Comparison of Novel Martin/Hopkins and Sampson Equations for Calculation of Low-Density Lipoprotein Cholesterol in Diabetic Patients.

BACKGROUND: The accurate determination of low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) is important to reach guideline-recommended LDL-C concentrations and to reduce adverse cardiovascular outcomes in diabetic patients. The commonly used Friedewald equation (LDL-Cf), gives inaccurate results in diabetic patients due to accompanying diabetic dyslipidemia. Recently two new equations - Martin/Hopkins (LDL-Cmh) and Sampson (LDL-Cs) - were developed to improve the accuracy of LDL-C estimation, but data are insufficient to suggest the superiority of one equation over the other one.
OBJECTIVE: The present study compared the accuracy and clinical usefulness of novel Martin/Hopkins and Sampson equations in diabetic patients.
METHODS: This study included 402 patients with diabetes. Patients' cardiovascular risk and LDL-C targets were calculated per European guidelines. Calculated LDL-Cmh, LDL-Cs, and LDL-Cf concentrations were compared with direct LDL-C concentration (LDL-Cd) to test agreement between these equations and LDL-Cd. A p-value <0.05 was accepted as statistically significant.
RESULTS: Both LDL-Cmh and LDL-Cs had a better agreement with LDL-Cd as compared to LDL-Cf, but no statistical differences were found among novel equations for agreement with LDL-Cd (Cronbach's alpha 0.955 for both, p=1). Likewise, LDL-Cmh and LDL-Cs showed a similar degree of agreement with LDL-Cd in determining whether a patient was in a guideline-recommended LDL-C target (96.3% for LDL-Cmh and 96.0% for LDL-Cs), which were marginally better than LDL-Cf (94.6%). In patients with a triglyceride concentration >400 mg/dl, agreement with LDL-Cd was poor, regardless of the method used.
CONCLUSION: Martin/Hopkins and Sampson's equations show a similar accuracy for calculating LDL-C concentrations in patients with diabetes, and both equations were marginally better than the Friedewald equation.

Introdução

Existe uma relação bem conhecida entre colesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL-C) e doença arterial coronariana (DAC) aterosclerótica. Pacientes com diabetes não apenas têm maior probabilidade de ter DAC, mas também têm mais tendência a dislipidemias, incluindo triglicérides (TG) elevado, colesterol de lipoproteína de alta densidade (HDL-C), e maiores concentrações de partículas densas de LDL-C. Existem evidências fortes que sugerem resultados cardiovasculares melhores com tratamento de redução de colesterol em portadores de diabetes mellitus (DM) com dislipidemias, e, embora o relacionamento entre LDL-C e DCVs seja menos certo em pacientes com DM, as diretrizes internacionais disponíveis recomendam o uso de LDL-C como a meta principal para decisões de tratamento. Portanto, a medição precisa de LDL-C é primordial em pacientes com DM.

O padrão de ouro para medição de LDL-C é a β-quantificação, mas essa técnica é exigente tecnicamente e usa muitos recursos, por isso não é empregada rotineiramente na prática. Apesar de os ensaios de LDL-C direto (LDL-Cd) estarem comercialmente disponíveis agora, eles não são amplamente adotados, e muitos laboratórios ainda informam as concentrações de LDL-C calculado no lugar. A equação de Friedewald (LDL-Cf), que é o método mais comum empregado na prática, não é confiável quando a concentração de triglicérides ultrapassa 150 mg/dl e o LDL-C está abaixo de 70 mg/dl. Essa é uma preocupação particular para pacientes com DM, já que a hipertrigliceridemia é um componente comum da dislipidemia diabética. Recentemente, as equações de Martin/Hopkins (LDL-CMH) e de Sampson (LDL-Cs) foram desenvolvidas para dar uma melhor estimativa da concentração de LDL-C, especialmente quando o TG estiver elevado. Entretanto, poucos estudos apresentaram uma comparação direta dessas duas equações e não há dados em pacientes com DM.

Na presente análise, o objetivo foi comparar as equações LDL-Cmh, LDL-Cs e LDL-Cf ao LDL-Cd para entender que equação tinha uma melhor concordância com LDL-Cd em pacientes diabéticos e até que ponto essas novas equações poderiam mudar a tomada de decisão clínica em comparação com a LDL-Cf.

Materiais e métodos

Seleção dos pacientes

Para a presente investigação, registros de pacientes cardiológicos ambulatoriais foram analisados retrospectivamente para os anos de 2019 e 2020. Pacientes com 18 anos de idade ou mais e portadores de diabetes no momento da internação foram incluídos no estudo. Pacientes cujos registros estavam incompletos foram excluídos. Nenhum outro critério de inclusão ou exclusão foi utilizado. Diabetes foi definido como a presença de um dos seguintes: i) estar em tratamento antidiabético com um diagnóstico anterior de diabetes ou ii) concentração de hemoglobina glicada igual ou maior que 6,5%. Dados demográficos, clínicos e laboratoriais dos pacientes foram coletados retrospectivamente a partir de um banco de dados eletrônico institucional. A taxa de filtração glomerular foi calculada usando-se a equação de dieta modificada em doença renal – taxa de filtração glomerular, e pacientes com uma taxa de filtração glomerular <60 ml/min/1,73 m2 foram aceitos como portadores de doença renal crônica. Os pacientes foram classificados como em risco cardiovascular intermediário, alto e muito alto, de acordo com as diretrizes europeias de 2019 sobre a gestão das dislipidemias. As metas de LDL-C para cada paciente individualmente foram determinadas usando as mesmas diretrizes. O estudo foi realizado de acordo com os princípios da Declaração de Helsinki de 1975 e suas revisões subsequentes, e a aprovação ética foi obtida de um comitê de ética local.

Medição de LDL-C direto e o cálculo de LDL-C estimado

As amostras de sangue foram coletadas usando métodos padrão, e as amostras foram enviadas ao laboratório em até 30 minutos após a coleta. O LDL-Cd foi medido por um método colorimétrico usando o sistema de análise integrado Abbott Architect Plus ci8200 (Abbott Labs, Chicago, IL, EUA) e reagentes de teste Archem LDL-Cd (Archem Health Ind, Turquia).

Outras análises químicas de sangue, incluindo parâmetros lipídicos, foram realizados usando métodos-padrão e a mesma amostra de sangue foi usada para todas as análises. A LDL-Cf foi calculada como:

conforme descrito anteriormente. Para o cálculo da LDL-Cs, foi utilizada a segunda equação relatada no trabalho de Sampson e colegas, que é a seguinte:

A LDL-Cmh precisa de um VLDL diferente: Os “fatores” de TG para cálculo em uma única equação matemática não podiam ser usados para derivar a LDL-CMH. Em vez disso, a LDL-CMH foi calculada usando planilhas disponibilizadas por um site mantido e apoiado pela Faculdade de Medicina da Johns Hopkins University.

Análises estatísticas

Variáveis contínuas foram expressas como média ± desvio padrão (DP) e variáveis categóricas foram apresentadas como porcentagem. Para as variáveis contínuas, os padrões de distribuição foram analisados pelo teste de Shapiro-Wilk e inspeção visual dos histogramas. Análises de correlação foram feitas com o teste de Pearson, e foram apresentados coeficientes de correlação para dar uma medida da força da relação entre métodos diferentes. Os gráficos de Bland-Altman foram elaborados para avaliar visualmente a concordância entre as concentrações de LDL-Cd e LDL-C calculado. Da mesma forma, o alfa de Cronbach e os coeficientes de correlação intraclasse foram calculados para a avaliação quantitativa da concordância. Os valores de alfa de Cronbach foram comparados usando-se o método de Feldt. A classificação correta para estar dentro da meta de LDL-C recomendada pelas diretrizes, bem como as taxas de reclassificação relativas a LDL-Cd, foram expressas em porcentagem. Os coeficientes de Kappa para a concordância foram calculados para cada par. Os pacientes foram estratificados por concentrações de TG (TG<150 mg/dl, TG 150-400 mg/dl, e TG>400 mg/dl) e análises de subgrupo separadas foram feitas para cada faixa. Por último, pacientes em uso de medicamentos anticolesterolêmicos foram analisados para entender a concordância entre as concentrações de LDL-Cd e LDL-C calculado em termos de alcançar a meta de concentração de LDL-C. Um p-valor <0,05 foi aceito como estatisticamente significativo para todas as comparações. As análises estatísticas foram realizadas com o Jamovi (The jamovi project (2020), Jamovi (Versão 1.2) para Windows. Retirados de (https://www.jamovi.org) e pacotes estatísticos SPSS 25.0 (IBM Corp, Armonk, NY, EUA).

Resultados

As características demográficas e clínicas do grupo do estudo são apresentadas na Tabela 1 . Mais de quatro quintos da coorte do estudo tinham risco alto ou muito alto, enquanto apenas um quarto dos pacientes fazia uso de pelo menos um medicamento anticolesterolêmico. O LDL-C médio, calculado com todas as três equações, foi mais baixo que o LDL-Cd, e a maior diferença ocorreu entre o LDL-Cd e a LDL-Cf.

Tabela 1

Características demográficas, clínicas e laboratoriais da amostra do estudo

Característica	Valor
Idade (anos)	56 ± 13
Sexo (feminino)	189 (47,0%)
Índice de massa corporal (kg/m2)	29,4 ± 4,4
Pressão arterial sistólica (mmHg)	134,0 ± 17,5
Pressão arterial diastólica (mmHg)	80,5 ± 10,1
Tabagismo, n(%)	118 (29,4%)
Doença arterial coronariana (%)	83 (20,6%)
Doença renal crônica (%)	10 (2,7%)
Antidiabéticos orais (%)	372 (92,5%)
Insulina (%)	58 (14,4%)
Medicamentos anti-hipercolesterolemia (%)	111 (27,6%)
Glicemia jejum (mg/dl)	140,0 ± 54,1
Hemoglobina glicada (%) (n=336)	7,0 ± 1,7
Creatinina (mg/dl)	0,88 ± 0,24
TFG (ml/min/m2)	90,4 ± 38,1
Colesterol total (mg/dL)	199,0 ± 45,3
Triglicérides (mg/dL)	163 (108 – 223)
Colesterol HDL (mg/dl)	45,3 ± 10,6
Colesterol LDL direto (mg/dl)	125,0 ± 35,0
Faixa de risco SCORE
Risco intermediário	75 (18,7%)
Risco alto	212 (52,7%)
Risco muito alto	115 (28,6%)
Colesterol LDL Martin/Hopkins	120,0 ± 38,4
Colesterol LDL Sampson	123,0 ± 38,1
Colesterol LDL Friedewald	24,5 (7,6)

TFG: Taxa de filtração glomerular; HDL: Lipoproteína de alta densidade; LDL: lipoproteína de baixa densidade; ADO: Antidiabético oral; SCORE: Systematic coronary risk evaluation (Avaliação de risco coronário sistemática).

Correlação e concordância entre LDL-Cd e LDL-C calculado

Todas as três equações apresentaram uma forte correlação com o LDL-Cd, mas a LDL-Cf tinha o valor mais baixo (r=0,915) em comparação com a LDL-Cmh (r=0,932) e a LDL-Cs (r=0,929) ( Figura 1 ). Dados sobre a concordância entre LDL-Cd e o LDL-C calculado foram apresentados na Tabela 2 . A LDL-Cmh e a LDL-Cs tinham uma concordância virtualmente similar com o LDL-Cd, enquanto ambas as equações tinham uma concordância significativamente melhor em comparação com a LDL-Cf (p<0,001 para ambos). Nos gráficos Bland-Altman, o número de casos que ultrapassaram os limites de concordância superior e inferior foi de 12 (2,98%) para LDL-Cmh, 15 (3,73%) para LDL-Cs, e 16 (3,98%) para LDL-Cf ( Figura 2 ).

Figura 1

Gráficos de dispersão demonstrando a correlação de concentrações de colesterol LDL direto e concentrações de colesterol LDL calculado com (A) equação de Martin/Hopkins, (B) equação de Sampson e (C) equação de Friedewald. Os gráficos foram codificados por cores para refletir as concentrações de colesterol LDL em concentrações de triglicérides diferentes.

Tabela 2

Concordância entre concentração de colesterol LDL direto e concentração de colesterol LDL calculado

Método	Alfa de Cronbach				ICC
	alfa	p (vs. Martin)	p (vs. Sampson)	p (vs. Friedewald)	Coeficiente	IC 95%
Martin/Hopkins	0,955	-	1	<0,001	0,912	0,893 - 0,928
Sampson	0,955	1	-	<0,001	0,905	0,870 - 0,929
Friedewald	0,943	<0,001	<0,001	-	0,867	0,754 - 0,918

IC: Intervalo de confiança; ICC: Coeficiente de correlação intraclasse.

Figura 2

Gráficos de Bland-Altman demonstrando a concordância de concentrações de colesterol LDL direto e concentrações de colesterol LDL calculado com (A) equação de Martin/Hopkins, (B) equação de Sampson e (C) equação de Friedewald. As áreas coloridas nas partes superiores e inferiores dos gráficos mostram intervalos de confiança de 95% dos limites de concordância superiores e inferiores.

Concordância e reclassificação

Dados sobre a concordância com o LDL-Cd por “estar dentro da meta de LDL-C”, bem como os índices de reclassificação, foram apresentados na Tabela 3 . A concordância foi semelhante para LDL-Cmh e LDL-Cs, e 3,7% e 3,9% dos casos podem ser reclassificados com o LDL-Cd, respectivamente. Os índices de reclassificação foram mais baixos com ambas as equações, quando comparados à LDL-Cf, já que o LDL-Cd reclassificou 5,5% dos casos que foram identificados dentro ou fora da meta de LDL-C pela LDL-Cf.

Tabela 3

Concordância entre o método de colesterol LDL direto e outros métodos para se alcançar as metas de colesterol LDL recomendadas por diretrizes

Método	Concordância	Subestimação	Superestimação	Kappa	p-valor
Martin/Hopkins	387 (96,3%)	12 (3,0%)	3 (0,7%)	0,774	<0,001
Sampson	386 (96,0%)	14 (3,4%)	2 (0,5%)	0,768	<0,001
Friedewald	380 (94,6%)	20 (5,0%)	2 (0,5%)	0,703	<0,001

Concordância significa que ambos os métodos concordam se um paciente estava dentro ou fora da meta de colesterol LDL. Subestimação significa que o método em questão classificou casos como dentro da meta de colesterol LDL especificada, embora esses casos não atingissem a meta de colesterol LDL por métodos de colesterol LDL diretos. Superestimação significa que o método em questão classificou casos como fora da meta de colesterol LDL especificada, enquanto o método de colesterol LDL direto sugeria o contrário.

Concordância e reclassificação por faixa de TG

Em pacientes com TG <400 mg/dl; todas as três equações tiveram boa concordância com o LDL-Cd, mas a concordância foi ligeiramente melhor com a LDL-Cmh e a LDL-Cs se comparada à LDL-Cf ( Tabelas suplementares 1 e 2 ). A concordância foi razoavelmente melhor com a LDL-Cmh em pacientes dentro da faixa TG <150 mg/dl e com a LDL-Cs em pacientes com TG 150-400 mg/dl, mas as diferenças foram pequenas. Os índices de reclassificação também foram similares, embora a concordância com o LDL-Cd seja razoavelmente melhor com a LDL-Cmh do que com a LDL-Cs em pacientes com TG 150-400 mg/dl. É importante notar que o índice de reclassificação foi similar com a LDL-Cf quando comparado às novas equações nos pacientes com TG <150 mg/dl, mas não nos pacientes com TG >150 mg/dl.

A concordância entre LDL-Cd e equações novas foi ruim nos pacientes com concentração de TG acima de 400 mg/dl. A concordância por “estar dentro da meta” foi razoavelmente melhor para a LDL-Cs em comparação com a LDL-Cmh, embora a diferença fosse bastante trivial ( Tabela suplementar 2 ).

Pacientes em tratamento anticolesterolêmico

Assim como em toda a coorte do estudo, os desempenhos da LDL-Cmh e da LDL-Cs foram semelhantes no subgrupo de pacientes em uso de medicamentos anticolesterolêmicos. É importante observar que ambas as equações tiveram uma concordância pequena, mas significativamente melhor, com o LDL-Cd, em comparação com a LDL-Cf, e os índices de reclassificação foram razoavelmente mais baixos quando a LDL-Cmh ou a LDL-Cs foram usadas em vez da LDL-Cf ( Tabelas suplementares 3 e 4 ).

Pacientes com LDL-C <70 mg/dl

No presente estudo, 20 pacientes (4,9%) tinham um LDL-Cd <70 mg/dl, enquanto 33 (8,2%), 28 (7,0%) e 44 (10,9%) tinham LDL-C <70 mg/dl quando as equações de Sampson, Martin/Hopkins e Friedewald foram usadas. O número de pacientes classificados incorretamente como tendo LDL-C foi 15 (3,7%), 12 (3,0%) e 26 (6,4%) quando foram usadas LDL-Cs, LDL-Cmh e LDL-Cf, respectivamente. A Tabela suplementar 5 resume os índices de reclassificação com LDL-Cd para pacientes com um LDL-C calculado abaixo de 70 mg/dl. Os índices de reclassificação foram comparáveis para LDL-Cmh e LDL-Cs, mas proporcionalmente mais pacientes com LDL-Cf <70 mg/dl puderam ser reclassificados com LDL-Cd em comparação a pacientes com LDL-Cmh ou LDL-Cs <70 mg/dl.

Discussão

No presente estudo, as concentrações de LDL-C calculadas foram comparadas ao LDL-Cd em pacientes diabéticos, com o foco específico na comparação de LDL-CMH e LDL-Cs, para se entender qual nova equação seria a mais útil clinicamente. Os principais aprendizados do presente estudo foram: i) LDL-CMH e LDL-Cs tinham uma relação forte e boa concordância com LDL-Cd, e não há grandes diferenças entre as equações em termos de reclassificação; ii) ambas as equações foram melhores que a LDL-Cf, especialmente em pacientes com TG>150 mg/dl, mas os benefícios de se usar qualquer uma das equações foram muito pequenos; iii) a LDL-Cmh teve uma concordância quase excelente com o LDL-Cd nos pacientes com uma concentração de TG entre 150-400 mg/dl, sendo que apenas 1,5% dos pacientes foram classificados erroneamente quando a LDL-Cmh era usada; iv) todas as equações tiveram um desempenho ruim quando as concentrações de TG ultrapassavam 400 mg/dl, sendo que menos de 90% dos pacientes puderam ser classificados corretamente, mesmo com a equação de melhor desempenho, a LDL-Cs; e v) a concordância entre LDL-Cd e LDL-C calculado foi ruim em pacientes com um LDL-C calculado abaixo de 70 mg/dl, sendo que mais de um quarto dos pacientes foi reclassificado como LDL-Cd, independentemente da equação usada. Ainda assim, nesse último subgrupo, a LDL-Cs e a LDL-Cmh tiverem um desempenho melhor que a LDL-Cf.

Com a possível exceção dos pacientes mais jovens com curta exposição a hiperglicemia, pacientes diabéticos têm alto risco de infarto do miocárdio e mortalidade coronária. Como a dislipidemia também é comum nesses pacientes, várias linhas de evidência sugerem que pacientes diabéticos se beneficiam de uma intensa redução de LDL-C com modificações no estilo de vida e o uso de medicamentos anti-hipercolesterolêmicos. Entretanto, o cálculo preciso do LDL-C é mais problemático em pacientes diabéticos considerando que níveis elevados de TG são comuns em diabéticos, e altas concentrações de TG levam à estimativa imprecisa do LDL-C. Isso é especialmente verdade para os cálculos feitos com a equação de Friedewald, que dá estimativas inadequadas de LDL-C quando as concentrações de TG estão acima de 150 mg/dl. As equações de Martin/Hopkins propiciam estimativas mais robustas de LDL-C e são menos sensíveis a mudanças em TG, desde que as concentrações de TG fiquem abaixo de 400 mg/dl. Mais recentemente, Sampson e colegas definiram uma nova equação, e seus achados iniciais sugerem que essa equação produz estimativas corretas de LDL-C desde que as concentrações de TG fiquem abaixo de 800 mg/dl. . Entretanto, ainda não havia certeza sobre até que ponto esses achados iniciais se aplicavam a pacientes diabéticos, ou se essas novas equações poderiam ter algum impacto no tratamento de pacientes. Um estudo recente que incluiu 1828 pacientes japoneses com diabetes detectou que as equações de Martin/Hopkins têm uma concordância melhor com o LDL-Cd e em comparação com a LDL-Cf, especialmente se os níveis de TG forem superiores a 150 mg/dl. Entretanto, esse estudo usou diretrizes japonesas para determinar se os pacientes estavam dentro das metas recomendadas por diretrizes, e, como as diretrizes japonesas não são amplamente usadas fora do Japão, a aplicabilidade de seus resultados para outras populações é incerta. Embora nossos resultados confirmem amplamente esse trabalho anterior, achados atuais também indicam que a concordância entre o LDL-C calculado e o LDL-Cd é superior a 90%, independentemente da equação usada, e, portanto, os benefícios clínicos do uso das novas equações de Martin/Hopkins ou Sampson, em vez da de Friedewald, são muito menos aparentes do que a hipótese inicial. Com isso em mente, considerando que ambas as equações permitem a classificação correta de uma proporção de casos significativamente mais alta praticamente sem custos adicionais (talvez com a exceção de incorporar equações mais complexas aos sistemas de automação existentes), o uso de qualquer uma das equações poderia ser recomendável em pacientes diabéticos.

Como as equações de Martin/Hopkins e de Sampson foram definidas nos últimos dez anos, estudos com comparações diretas dessas equações entre si ainda são raros. Dois estudos que compararam as equações de Martin/Hopkins e de Sampson à equação de Friedewald identificaram que sua capacidade de reclassificar casos era praticamente a mesma. Entretanto, esses estudos não compararam a precisão dessas equações em relação a um método de referência. Mais recentemente, Cwiklinska et al., associados usaram tanto β-quantificação e um ensaio de LDL direto para comparar as equações de Martin/Hopkins e Sampson, e eles relataram que ambos os métodos eram mais precisos que a equação de Friedewald. Embora esse estudo não tenha oferecido uma comparação direta entre as duas novas equações, seus números indicam que o número de casos acima da meta de total de erros de 12% foi menor com a equação de Martin/Hopkins (134 vs. 157 casos). No entanto, esse estudo não relatou a possível importância clínica desses achados, e estes não foram específicos para pacientes com diabetes. Nossos resultados indicam que ambas as equações apresentaram uma concordância muito similar ao LDL-Cd e a tomada de decisão clínica deve ser semelhante na grande maioria dos pacientes, independentemente de que equação foi usada. Tendo dito isso, no subgrupo de pacientes com TG 150-400 mg/dl, a LDL-Cmh tinha uma concordância quase perfeita com o LDL-Cd em relação a estar “dentro da meta de LDL-C”, fazendo com que ela seja preferível para pacientes diabéticos nessa faixa de TG.

A estimativa do LDL-C se torna ainda mais difícil quando as concentrações de TG são superiores a 400 mg/dl, não apenas porque concentrações de lipoproteína de densidade muito baixa são subestimadas, mas também porque o LDL-C é suprimido aumentando-se os TG além desse ponto. Nem a equação de Friedewald, nem a de Martin/Hopkins apresentaram uma estimativa confiável de LDL-C acima do valor de corte. A equação de Sampson permitiu uma estimativa melhor do LDL-C para pacientes com hipertrigliceridemia com concentrações de TG de até 800 mg/dl, e, no estudo original, o índice de classificação indevida foi comparável ao da equação LDL-Cf para pacientes com TG <400 mg/dl. Uma nova equação promissora, que não foi incluída nesta análise, também foi apresentada recentemente para pacientes com doença renal crônica, nos quais a hipertrigliceridemia também é comum. Esta última equação parece ser tão precisa quanto a LDL-Cmh nesse subconjunto de pacientes, mas não foi validada para outros pacientes além dos portadores de doença renal. Na verdade, achados atuais não sugeriam a superioridade de uma equação nova em relação a outra. Nossos resultados indicaram que, apesar de a LDL-Cs ter a melhor concordância com o LDL-Cd, os índices de classificação indevida não eram aceitáveis, já que mais de 10% dos casos foram classificados indevidamente, independentemente da equação usada. Realmente, apenas um paciente adicional pode ser classificado corretamente quando a LDL-Cs foi usada em vez da LDL-Cmh ( Tabela suplementar 2 ). Portanto, o uso do LDL-Cd ou de um método alternativo como o colesterol não HDL-C ou concentrações de apolipoproteína b devem ser preferíveis em relação ao LDL-Cd estimado nesses pacientes, até que uma equação mais confiável esteja disponível.

Por último, sugere-se que a LDL-Cf tenha um desempenho ruim em pacientes com LDL-C <70 mg/dl devido a seus “fatores fixos”, e isso pode ser melhorado com as novas equações. Nossos achados indicam que a LDL-Cf classifica indevidamente até um terço dos pacientes diabéticos com um valor de LDL-Cf inferior a 70 mg/dl e esse número pode ser reduzido com o uso de novas equações, porém até um quarto desses pacientes ainda é classificado indevidamente como estando dentro das metas de tratamento mesmo com essas equações, sem diferenças importantes entre a LDL-Cs e a LDL-Cmh. Embora essa constatação corrobore o uso de novas equações em vez da LDL-Cf nesse subgrupo, ela, no entanto, sugere que nenhuma das equações disponíveis tem a confiabilidade adequada para pacientes diabéticos com LDL-C inferior a 70 mg/dl.

Limitações do estudo

Ensaios enzimáticos diretos de LDL-C foram criticados por sua falta de confiabilidade e padronização, e a β-quantificação continua a ser o método padrão ouro para se quantificar o LDL-C . Entretanto, ensaios de última geração são muito mais confiáveis são endossados por diretrizes internacionais relevantes e testes enzimáticos de LDL-C já funcionaram como método de referência em vários estudos. A β-quantificação é muito trabalhosa para ser usada na prática de rotina, e mesmo a β-quantificação do LDL-C não está livre de erros, já que pode incluir colesterol de outras lipoproteínas. . A população do estudo era bem pequena (402 casos) e o número de casos com TG >400 mg/dl era de apenas 24, uma condição que pode ter afetado a confiabilidade da análise do subgrupo nessa faixa.

Conclusões

Nos pacientes diabéticos, as equações de Martin/Hopkins e Sampson têm confiabilidade semelhante para a estimativa de LDL-C, sem vantagens óbvias de preferência de uma equação em relação à outra. Entretanto, ambas as equações foram superiores à equação de Friedewald em termos de concordância com o LDL-Cd e ambas tiveram índices de reclassificação mais baixos em comparação à LDL-Cf, especialmente em pacientes com TG>150 mg/dl. Como a diferença entre as duas equações foi trivial, qualquer uma das equações poderia ser preferida em relação à equação de Friedewald em pacientes diabéticos. No pequeno subgrupo de pacientes com concentração de TG acima de 400 mg/dl, nenhuma das equações teve precisão adequada, e, portanto, deve-se considerar a medição direta de LDL-C para esses pacientes.

* Material suplementar

Para informação adicional, por favor, clique aqui

Introduction

There is a well-known relationship between low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) and atherosclerotic coronary artery disease (CAD). Patients with diabetes are not only more likely to have CAD but are also more prone to dyslipidemias, including elevated triglycerides (TG), low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C), and increased concentrations of small, dense LDL-C particles. There is strong evidence suggesting improved cardiovascular outcomes with cholesterol-lowering treatment in Diabetes Mellitus (DM) patients with dyslipidemias, and although the relationship between LDL-C and CAD is less certain in patients with DM, available international guidelines recommend using LDL-C as the primary target for management decisions. Thus, accurate measurement of LDL-C is of paramount importance in patients with DM.

The gold standard for measuring LDL-C is β-quantification, but this technique is technically demanding and resource-intensive, so it is not routinely employed in practice. While direct LDL-C (LDL-Cd) assays are now commercially available, these are not widely adopted, and many laboratories still report calculated LDL-C concentrations instead. Friedewald equation (LDL-Cf), which is the most common method employed in practice, is unreliable when triglyceride concentration exceeds 150 mg/dl and LDL-C is below 70 mg/dl. This is a particular concern for patients with DM, as hypertriglyceridemia is a common component of diabetic dyslipidemia. Recently, Martin/Hopkins (LDL-Cmh) and Sampson (LDL-Cs) equations were developed to provide a better estimate of LDL-C concentration, especially when TG is elevated. However, few studies have provided a head-to-head comparison of these two equations, and there are no data in patients with DM.

The present study aimed to compare LDL-Cmh, LDL-Cs, and LDL-Cf equations with LDL-Cd to understand which equation had a better agreement with LDL-Cd in diabetic patients and to what degree these novel equations could change clinical decision-making as compared to LDL-Cf.

Materials and Methods

Patient selection

For the present investigation, cardiology outpatient records were reviewed retrospectively for the years 2019 and 2020. Patients who were 18 years of age or older and had diabetes at the time of admission were included in the study. Patients with incomplete records were excluded. No other inclusion or exclusion criteria were used. Diabetes was defined as having one of the following: i) being on antidiabetic treatment with a previous diagnosis of diabetes or ii) a hemoglobin A1c% concentration equal to or greater than 6.5%. Patients’ demographic, clinical, and laboratory data were retrospectively collected from an institutional electronic database. Glomerular filtration rate was calculated using Modified Diet in Renal Disease – Glomerular Filtration Rate equation, and patients with a glomerular filtration rate <60 ml/min/1.73 m2were accepted as having chronic renal disease. Patients were classified into intermediate, high, and very-high cardiovascular risk according to the 2019 European guidelines on the management of dyslipidemias. LDL-C targets for each individual patient were determined using the same guidelines. The study was conducted according to the principles of the 1975 Declaration of Helsinki and its subsequent revisions, and ethical approval was obtained from a local ethics committee.

Measurement of direct LDL-C and calculation of estimated LDL-C

Blood samples were collected using standard methods, and samples were sent to the laboratory within 30 minutes after collection. LDL-Cd was measured by a colorimetric method using the Abbott Architect Plus ci8200 integrated analysis system (Abbott Labs, Chicago, IL, USA) and Archem LDL-Cd test reagents (Archem Health Ind, Turkey).

Other blood chemistry analyses, including lipid parameters, were carried out using standard methods, and the same blood sample was used for all analyses. LDL-Cf was calculated as:

as previously described. To calculate LDL-Cs, the second equation reported in the work of Sampson et al. was used, which is as follows:

LDL-Cmh needs different VLDL: TG “factors” for calculation and a single mathematical equation could not be used to derive LDL-Cmh. Instead, LDL-Cmh was calculated using spreadsheets provided by a supported and maintained website by Johns Hopkins University School of Medicine.

Statistical analyses

Continuous variables were given as mean ± standard deviation, while categorical variables were presented as percentages. For continuous variables, distribution patterns were analyzed with the Shapiro-Wilk test and visual inspection of the histograms. Correlation analyses were conducted by applying the Pearson test, and correlation coefficients were provided to give an overall measure of strength of relationship between different methods. Bland-Altman plots were drawn to visually assess the agreement between LDL-Cd and calculated LDL-C concentrations. Similarly, Cronbach’s alpha and intraclass correlation coefficients were calculated for a quantitative assessment of the agreement. Cronbach’s alpha values were compared using Feldt’s method. Correct classification for being within the guideline-recommended LDL-C target, as well as reclassification rates relative to LDL-Cd was given as percentages. Kappa coefficients for the agreement were calculated for each pair. Patients were stratified per TG concentrations (TG<150 mg/dl, TG 150-400 mg/dl, and TG>400 mg/dl) and separate subgroup analyses were done for each stratum. Finally, patients on anticholesterolemic medications were analyzed to understand the agreement between LDL-Cd and calculated LDL-C concentrations in terms of reaching the target LDL-C concentration. A p-value <0.05 was accepted as statistically significant for all comparisons. Statistical analyses were performed with Jamovi (The jamovi project (2020). Jamovi (Version 1.2) for Windows, retrieved from (https://www.jamovi.org) and SPSS 25.0 (IBM Corp, Armonk, NY, USA) statistical packages.

Results

The demographic and clinical characteristics of the study group were presented in Table 1 . More than four-fifths of the study cohort had either high or very high risk, while only a quarter of the patients were on at least one anticholesterolemic drug. Mean LDL-C calculated with all three equations were lower than LDL-Cd, while the largest difference was between LDL-Cd and LDL-Cf.

Table 1

Demographic. clinical. and laboratory characteristics of the study sample

Characteristic	Value
Age (years)	56 ± 13
Gender (female)	189 (47.0%)
Body mass index (kg/m2)	29.4 ± 4.4
Systolic blood pressure (mmHg)	134.0 ± 17.5
Diastolic blood pressure (mmHg)	80.5 ± 10.1
Smoking (%)	118 (29.4%)
Coronary artery disease (%)	83 (20.6%)
Chronic kidney disease (%)	10 (2.7%)
Oral antidiabetic (%)	372 (92.5%)
Insulin (%)	58 (14.4%)
Antihypercholesterolemic drugs (%)	111 (27.6%)
Fasting glucose (mg/dl)	140.0 ± 54.1
Hemoglobin A1c (%) (n=336)	7.0 ± 1.7
Creatinine (mg/dl)	0.88 ± 0.24
GFR (ml/min/m2)	90.4 ± 38.1
Total cholesterol (mg/dl)	199.0 ± 45.3
Triglycerides (mg/dl)	163 (108 – 223)
HDL-cholesterol (mg/dl)	45.3 ± 10.6
Direct LDL-cholesterol (mg/dl)	125.0 ± 35.0
SCORE risk strata
Intermediate risk	75 (18.7%)
High risk	212 (52.7%)
Very high risk	115 (28.6%)
Martin/Hopkins LDL-cholesterol	120.0 ± 38.4
Sampson LDL-cholesterol	123.0 ± 38.1
Friedewald LDL-cholesterol	24.5 (7.6)

GFR: Glomerular Filtration Rate; HDL: High-density lipoprotein; LDL: low-density lipoprotein; OAD: Oral antidiabetic; SCORE: Systematic coronary risk evaluation.

Correlation and agreement between LDL-Cd and calculated LDL-C

All three equations presented a strong correlation with LDL-Cd, but LDL-Cf showed the lowest value (r=0.915) compared to LDL-Cmh (r=0.932) and LDL-Cs (r=0.929) ( Figure 1 ). Data on the agreement between LDL-Cd and calculated LDL-C concentrations were presented in Table 2 . LDL-Cmh and LDL-Cs had a virtually similar agreement with LDL-Cd, while both equations had a significantly better agreement compared to LDL-Cf (p<0.001 for both). On Bland-Altman plots, the number of cases that exceeded upper and lower limits of agreement was 12 (2.98%) for LDL-Cmh, 15 (3.73%) for LDL-Cs, and 16 (3.98%) for LDL-Cf ( Figure 2 ).

Figure 1

Scatter plots showing the correlation of direct LDL-cholesterol concentrations with LDL-cholesterol concentrations calculated with (A) Martin/Hopkins equation, (B) Sampson equation, and (C) Friedewald equation. Plots were color-coded to reflect LDL-cholesterol concentrations at different triglyceride concentrations.

Table 2

Agreement between direct LDL-cholesterol concentration and calculated LDL-cholesterol concentrations

Method	Cronbach’s alpha				ICC
	alpha	p (vs. Martin)	p (vs. Sampson)	p (vs. Friedewald)	Coefficient	95% CI
Martin/Hopkins	0.955	-	1	<0.001	0.912	0.893 - 0.928
Sampson	0.955	1	-	<0.001	0.905	0.870 - 0.929
Friedewald	0.943	<0.001	<0.001	-	0.867	0.754 - 0.918

CI: Confidence Interval; ICC: intraclass correlation coefficient.

Figure 2

Bland-Altman plots showing the agreement between direct LDL-cholesterol concentrations with LDL-choleserol concentrations calculated with (A) Martin/Hopkins equation, (B) Sampson equation, and (C) Friedewald equation. Colored regions at the upper and lower parts of the plots show 95% confidence intervals (CI) of upper and lower agreement limits.

Concordance and reclassification

Data on agreement with LDL-Cd for “being in LDL-C target”, as well as reclassification rates, were provided in Table 3 . Concordances were similar for LDL-Cmh and LDL-Cs, and 3.7% - 3.9% of cases can be reclassified with LDL-Cd, respectively. Reclassification rates were lower with both equations as compared to LDL-Cf, as LDL-Cd reclassified 5.5% of the cases that were proved to be within or out of LDL-C target with LDL-Cf.

Table 3

Agreement between direct LDL-cholesterol method and other methods for reaching guideline-recommended LDL-cholesterol target

Method	Concordance	Underestimation	Overestimation	Kappa	p-value
Martin/Hopkins	387 (96.3%)	12 (3.0%)	3 (0.7%)	0.774	<0.001
Sampson	386 (96.0%)	14 (3.4%)	2 (0.5%)	0.768	<0.001
Friedewald	380 (94.6%)	20 (5.0%)	2 (0.5%)	0.703	<0.001

Concordance means both methods agree whether a patient was within or out of the LDL-cholesterol target. Underestimation means that the method in question classified cases as within the specified LDL-cholesterol target, although these cases did not reach specific LDL-cholesterol target per direct LDL-cholesterol methods. Overestimation means that the method in question was classified as out of the specified LDL-cholesterol target while direct LDL-cholesterol method suggested otherwise.

Agreement and reclassification per TG strata

In patients with a TG <400 mg/dl, all three equations had a good agreement with LDL-Cd, but the agreement was slightly better with both LDL-Cmh and LDL-Cs as compared with LDL-Cf ( Supplementary Tables 1 and 2 ). The agreement was somewhat better with LDL-Cmh in patients within the TG <150 mg/dl strata and with LDL-Cs in patients with a TG 150-400 mg/dl, but the differences were minimal. Reclassification rates were also similar, although concordance with LDL-Cd was somewhat better with LDL-Cmh than LDL-Cs in patients with a TG 150-400 mg/dl. To note, the reclassification rate was similar with LDL-Cf when compared to novel equations in those with a TG <150 mg/dl, but not in those with a TG >150 mg/dl.

Concordance between LDL-Cd and novel equations was poor in those with a TG concentration above 400 mg/dl. Agreement for “being in target” was somewhat better for LDL-Cs as compared to LDL-Cmh, though the difference was rather trivial ( Supplementary Table 2 ).

Patients on anticholesterolemic treatment

Similar to the whole study cohort, the performance of LDL-Cmh and LDL-Cs were similar in the subgroup of patients on anticholesterolemic drugs. To note, both equations had a small but significantly better agreement with LDL-Cd as compared to LDL-Cf, and reclassification rates were somewhat lower when either LDL-Cmh or LDL-Cs were used instead of LDL-Cf ( Supplementary Tables 3 and 4 ).

Patients with an LDL-C <70 mg/dl

In the present study, 20 patients (4.9%) presented an LDL-Cd <70 mg/dl, while 33 (8.2%), 28 (7.0%), and 44 (10.9%) presented an LDL-C <70 mg/dl when Sampson, Martin/Hopkins, and Friedewald equations were used. The number of patients incorrectly classified as having an LDL-C were 15 (3.7%), 12 (3.0%), and 26 (6.4%) when LDL-Cs, LDL-Cmh, and LDL-Cf were used, respectively. Supplemental Table 5 summarizes reclassification rates with LDL-Cd for patients with a calculated LDL-C below 70 mg/dl. Reclassification rates were comparable for LDL-Cmh and LDL-Cs, but proportionally more patients with a LDL-Cf <70 mg/dl can be reclassified with LDL-Cd as compared to patients with LDL-Cmh or LDL-Cs <70 mg/dl.

Discussion

The present study compared calculated LDL-C concentrations with LDL-Cd in diabetic patients, with a particular focus on comparing LDL-Cmh and LDL-Cs to understand which novel equation would be the most clinically useful. The main takeaways from the present study are: i) both LDL-Cmh and LDL-Cs had a strong relationship and a good agreement with LDL-Cd, and there are no major differences between equations in terms of reclassification; ii) both equations were better than LDL-Cf - especially in patients with a TG>150 mg/dl; however, the benefits of using either equation were marginal; iii) LDL-Cmh had a near-excellent concordance with LDL-Cd in those with a TG concentration between 150-400 mg/dl, with only 1.5% of the patients being misclassified when LDL-Cmh was used, iv) all equations performed poorly when TG concentration exceeded 400 mg/dl, with less than 90% of the patients being classified correctly even with the best-performing LDL-Cs equation; and v) agreement between LDL-Cd and calculated LDL-C was poor in those with a calculated LDL-C below 70 mg/dl, with more than a quarter of the patients being reclassified with LDL-Cd, regardless of the equation used. Nevertheless, in this latter subgroup, LDL-Cs and LDL-Cmh performed better than LDL-Cf.

With the possible exception of younger patients with a short exposure to hyperglycemia, diabetic patients are at high risk for myocardial infarction and coronary mortality. As dyslipidemia is also common in these patients, multiple lines of evidence suggest that diabetic patients benefit from intensive LDL-C lowering with lifestyle modifications and antihypercholesterolemic drugs. However, an accurate calculation of LDL-C is more problematic in diabetic patients, given that elevated TGs are common in diabetic patients and high TG concentrations cause an inaccurate estimation of LDL-C. This is especially true for calculations done with the Friedewald equation, which gives inadequate LDL-C estimates when TG concentrations are above 150 mg/dl. Martin/Hopkins equations give more robust LDL-C estimates and are less sensitive to changes in TG, as long as TG concentrations are below 400 mg/dl. More recently, Sampson et al. defined a new equation, and their initial findings suggest that this equation gives correct LDL-C estimates as long as TG concentrations are below 800 mg/dl. However, to what extent were these initial findings applicable for diabetic patients, or whether these new equations could have any impact on patient management, were less certain. A recent study that included 1,828 Japanese patients with diabetes has found that Martin/Hopkins equations have a better agreement with LDL-Cd and as compared to LDL-Cf, especially when TG was above 150 mg/dl. However, this study used Japanese guidelines to determine whether patients were within guideline-recommended targets, and as Japanese guidelines were not widely used outside Japan, the applicability of their results for other populations was uncertain. While our results are largely confirmatory of this previous work, the present findings also indicate that the concordance between calculated LDL-C and LDL-Cd is above 90% regardless of the equation used; therefore, the clinical benefits of using novel Martin/Hopkins or Sampson equations over Friedewald equation is much less apparent than initially claimed. However, given that both equations allow correct classification of a significantly higher proportion of cases with virtually no additional costs (perhaps with the exception of incorporating more complex equations to the existing automation systems), using either equation could be advisable in diabetic patients.

Since both Martin/Hopkins and Sampson equations were defined in the last ten years, studies directly comparing these equations with each other are scarce. Two studies that compared Martin/Hopkins and Sampson equations with the Friedewald equation have found that their ability to reclassify cases was roughly similar. However, these studies did not compare the accuracy of these equations against a benchmark method. More recently, Cwiklinska et al. used both β-quantification and a direct LDL-assay to compare Martin/Hopkins and Sampson equations, and they reported that both methods were more accurate than the Friedewald equation. While this study did not provide a head-to-head comparison between two novel equations, their numbers indicate that the number of cases exceeding the total error goal of 12% was smaller with Martin/Hopkins equations (134 vs. 157 cases). Nonetheless, this study did not report the possible clinical importance of these findings, and their findings were not specific to patients with diabetes. Our results indicate that both equations had a very similar agreement with LDL-Cd and the clinical decision-making should be similar in the vast majority of patients regardless of which equation was used. Taking this into account, in the subgroup of patients with a TG 150-400 mg/dl, LDL-Cmh had a near-perfect agreement with LDL-Cd, thus making it preferable for diabetic patients in this TG strata.

Estimating LDL-C becomes even more difficult when TG concentrations exceed 400 mg/dl, not only because very-low-density lipoprotein concentrations are underestimated, but also because LDL-C is suppressed by increasing TGs beyond this point. Neither the Friedewald nor the Martin/Hopkins equations gave a reliable estimate of LDL-C beyond that cut-off value. The Sampson equation enabled a better estimation of LDL-C for patients with hypertriglyceridemia for TG concentrations up to 800 mg/dl, and in the original study, the misclassification rate was comparable to the misclassification rate of LDL-Cf equation for those with a TG <400 mg/dl. A promising new equation, which was not included in this analysis, was also recently introduced for patients with chronic kidney disease, in whom hypertriglyceridemia is also common. This latter equation appears to be as accurate as LDL-Cmh in this patient subset, but it was not validated beyond those with kidney disease. Indeed, present findings were not suggestive of the superiority of one novel equation to another. Our results have indicated that while LDL-Cs had the best agreement with LDL-Cd, misclassification rates were unacceptable, as more than 10% of the cases were misclassified regardless of the equation used. Indeed, only one extra patient could be correctly classified when LDL-Cs were used instead of LDL-Cmh ( Supplementary Table 2 ). Therefore, using LDL-Cd or an alternative method, such as non-HDL-C cholesterol or apolipoprotein B concentrations, should be preferred over estimated LDL-Cd in these patients, until a more reliable equation is available.

Finally, it has been suggested that LDL-Cf performs poorly in patients with an LDL-C <70 mg/dl due to its “fixed factor”, and this can be improved with novel equations. Our findings indicate that LDL-Cf misclassifies up to one-third of the diabetic patients with a LDL-Cf less than 70 mg/dl, and this figure can be lowered by applying novel equations, but up to one quarter of these patients are still misclassified as being within treatment targets even when using these equations, with no major difference between LDL-Cs and LDL-Cmh. Although this finding supports the use of novel equations rather than LDL-Cf in this subgroup, they nonetheless suggest that none of the available equations have adequate reliability for diabetic patients with an LDL-C below 70 mg/dl.

Study Limitations

Direct enzymatic LDL-C assays have been criticized for a lack of reliability and standardization, and β-quantification remains as the gold standard method for quantifying LDL-C. However, next-generation assays are much more reliable and are endorsed by relevant international guidelines, and enzymatic LDL-C assays have already served as the reference method in several studies. β-quantification is too labor intensive to be used in routine practice, and even β-quantification of LDL-C is not devoid of errors, as it can include cholesterol from other lipoproteins. The study population was rather small (402 cases), and the number of cases with a TG >400 mg/dl was only 24, a condition that might have affected the reliability of the subgroup analysis in this stratum.

Conclusions

In diabetic patients, Martin/Hopkins and Sampson’s equations have similar reliability to estimate LDL-C, with no obvious advantage of preferring one equation over another. However, both equations were superior to the Friedewald equation in terms of agreement with LDL-Cd, and both had lower reclassification rates when compared to LDL-Cf, especially in patients with TG>150 mg/dl. Since the difference between the two equations was trivial, either equation could be preferred over the Friedewald equation in diabetic patients. In the small subset of patients with a TG concentration above 400 mg/dl, none of the equations had adequate accuracy and as such, direct measurement of LDL-C should be considered in these patients.

* Supplemental Materials

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