguida do acréscimo de 900 μL de álcool absoluto. Após o vórtice, o tubo foi centrifugado a 18.000 × g por 2 minutos, e o sobrenadante foi descartado. Um total de 50 µL de ácido fórmico (70% v/v) e 50 µL de acetonitrila foram adicionados ao sedimento. Após o vórtice, o tubo foi centrifugado a 18.000 × g por 2 minutos. Em seguida, 1 µL do sobrenadante foi aplicado diretamente sobre a placa-alvo. Após a secagem, cada inóculo foi coberto com 1 µL da solução da matriz de ácido alfa-4-ciano-hidroxicinâmico (bioMérièux). Após a secagem, as amostras foram analisadas no Sistema VITEK MS. O controle de qualidade foi realizado usando uma cepa de referência de Escherichia coli ATCC 8739 . Todos os procedimentos foram realizados em duplicata.

O DNA genômico ( genomic DNA , gDNA, em inglês) microbiano foi detectado realizando a qPCR para a triagem do gene rDNA 16S (qPCR de amplo alcance). O DNA microbiano foi extraído com o uso do PureLink Genomic DNA Mini Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante, usando 1 mL do fluido de sonicação, sendo extraídos 50 µL de DNA. Para a detecção molecular do rDNA 16S , usou-se o TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EUA); a detecção foi adaptada de um protocolo descrito anteriormente, 24 com o uso de iniciadores direto e reverso e uma sonda com as seguintes sequências: 5'-TGGAGCATGTGGTTTAATTCGA-3' , 5'-TGCGGGACTTAACCCAACA-3' , e (CY5)-5'-CACGAGCTGACGACARCCATGCA-3'-(BHQ2) . 25 A reação foi realizada em triplicata para cada amostra, usando 12,5 µL de TaqMan Universal PCR Master Mix, 8,7 µL de água ultrapura, 0,6 µL de cada iniciador (direto e reverso; 20 mM), 0,6 µL de sonda (10 mM), e 2 µL de DNA, perfazendo um volume total de 25 µL por cavidade. Além disso, nenhum controle de modelo (NCM, usando água em vez de DNA) e controles positivos foram incluídos, e as reações foram executadas no instrumento de PCR em tempo real ABI-7500 Fast (Applied Biosystems, Inc.), usando as seguintes etapas: 50°C por 2 minutos, 95°C por 10 minutos, 40 ciclos de 95°C por 15 segundos, e de 60° C por 1 minuto.

Curvas padrão usando bactéria Gram-negativa, P. aeruginosa ATCC 27853 (Laborclin), e bactéria Gram-positiva, Staphylococcus aureus ATCC 25923 (Laborclin) foram geradas pelo rDNA 16S para determinar a eficiência e a sensibilidade analítica do ensaio. Resumidamente, o soro fisiológico foi inoculado com S. aureus e P. aeruginosa em diluições progressivas de 108 a 102 UFC/mL (realizadas em triplicata) para determinar a curva padrão. Os valores do limiar do ciclo ( cycle threshold , Ct, em inglês) foram usados para calcular o desempenho da qPCR do rDNA 16S . As três últimas concentrações detectadas na curva padrão (102 ± 1) foram amplificadas com 30 repetições para definir o limite de detecção (LDD), o qual deve amplificar 100% dos alvos moleculares, a fim de garantir uma detecção mínima com intervalo de confiança de 95% (IC 95%). As diluições foram realizadas antes de cada experiência. A curva padrão foi traçada a partir do gráfico Cq × log 10 da concentração/reação do gene alvo com base na determinação do número de cópias do gene 16S nas cepas de S. aureus e P. aeruginosa . Após a regressão linear dos pontos obtidos, R2 e a equação para a reta (y = mx + n) foram determinados com o uso da seguinte equação:

Cq = declive x log (n) + interceptação em y,

em que: Cq  = ciclo de quantificação;

declive  = coeficiente angular da reta;

log (n)  = logaritmo da base 10 das cópias do gene por reação; e

interceptação em y  = coeficiente linear.

Análise Estatística

As variáveis contínuas foram expressas como médias com desvios padrão (DPs), e analisadas usando o teste t de Student. As variáveis categóricas foram expressas como frequências absolutas e proporções, e foram analisadas mediante o teste do Qui-quadrado ou de Fisher. A sensibilidade, especificidade e os valores preditivos positivos e negativos foram calculados usando a cultura como referência (infecção por cultura positiva versus infecção por cultura negativa). O Ct foi determinado para melhorar a precisão da PCR usando culturas como o padrão-ouro. A área sob a curva de característica de operação do receptor (COR) foi calculada para quantificar a capacidade discriminativa da qPCR. A significância estatística foi estabelecida em p  < 0,05. Para a análise estatística, usou-se o programa Statistical Package for the Social Sciences (SPSS, IBM Corp., Armonk, NY, EUA).

Características Gerais

Foram coletados 148 fluidos sonicados. As características clínicas estavam presentes em 132 amostras (52 culturas positivas; 80 culturas negativas). No entanto, 59 amostras armazenadas não puderam ser recuperadas para o qPCR. Portanto, somente 73 fluidos sonicados foram incluídos na análise final.

A mediana de idade foi de 54 anos (variação: 39 a 64 anos) e 68,4% dos pacientes (n = 50) eram do sexo masculino. O tempo médio entre o primeiro procedimento cirúrgico e a infecção foi de 220 dias (variação: 30,5 a 962 dias). Os implantes sonicados eram constituídos de partes das próteses (de quadril e joelho) e de dispositivos de fixação (parafusos, placas, fios e pinos). As principais comorbidades foram hipertensão arterial (41%), trauma (36,9%), e diabetes mellitus (15%). Antes da coleta das amostras, 30 pacientes (41%) receberam terapia antimicrobiana. As principais características clínicas dos pacientes estão listadas na Tabela 1 .

Tabela 1

Características clínicas e laboratoriais dos pacientes com infecção e cultura negativa ou positiva dos dispositivos ortopédicos sonicados

	Cultura negativa			Cultura positiva
	n = 34			n = 39
	Média ou N	Desvio padrão ou %	Mediana	Média ou N	Desvio padrão ou %	Mediana	Valor de p
Limiar do ciclo	27,22	0,89	27,35	24,51	3,14	25,64	< 0,001
Tempo da cirurgia até a infecção (dias)	1.649	7.355	126	2.715	9.158	240	0,958
Idade (anos)	55,82	18,58	57,50	51,12	17,37	48,00	0,269
Duração da antibioterapia antes da remoção do implante (dias)	3,41	5,96	1,00	0,94	1,65	1,00	0,016
Dispositivo sonicado
Prótese de quadril	15	44%		9	23%
Prótese de joelho	3	9%		5	13%
Prótese de ombro	0	0%		1	3%
Placa e parafusos	4	12%		9	23%
Somente parafusos	8	24%		9	23%
Somente placa	3	9%		6	15%
Fios	1	3%		0	0%
Sexo masculino	23	68%		27	69%		0,542
Trauma	13	38%		14	36%		0,514
Tabagismo	4	12%		6	15%		0,460
HIV	0	0%		0	0%		−
Diabetes mellitus	5	15%		6	15%		0,274
Insuficiência renal crônica	1	3%		0	0%		−
Insuficiência cardíaca	2	6%		0	0%		−
Doença vascular periférica	1	3%		3	8%		0,361
Acidente vascular cerebral prévio	2	6%		3	8%		0,566
Doença pulmonar crônica	1	3%		0	0%		−
Hipertensão arterial	15	44%		13	33%		0,241
Neoplasia	0	0%		1	3%		−
Doenças hepáticas	1	3%		0	0%		−
Antibioterapia sob amostra	16	47%		14	36%		0,233

Culturas e Etiologias

Pelo método de cultura convencional, 39 amostras (53,5%) foram consideradas positivas. Infecções por Staphylococcus spp. foram encontrados em 64% (n = 25) das amostras. Destes, 68% (n = 17) foram devido a S. aureus sensível à meticilina (SASM) e 28% (n = 7) foram devido a S. aureus resistente à meticilina (SARM). Os bacilos Gram-negativos (BGNs) estavam presentes em 25,6% (n = 10) das amostras, principalmente BGNs não fermentadores, como P. aeruginosa e Acinetobacter baumannii (n = 4). As infecções mistas (polimicrobianas) foram encontradas em 10% (n = 4) dos casos. As principais etiologias estão listadas na Tabela 2 .

Tabela 2

Etiologia da cultura positiva dos dispositivos ortopédicos sonicados de pacientes com infecção

Microrganismos		N
Staphylococcus spp.		25
	S. aureus sensível à meticilina	17
	S. aureus resistente à meticilina	7
	S. epidermidis	1
Bacilos Gram-negativos		10
	Enterobacter spp.	2
	Morganella morgannii	1
	Proteus spp.	2
	Pseudomonas aeruginosa	2
	Serratia marcescens	1
	Acinetobacter baumannii	2
Mistos		4
	Enterobacter spp.  + S. aureus	1
	Enterococcus spp.  + S. aureus	1
	Klebsiella spp.  + S. pyogenes	1
	Serratia spp.  + P. aeruginosa	1

Não houve diferenças estatísticas entre os grupos positivo e negativo com base no tempo transcorrido entre a primeira cirurgia e a infecção ( p  = 0,958), na idade ( p  = 0,269), ou nas comorbidades gerais. No entanto, uma diferença estatística foi encontrada entre a duração média da ingestão dos antibióticos antes da remoção do dispositivo (3,41 versus 0,94; p  = 0,016) ( Tabela 1 ).

qPCR do rDNA 16S

O DNA bacteriano foi identificado em todas as amostras de fluidos sonicados, independentemente dos resultados da cultura. As medianas do Ct de culturas positivas e negativas foi de 25,6 e 27,3, respectivamente ( p  < 0,001), e as de S. aureus e BGNs foram 25,07 ± 2,97 e 23,53 ± 3,31, respectivamente ( p  = 0,123). Como uma ferramenta de diagnóstico, um corte de Ct de 26,89 demonstrou uma área sob a curva (ASC) da COR de 0,877 ( p ≤ 0,001) ( Fig. 1 ). Os valores de corte de Ct estão listados na Tabela 3 .

Fig. 1

Curva da característica de operação do receptor do limiar do ciclo de 26,9, para separar as culturas positivas e negativas a partir do fluido sonicado dos dispositivos ortopédicos.

Tabela 3

Valor preditivo positivo (VPP), valor preditivo negativo (VPN), sensibilidade, especificidade, e precisão de diferentes valores do limiar do ciclo (Ct), considerando as infecções positivas para cultura versus as negativas

Valor Ct	26,25	26,89	27,17	27,45
Sensibilidade	62%	79%	90%	97%
Especificidade	94%	85%	68%	47%
VPP	92%	86%	76%	68%
VPN	68%	78%	85%	94%
Precisão	77%	82%	79%	74%

Em geral, observamos que as amostras de pacientes que receberam terapia antimicrobiana por mais de 3 dias antes do procedimento cirúrgico apresentaram maior probabilidade de resultar em culturas negativas ( p  = 0,016). No entanto, a qPCR do rDNA 16S foi positiva em todas as amostras, até mesmo nos pacientes com resultados de culturas negativas. Além disso, o uso do corte de Ct de 26,89 como uma ferramenta de diagnóstico demonstrou uma ASC de 0,877 ( p ≤ 0,001).

Discussão

Apesar dos avanços no diagnóstico das infecções associadas aos implantes ortopédicos, a cultura de tecidos continua sendo a ferramenta padrão-ouro. Portanto, os critérios padrão para o diagnóstico das IAPs estão intimamente relacionados ao tipo e ao número das amostras coletadas. Embora as culturas de pus possam apresentar maior sensibilidade do que as de outras amostras, nenhuma amostra de tecido é confiável para os critérios das IAPs. 26 Portanto, tradicionalmente, várias culturas são necessárias para atingir maior sensibilidade. Além disso, a positividade da cultura é diretamente influenciada pelo meio de crescimento usado. As amostras inoculadas diretamente na hemocultura durante o procedimento cirúrgico deram resultados dentro de 48 a 72 horas, com sensibilidade comparável aos métodos convencionais. 27 28 No entanto, mesmo com melhores coletas de amostras, de inoculação, e dos métodos de processamento, como a sonicação, a presença de agentes antimicrobianos no sitio cirúrgico por mais de três dias antes do procedimento reduz a positividade da cultura.

Dadas as dificuldades associadas ao tratamento clínico das IAPs, as culturas nem sempre podem ser obtidas na ausência de antibióticos. Assim, ferramentas moleculares, como a PCR, podem ser vantajosas em relação às técnicas tradicionais de cultura, uma vez que o DNA pode ser amplificado durante a fase inicial do tratamento clínico. 16 No entanto, dependendo da técnica molecular, a especificidade pode diminuir devido à contaminação. 17 Em nosso estudo, todas as amostras foram positivas para rDNA 16S . Uma vez que essa técnica amplifica qualquer gene bacteriano, é provável que apresente baixa especificidade quando indiscriminada e amplamente utilizada. No entanto, quando testes moleculares avançados, como o rRNA 16S ou o sequenciamento de última geração são usados, eles podem apresentar benefícios de acordo com critérios clínicos e laboratoriais. 29 30 Curiosamente, em comparação com os métodos tradicionais, o rRNA 16S deixou de identificar a infecção polimicrobiana. 30 Portanto, em virtude das complexidades que surgem durante a avaliação das infecções ortopédicas (como infecções mal diagnosticadas e contaminações), uma combinação de técnicas é importante para chegar a um diagnóstico final. 31

Tunney et al. 11 afirmaram que a incidência da infecção da prótese articular é muito subestimada pelos métodos atuais de detecção de cultura, e os testes moleculares devem ser incluídos na rotina. Apesar da recomendação, Ryu et al. 15 confirmaram que a PCR apresenta baixa sensibilidade, mas alta especificidade. Assim, para o diagnóstico etiológico, podemos concluir que a PCR pode não ser o teste ideal; porém, um teste negativo exclui a presença de infecção. Em contraste, Gomez et al. 13 relataram que a PCR é equivalente à cultura. Acreditamos que esses resultados inconsistentes podem estar associados ao método interno usado para a qPCR. Infelizmente, os métodos utilizados em cada estudo não podem ser comparados diretamente.

É necessário melhorar as ferramentas de diagnóstico para estabelecer o tratamento correto e diminuir a adversidade terapêutica. Uma vez que S. aureus , principalmente o SARM, foi associado a um prognóstico desfavorável na IAP. 32 A escolha correta da terapia antimicrobiana (com propriedades antibiofilme, por exemplo) pode ser considerada o alicerce do tratamento. Estudos futuros devem explorar a aplicabilidade das ferramentas moleculares em pacientes com maior risco de insucesso terapêutico (como aqueles com imunossupressão) com cultura negativa, apesar de os resultados clínicos e laboratoriais sugerirem a presença de uma infecção.

Este estudo tem algumas limitações. Em primeiro lugar, por conta do desenho retrospectivo, pode ter sido sobrestimada a “suspeita de infecção”. Em segundo lugar, após dois a três anos, os resultados clínicos não foram avaliados, a fim de estabelecer a significância da positividade do rDNA 16S em pacientes com cultura negativa. Ainda assim, nosso estudo destaca a importância da coleta adequada de amostras e o papel de técnicas laboratoriais especializadas, realizadas por um especialista em doenças infecciosas. A qPCR do rDNA 16S não consegue identificar as espécies, e é usada apenas para identificar a presença ou ausência de DNA bacteriano. Esse teste deve ser complementado com o sequenciamento genético a fim de identificar as espécies.