[Performance of the Procleix SARS-CoV-2 transcriptase-mediated amplification (TMA) assay for the diagnosis of COVID-19 in nasopharyngeal sample pools. Small pilot study].

Estimador Editor:

Los procedimientos de RT-PCR para SARS-CoV-2 se basan en el uso de dianas que aportan información que varía en el grado de certeza según el número y tipo de genes investigados [1]. El gen N es muy sensible por lo que se ha postulado como “screening” de casos sospechosos [2]. Recientemente se han aplicado para el diagnóstico de COVID-19 técnicas de amplificación molecular isotérmica [3] como la amplificación mediada por transcriptasa (TMA). Este ensayo emplea las enzimas transcriptasa reversa y ARN polimerasa [4]. La técnica Procleix SARS-CoV-2 es una prueba de TMA, realizada mediante el equipo automatizado Panther, que puede ser utilizada como un método rápido de diagnóstico de COVID-19 [5]. Entre sus ventajas destacan la mínima manipulación y su elevada automatización. En condiciones de baja prevalencia de infección puede resultar coste-efectiva la estrategia de cribado el procesamiento por PCR agrupado de muestras clínicas (“pooling”) [6]. Esta aproximación, aunque también se ha probado con TMA, con buenos resultados, ha sido poco ensayada [7]. El propósito de este estudio fue valorar el ensayo de TMA Procleix SARS-CoV-2 (Grifols Diagnostic Solutions Inc. Emeryville, California, EE. UU) en mezclas de muestras nasofaríngeas para determinar su sensibilidad en el diagnóstico de COVID-19.

Se estudiaron 35 muestras previamente identificadas como positivas por TMA (gen N) mediante el ensayo Procleix SARS-CoV-2. Estas 35 muestras fueron mezcladas a partes iguales con muestras negativas, también estudiadas anterior-mente por TMA, en 35 “pools” de cuatro (140 muestras, las 35 TMA positivas y 105 TMA negativas), 35 “pools” de ocho (280 muestras, las 35 TMA positivas y 245 TMA negativas) y 35 “pools” de dieciséis (560 muestras, las 35 TMA positivas y 525 TMA negativas).

Las 35 muestras originales (sin diluir en mezclas) se procesaron también por RT-PCR usando la técnica Applied Biosystems TaqPath™ COVID-19 RT-PCR Kit de Thermo Fisher Scientific (Life Technologies Corporation, Pleasanton, California, EE. UU), que incluye como dianas los genes ORF1ab, S y N. En este estudio, se valoraron únicamente los resultados de detección del gen N (detectado tanto por TMA como por RT-PCR).

Al analizar las muestras sin diluir por RT-PCR, en 30 de las 35 muestras que habían aportado originalmente resultados TMA positivos se obtuvo un resultado positivo (sensibilidad de la RT-PCR referida a la TMA del 85,71%). Estas 30 muestras positivas por RT-PCR presentaban para el gen N un Ct que osciló entre 14,2 y 31,9. La distribución de resultados de las 35 muestras TMA positivas en relación con los resultados de RT-PCR se muestra en la tabla 1.

Tabla 1

Distribución de resultados de las 35 muestras originalmente TMA positivas en relación con los resultados de RT-PCR y con los obtenidos por TMA en mezclas de 4, 8 y 16

Grupos según el resultado de las muestras TMA positivas sin diluir	n	Sensibilidad (%)
Positivas por TMA diluidas 1/4 con otras 3 muestras TMA negativas	35/35	100
Positivas por TMA diluidas 1/8 con otras 7 muestras TMA negativas	35/35	100
Positivas por TMA diluidas 1/16 con otras 15 muestras TMA negativas	32a/35	91,43

Las 3 muestras negativas por TMA en la dilución 1/16 presentaban sin diluir un Ct >37 para el gen N.

Al re-procesar por TMA las 35 muestras originalmente positivas mezcladas cada una de ellas con tres muestras previamente confirmadas como negativas (pool de cuatro [dilución 1/4]) o mezcladas con siete muestras previamente confirmadas como negativas (pool de ocho [dilución 1/8]) en todos los casos se obtuvieron resultados positivos (sensibilidad 100%) (tabla 1). Cuando se re-procesaron por TMA cada una de las 35 muestras originalmente positivas mezcladas con quince muestras previamente confirmadas como negativas (pool de dieciséis [dilución 1/16] en 32 casos se observaron resultados positivos (sensibilidad 91,43%) (tabla 1). Las 3 muestras negativas por TMA en la dilución 1/16 presentaban sin diluir un Ct para el gen N mayor a 37 (es decir también fueron negativas por RT-PCR para esta diana).

Los test clásicos de RT-PCR duplican el número de copias del gen diana en cada uno de los 40 ciclos habituales de su proceso, mientras que la amplificación por TMA genera cientos a miles de copias de la secuencia que subsecuentemente actúan como moldes de transcripción [8]. La sensibilidad analí-tica en muestras clínicas del equipo Panther para el genoma de SARS-CoV-2 (de 5,5 × 10e3 copias por mililitro) es superior a la alcanzada por métodos de RT-PCR [8].

Es esperable que el uso masivo de las vacunas frente a SARS-CoV-2 reduzca en un futuro la incidencia de la infección. En este contexto, será conveniente establecer estrategias diagnósticas adaptadas a escenarios de carga de enfermedad variable [9]. En este estudio las muestras TMA positivas agrupadas con otras tres muestras TMA negativas o con otras siete muestras TMA negativas conservaron su positividad pese al correspondiente factor de dilución. Las tres muestras original-mente positivas por TMA, pero subsiguientemente negativas en dilución 1/16 habían sido negativas para el gen N por RTPCR, lo que sugiere que podrían corresponderse con muy bajas cargas víricas. Previamente se ha observado que señales de Ct en RT-PCR superiores a 35 pueden condicionar la aparición de resultados falsos negativos en mezclas de muestras estudiadas por TMA [10].

De acuerdo con los resultados de este estudio, y a pesar del reducido número de exudados nasofaríngeos positivos incluidos, el agrupamiento de muestras en mezclas de cuatro u ocho “pools” puede ser una alternativa para el cribado por TMA de casos de COVID-19 en momentos en los que la incidencia sea baja.