[Model systems in gastroenterological research : From animal models to human organoids to the clinic].

Over the last few decades, various models have been established within gastroenterological research that have significantly contributed to a better understanding of the (patho)physiological processes of various gastrointestinal (GI) diseases (inflammation, organ injuries, carcinomas). This review will focus on such models including genetically engineered mouse models (GEMMs), xenografts, and organoid-based culture systems. GEMMs laid the foundation for successful modeling of such diseases. These have the decisive advantage that diseases can be assessed in their physiological environment and thus allow the examination of cell-cell communications of various cell types (epithelium, fibroblast, immune cells). However, the discrepancy between the genetic background of mice and humans reflected a pivotal disadvantage that could at least partially be circumvented by transplanting human cells into immunocompromised host animals. The time-consuming and labor-intensive generation of such xenograft models, however, considerably limits their usefulness for timely preclinical drug screenings. Thus, novel organoid-based human cell culture systems from adult stem cells or pluripotent stem cells are a promising human tool for modeling GI diseases. The first results already show their usefulness in the regulation of adult tissue homeostasis, regeneration, and tumor development. In addition, this system can be easily established in clinical diagnostics and thus enables real-time ex vivo pharmacotyping to develop personalized therapy strategies, particularly for cancer patients.

Über die letzten Jahre haben sich verschiedene Modelle in der Forschung etabliert, die erheblich dazu beigetragen haben, die Pathogenese diverser gastrointestinaler (GI) Krankheiten (z. B. Entzündungen, Organverletzungen, Karzinome) besser zu verstehen. Diverse Mausmodelle legten dabei den Grundstein zur erfolgreichen Modellierung dieser Krankheiten. Neuartige organoidbasierte humane Zellkultursysteme sind jedoch bereits heute ein vielversprechendes Tool in der personalisierten Medizin und könnten zukunftsorientiert die Modellierung von GI-Erkrankungen in einem humanen System revolutionieren.

Gastrointestinale Krankheiten können in vielen Fällen immer noch einen unerwarteten Krankheitsverlauf haben und gehen in vielen Fällen (z. B. Karzinome) mit einer schlechten Prognose einher. GI-Krankheiten (z. B. Infektionen, Entzündungen, Organverletzungen, Karzinome), die mit einem heterogenen Krankheitsbild verbunden sind, zeichnen sich durch eine komplexe Pathophysiologie (z. B. Dysplasie, Fibrose) aus, die durch verschiedene genetische und molekulare Veränderungen stark beeinflusst werden. Darüber hinaus sind diese Erkrankungen geprägt von einem temporären bzw. stadiumabhängigen Zusammenspiel zwischen unterschiedlichen Zelltypen (z. B. Epithel, Fibroblasten, Immunzellen). Diese Faktoren wirken sich erheblich auf die Behandlung der Krankheit und damit den Ausgang aus.

Die gastrointestinale Forschung hat von der Verfügbarkeit verschiedener Mausmodelle (genetisch veränderte Mausmodelle [GVMMs], Xenografts) und neuerdings ex-vivo-organoid-basierten Kultursystemen in den letzten Jahren enorm profitiert (Abb. 1). Die Einbindung solcher verschiedener Modelsysteme und der technologische Fortschritt (z. B. Transkriptom, Proteom) ermöglichten es, die räumlichen und zeitlichen Veränderungen (z. B. Dysplasie und Fibrose) während der Entwicklung und des Verlaufs verschiedener GI-Erkrankungen in einem genotypspezifischen Kontext zu analysieren. Darüber hinaus können diese Tools als zuverlässige Vorhersagemodelle genutzt werden, um potenziell wirksame Medikamente mit tolerierbarer Toxizität für bestimmte GI-Erkrankungen wie Tumorerkrankungen zu finden und so die schlechte Prognose von Patienten zu verbessern.

Genetisch veränderte Mausmodelle in der GI-Forschung

GVMMs ermöglichen es den Einfluss individueller Gene zum einen auf die embryonale Entwicklung [25, 35] und zum anderen auf Krankheitsverläufe (z. B. Entzündungen, Organverletzungen, Tumorentwicklung) zu untersuchen. Verschiedene Mausmodelle [7], nämlich (i) konstitutive oder konventionelle Knockout-Mäuse, (ii) gewebespezifische und/oder zeitlich abhängige konditionale Knockout- und Knockin-Mäuse haben sich hierbei in den letzten Jahrzehnten in der GI-Forschung etabliert (Abb. 1). So konnte zum Beispiel durch die Verwendung eines konstitutiven Knockouts in Kombination mit experimentell induziertem Leberversagen (Tetrachlormethan) oder einer Pankreatitis (Caerulein) gezeigt werden, dass Dickkopf 3, ein Regulator des Wnt-Signalwegs, die Regeneration stark einschränkt und somit potenziell als neuartige Therapie bei GI-Organverletzungen genutzt werden könnte [2].

Die Entwicklung von GI-Karzinomen (z. B. kolorektales Karzinom, Pankreaskarzinom) ist unter anderem durch Mutationen in verschiedenen Onkogenen und Tumorsuppressorgenen verursacht. Knockin- und Knockout-Mäuse ermöglichen einen gewebespezifischen Einbau onkogener Treibermutationen bzw. das Entfernen von Tumorsuppressorgenen, wodurch gezielt die Entwicklung bestimmter GI-Karzinome mit ähnlicher Pathogenese wie im Menschen erlangt werden kann. Zum Beispiel widerspiegeln GVMMs des kolorektalen Karzinoms die Pathogenese von sporadischem sowie vererbten kolorektalem Karzinom. Jedoch hat sich hier herausgestellt, dass es bei diesen Mausmodellen, im Gegensatz zum humanen Tumor, an Invasivität, Metastasierung und Tumorheterogenität fehlte. Dennoch zeigten die GVMMs des kolorektalen Karzinoms einen Nutzen für die Untersuchung der Tumormikroumgebung sowie für systemische Immunantworten und unterstützten so die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze [5].

Die pankreasspezifische (PTF1a-Cre, PDX1-Cre) LSL-KrasG12D-Knock-in-Maus (KC-Modell) dahingegen war die erste genetisch veränderte Maus, die die erwartete Progression von pankreatischen intraepithelialen Neoplasien (PanIN) zu metastatischen Tumoren im Pankreas zeigte. Hierbei war die Tumorentwicklung mit den gleichen Signalwegen verbunden, die auch bei einem humanen Pankreaskarzinom beobachtet worden waren [13]. In einer erst kürzlich veröffentlichten Studie konnte mit dem KC-Modell gezeigt werden, dass die Grundlage der Tumorentwicklung durch die Dosierung von mutiertem Kras innerhalb von Vorläuferläsionen (PanINs) gegeben ist, was sowohl den Grad der Karzinogenese als auch die Metastasierung im späteren Stadium definiert [22]. Das KC-Modell zeigt jedoch eine relative lange Latenzzeit und nur einen relativ geringen Grad an Metastasierung auf, wodurch es sich zwar ideal eignet, um die einzelnen Stadien der Tumorentwicklung zu untersuchen, aber nicht vollständig dem humanen PDAC gleichkommt. Die zusätzliche Inaktivierung des Tumorsuppressorgens Trp53 (Trp-Mutation, KPC-Modell) [7, 14] führte hierbei zu einem Phänotyp mit beschleunigtem Tumorfortschreiten, vermehrter Metastasierung und deutlich verkürztem Gesamtüberleben; und kommt daher der Tumorbiologie eines humanen PDAC deutlich näher. Darüber hinaus zeigt das KPC-Mausmodell eine ähnliche Tumormikroumgebung wie das humane PDAC einschließlich verschiedener tumorassoziierte Fibroblasten (myCAF, iCAF, apCAF) [8] und dem Immunzellprofil [30] und eignet sich daher ideal, um den Einfluss und das Zusammenspiel zwischen Tumor und Stroma zu untersuchen. Durch die Verwendung von zelltypspezifischen (azinar: Ptf1a bzw. duktal: Sox9) zeitlich-induzierbaren Cre-Rekombinasen mit Tamoxifen konnte zudem der Einfluss der kontrovers diskutierten Ursprungszelle auf die Entwicklung des PDACs im KPC-Modell untersucht werden. Lee und Kollegen zeigten hierbei, dass die Tumorentwicklung deutlich schneller und mit hochgradigen PanIN-Läsionen in Mäusen mit duktalem Ursprung verbunden war. Im Gegensatz dazu wiesen PDACs mit azinärem Ursprung eine normale Dysplasie mit sowohl niedrig- als auch hochgradigen PanINs mit verzögerter Progression zu PDAC auf [21]. Da das KPC-Modell ein eigenständiges, immunkompetentes Modell darstellt, konnte es zudem erfolgreich zur präklinischen Bewertung von Inhibitoren, Immuntherapien und zur Verbesserung verschiedener Chemotherapien verwendet werden [34].

Neben den bereits erwähnten KC- und KPC-Modellen haben sich mehr als 30 verschiedene GVMMs etabliert, die die am häufigsten gefundenen Mutationen in Pankreaskarzinom abdecken (z. B. SMAD4, CDKN2A) [34]. Diese dienten zur Untersuchung der Tumorentwicklung, Metastasierung sowie die Beteiligung der Tumormikroumgebung an der Karzinogenese [34] und reflektieren zudem Eigenschaften diverser PDAC-Gruppen, wie z. B. dem humanen instabilen PDAC, das durch Mutationen in DNA-Reparaturgenen (z. B. ATM) charakterisiert ist [24, 26].

Xenografts als Modell zur Vorhersage des Therapieansprechens bei Karzinomen

Obwohl GVMMs besonders vorteilhaft sind, um die Rolle einzelner Mutationen im Krankheitsverlauf von GI-Tumoren zu verstehen, stellt die Notwendigkeit, alle Zellen eines Zelltyps auf die gleiche Weise zu modifizieren, eine entscheidende Einschränkung dar, da sie nicht die normale Heterogenität eines humanen Tumors widerspiegelt. Der Verlust der intratumoralen Heterogenität in GVMMs kann mit dem Xenograftmodell umgangen werden. Hierbei werden entweder Patientenzelllinien oder ganze Tumorfragmente von Patienten (PDX) in immungeschwächte Mäuse implantiert (Abb. 1). Die Verwendung von Patienten stammenden Zelllinien hat einen klaren Vorteil in der Fähigkeit, hunderte von Tieren aus derselben Zelllinie zu erzeugen. Dieses Modell eignet sich ideal, um den Einfluss einzelner Proteine auf das Tumorwachstum in seiner physiologischen Umgebung zu untersuchen [1]. Jedoch fehlt hierbei weiterhin die Heterogenität eines Patiententumors sowie die Wechselwirkungen mit den Zellen der Tumormikroumgebung des Ursprungsgewebes. Die Transplantation von ganzen Tumorfragmenten stellt ein besseres repräsentativeres Modell bereit, wodurch die eben erwähnten Nachteile teilweise überwunden werden können. Dementsprechend hat sich dies als leistungsfähiges Werkzeug in der Grundlagenforschung und translationalen Forschung erwiesen. PDX-Modelle bewahren biologische Merkmale des ursprünglichen Tumors sowie das komplexe Zusammenspiel mit der Tumormikroumgebung [9]. Dadurch kann das PDX-Modell gezielt als präklinisches Model genutzt werden. Zum einen ermöglichte dies, das Therapieansprechen neuartiger Behandlungsregime zu untersuchen [10]. Zum anderen konnte gezeigt werden, dass das Therapieansprechen in PDX-Modellen mit PDX-Tumor-erzeugten Organoiden [9] und Patienten mit gastrointestinalen Malignomen korrelierte [18].

Neuartigere PDX-Systeme verwenden außerdem humanisierte Wirtstiere mit menschlichem Immunsystem. Solch humanisierte Mäuse ermöglichen das komplexe Zusammenspiel verschiedener humaner Zelltypen, einschließlich immunologischer Aspekte, unterschiedlicher GI-Erkrankungen (z. B. Infektionen, Krebs) in einer physiologischen Umgebung zu analysieren und negieren die genetischen Unterschiede zwischen Menschen und GVMMs. Hierbei werden humane Zellen entweder aus peripherem Blut oder tumorinfiltrierenden Lymphozyten in immundefiziente Mäuse transplantiert. Dies geht allerdings mit einer erheblichen Graft-versus-Host-Abstoßung einher. Alternativ können humanisierte Mausmodelle durch Transplantation von CD34+ humanen hämatopoetischen Stammzellen (HSC) oder Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut generiert werden [33]. Die zeit- und arbeitsintensive Generierung von PDX-Mausmodellen schränkt jedoch deren Nützlichkeit gerade für ein zeitnahes präklinisches Screening mehrerer Medikamente entscheidend ein.

Organoide aus adultem Gewebe als zentraler Meilenstein in der GI-Forschung

Organoide sind in vitro miniaturisierte und vereinfachte Modellsysteme von Organen. Die Organoide stammen entweder aus geweberesidenten adulten Stammzellen (ASC) oder Tumorproben, die direkt aus Biopsieproben von Patienten gewonnen werden können. Solche Organoide gleichen stark dem In-vivo-Gewebe, was sie zu einem vielversprechenden Modellsystem für die Gewebehomöostase, Krankheitsmodellierung (z. B. Infektionen, Regeneration, Karzinome) und das Wirkstoffscreening macht (Abb. 1).

In 2009 konnte das Labor von Hans Clevers die ersten komplexen 3D-organisierten Strukturen von ASC aus intestinalem Gewebe herstellen, indem die Zellen in einer extrazellulären Matrix mit gewebeähnlicher Steifheit und essenziellem löslichem Nischenfaktor kultiviert worden waren [27]. Intestinale Organoide werden heutzutage zunehmend wegen ihrer Fähigkeit geschätzt, wichtige architektonische und physiologische Merkmale der nativen Darmschleimhaut nachahmen zu können. Aus diesem Grund sind intestinale Organoide das vielseitigste und natürlichste In-vitro-Modell des Darms, um sowohl biologische Prozesse, die für die Aufrechterhaltung der Gewebehomöostase wichtig sind, als auch die Immunantwort nach enteropathogenem Befall zu untersuchen [11].

Mittlerweile können aus einer Vielzahl an verschiedenen Organen wie Leber, Magen oder Pankreas Organoide hergestellt werden. Die Isolation von Organoiden aus Patienten mit GI-Erkrankungen (z. B. hereditären Erkrankungen, Karzinome) zeigte das enorme Potenzial dieses Tools im Bereich der personalisierten Medizin [23]. Die zystische Fibrose (ZF), eine hereditäre Erkrankung, die mit einer zähen Mukusbildung einhergeht, verursacht unter anderem Atemwegs- und Verdauungsprobleme und führt dadurch zu enormen Lebenseinschränkungen. Die Vielzahl an Genmutationen im verantwortlichen CFTR-Gen schränkt Behandlungserfolge zudem ein. Jedoch konnte mithilfe der Organoidtechnologie bei ZF-Patienten mit einem nicht charakterisierten seltenen CFTR-Genotyp ein Therapieansprechen auf die Behandlung mit Ivacaftor, einem CFTR-Potentiator, vorhergesagt werden [6]. Bei 97 % aller ZF-Patienten lassen sich allerdings nur die Symptomatik und nicht die Ursache behandeln, da hier nur eine Gentherapie helfen würde. Interessanterweise konnte der Gendefekt in intestinalen Organoiden von 2 Patienten mit ZF durch Genmodifikation mit dem CRISPR/Cas9-System zumindest in vitro korrigiert werden [28], was einen möglichen Durchbruch für die Behandlung von ZF erbringen könnte.

Darüber hinaus spiegeln Organoide von Tumorpatienten die Heterogenität und Pathologie des primären Tumors wider [3, 9]. Genom- sowie Transkriptomanalysen von patientenabstammenden Organoiden ermöglichten die Charakterisierung molekularer und funktioneller Subtypen von Bauchspeicheldrüsenkrebs, die letztendlich ein Ansprechen auf eine individualisierte Chemotherapie vorhersagen ließ [31]. Zudem konnte gezeigt werden, dass das In-vitro-Ansprechen von Organoiden auf Chemotherapeutika mit der klinischen Antwort bei Patienten mit Pankreaskarzinom, kolorektalem und gastroösophagealem Karzinom korrelierte [32]. Darüber hinaus haben sich Organoide als eine geeignete Methode zur Ex-vivo-Pharmakotypisierung in einem vernünftigen Zeitrahmen herausgestellt [3, 29] und sind daher PDX-Modellen deutlich überlegen.

Differenzierte Organoide aus pluripotenten Stammzellen zur Modellierung von GI-Krankheiten

Neben adulten Stammzellen können Organoide auch aus pluripotenten Stammzellen (PSCs) wie embryonalen Stammzellen (ESCs) oder induzierten PSCs (iPSCs) gewonnen werden (Abb. 1). Induzierte PSCs werden dabei durch die Reprogrammierung differenzierter Zelltypen (z. B. mit OCT3/4, KLF4, SOX2, c‑MYC) erhalten [19]. Initial waren Organoide, die aus menschlichen pluripotenten Stammzellen entwickelt wurden, besonders nützlich für die Herstellung von Geweben, bei denen die Zugänglichkeit zu adultem Gewebe erschwert ist, wie zum Beispiel Gehirn oder der Netzhaut [15]. Heutzutage profitiert auch die gastrointestinale Forschung von PSC-differenzierten organoidbasierten Kultursystemen. Gerade in der aktuellen COVID-19-Pandemie konnten humane intestinale Organoide aus PSCs wichtige Erkenntnisse über das Infektionsgeschehen aufdecken [12] und zeigten, dass SARS-CoV‑2 nur enteroendokrine Zellen und Paneth-Zellen, aber nicht Becherzellen infiziert [20]. Im Bereich von Pankreaserkrankungen konnten funktionelle azinäre und duktale pankreasähnliche Organoide (PDLOs) entwickelt werden [4, 16, 17]. Diese konnten erfolgreich zur Identifizierung neuer Biomarker für frühe Tumorstadien des Pankreaskarzinoms genutzt werden [36]. Darüber hinaus können durch Genveränderungen (z. B. Lentiviral, piggyBAC oder CRISPR/Cas9) hochindividuelle, patientenspezifische humane Organoidmodelle aus PSCs hergestellt werden [4, 17], die das Modellieren von GI-Krankheiten ermöglicht, was bis dahin nur in GVMMs realisiert werden konnte. [4, 36]. So konnte beispielsweise gezeigt werden, dass die Expression des onkogenen KRAS in azinären Organoiden eine azinäre-zu-duktale metaplasieähnliche Veränderung in vitro induzierte [17]. PDLOs mit mutiertem KRAS dahingegen zeigten ein reduziertes Wachstum einhergehend mit erhöhter epithelialer-zu-mesenchymaler Transition in vitro, was nach Transplantation in Mäuse zu differenzierten PDACs führte [4, 17]. Im Gegensatz dazu führen transplantierte PDLOs mit mutiertem GNAS zu intraduktalen, papillären, muzinösen, neoplasienähnlichen Strukturen [4]. Diese Ergebnisse reflektierten die bereits bekannten Erkenntnisse aus Mausmodellen und beweisen, dass humane Organoidsysteme als alternative Systeme auch zur Modellierung von GI-Erkrankungen genutzt werden können.

Ein noch immer limitierender Faktor dieser Organoide ist jedoch der fehlende Einfluss zellulärer Interaktionen mit unterschiedlichen Zelltypen (z. B. Epithel, Fibroblasten, Immunzellen). Diese zelluläre Kommunikation ist ein entscheidender Bestandteil der Pathogenese von GI-Erkrankungen. Der Bereich „Organs-on-a-Chip“ hat den Grundstein für die Entwicklung von solchen komplexeren Systemen in Kombination mit organoidbasierter Technologie gelegt. Synergistische Ansätze, die Organ-on-a-Chip-Setups und Organoide integrieren, zeigen (patho-)physiologische Ähnlichkeiten mit In-vivo-Systemen [15]. Beispielsweise konnte in in Mikrochips kultivierte PDLOs die metabolische Aktivierung von pankreatischen Sternzellen durch autokrine und parakrine Signale, welche infolge einer Inflammation, Verletzung oder Tumorentwicklung wesentlich zur Pathogenese von Pankreaserkrankungen beitragen, untersucht werden [36].

Obwohl es noch einige Hürden zu überwinden gibt, gerade in Bezug auf komplexere Kokultursysteme bestehend aus z. B. Organoiden, Fibroblasten und Immunzellen, hat die Organoidtechnologie bereits jetzt den Grundstein für die Modellierung von humanen GI-Krankheiten gelegt und entscheidend die personalisierte Medizin vorangetrieben, wovon bereits heute der Patient profitiert.

Fazit für die Praxis

Genetisch veränderte Mausmodelle (GVMMs) reflektieren (patho-)physiologisch humane GI-Erkrankungen und sind immer noch unerlässlich für die Untersuchung der Pathogenese von GI-Erkrankungen.

PDX-Modelle bewahren biologische Merkmale des ursprünglichen Tumors und eignen sich daher ideal als präklinisches Modell.

Humane Organoide isoliert aus adultem Gewebe (z. B. Tumorpatienten) sind einfach zu etablieren und eignen sich für die Krankheitsmodellierung (z. B. Infektionen, Regeneration, Karzinom) und das zeitnahe Medikamentenscreening für die personalisierte Medizin und sollten daher standardisiert in der Therapieplanung angedacht werden.

Organoide aus pluripotenten Stammzellen in Kombination mit Organs-on-a-Chip-Technologie könnten zukunftsorientiert die Modellierung von humanen gastrointestinalen Krankheiten erlauben.

Patienten profitieren bereits heute von der Organoidtechnologie durch individualisierte Verbesserung der Therapie sowie Identifizierung neuer Biomarker für die Früherkennung von gastrointestinalen Erkrankungen.