MicroRNAs: understanding their role in gene expression and cancer.

MicroRNAs are small RNA molecules that regulate gene expression in cells. These small molecules comprise 17 to 25 nucleotides and are able to recognize target messenger RNAs by sequence complementarity and regulate their protein translation. Different microRNAs are expressed in all human cells. There is over 2,500 microRNAs described in humans that are involved in virtually all biological processes. Given their role as gene expression regulators, these molecules have been widely investigated and are thought to be associated with some specific physiological and pathological conditions, being proposed as biomarkers. It has recently been reported that microRNAs are secreted outside cells and are involved in intercellular communication. MicroRNAs in biological fluids are named circulating and have been detected in all body fluids, although the expression profile is specific for each type. The major advantages of using circulating microRNAs as biological markers are the high stability of those molecules and the wide availability of samples. Also, given the individual nature of microRNA expression changes, these molecules have a high potential for use in personalized medicine. In fact, microRNA expression profile determination may support disease recognition and diagnosis, and can be used to monitor therapeutic responses and establish patient prognosis, assisting in choice of treatment. This review provides a general overview of microRNAs and discusses the importance of those molecules in cancer, for deeper understanding of their role in this disease.

INTRODUCTION

MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding ribonucleic acid (RNA) molecules that do not encode proteins. These molecules have drawn attention in the last few years due their role in gene expression regulation and involvement in diseases, such as cancer. The term cancer refers to a group of genetic diseases that may be caused by inactivation of tumor suppressor genes and/or activation of proto-oncogenes. Cell malignancy is associated with accumulation of deoxyribonucleic acid (DNA) mutations, which lead to gene expression dysregulation, resulting in biological and functional effects on cells. Epigenetic processes have also been incriminated in malignant tumor development. Among them miRNAs have gained visibility due to their relation with the acquisition of malignant characteristics during carcinogenesis.()

This review discusses the latest scientific data on miRNA generation and function, as well as their relations with cancer. Updated information about the role of these molecules is presented and their potential applicability in cancer treatment and monitoring is discussed.

MicroRNAS

MicroRNAs were first described in Caenorhabditis elegans in the 1990´s, and are thought to be vital for gene expression regulation in animal and plant cells.() These molecules comprise 17 to 25 nucleotides and regulate gene expression at the post-translational level, leading to changes in the pattern of protein translation via interactions with messenger RNAs (mRNAs).() The miRBase database ( www.mirbase.org ) lists more than 18 thousand different miRNAs in 168 species. Over 2,500 miRNAs have been identified in humans. However, the function of many of them has not been completely understood.() Variations in miRNA expression patterns are thought to be related to several biological and physiological processes and have been described in almost all diseases in humans.(,)

MicroRNA BIOGENESIS

MicroRNA generation is a complex process, which starts in the nucleus and ends in the cytoplasm. This process involves several enzymes and cell protein complexes, which regulate the pathway that leads to the production of mature and functional miRNAs ( Figure 1 ). At least three miRNA production pathways have been described, the canonical being the most widely investigated.()

Figure 1

Canonical microRNA biogenesis pathway. This pathway begins with nuclear transcription of microRNAs into molecules named pri-microRNAs. Pri-microRNAs are then processed by the nuclear enzyme Drosha to generate smaller molecules, the so-called pre-microRNAs. Pre-microRNAs are exported to the cytoplasm by exportin-5, then processed by the enzyme Dicer, giving rise to double-stranded microRNA molecules, which bind to RNA-induced silencing complex. The strands of bound microRNAs are then separated, originating to mature microRNAs, which are able to bind to messenger RNAs and inhibit their translation

The canonical pathway of biogenesis begins with DNA transcription, and the miRNAs may be encoded in intragenic (particularly intronic) or intergenic regions, both of the sense or antisense DNA strand. The transcription is often mediated by RNA polymerase II or RNA polymerase III.()

The first transcript (primary miRNA or pri-miRNA) has a hairpin structure. This structure has a base-paired stem that forms a double-stranded RNA region (dsRNA), protected by a capped (CAP) and a poly-A tail at the ends.() The primary miRNA is processed in the nucleus by an enzyme complex formed by RNase III Drosha and the protein Pasha or DGCR8 (DiGeorge Syndrome Critical Region 8), which binds to the double stranded RNA molecule, leading to uncapping and poly-A tail removal. This results in a double-stranded RNA molecule comprising approximately 70 nucleotides, the precursor miRNA (pre-miRNA), which is exported to the cytoplasm by exportin-5 and Ran-GTP binding proteins.() In the cytoplasm, the miRNA is further processed by the Dicer enzyme and the not base-paired loop of the molecule is removed, originating a double-stranded miRNA containing approximately 22 nucleotides. Alternatively, Argonaut 2 protein (Ago2) may be involved in pre-miRNA cleavage in the cytoplasm.() This double stranded miRNA is associated with a protein complex known as RNA-induced silencing complex (RISC), which is formed by several proteins. Ago proteins are among the most important factors in RISC, given their key role in the interaction with RNA molecules.() RNA-induced silencing complex leads to miRNA strand separation. One strand is often degraded, whereas the other, actually the mature miRNA, is exposed and may pair with the target mRNA.(,)

In the non-canonical pathway of miRNA biogenesis, pre-miRNA production takes place in the nucleus, starting from other molecules, such as shRNA (short hairpin RNA), miRtron or m7G-pre-miRN, and some subsequent steps may vary. Pre-miRNA generation from miRtron involves the spliceosome within the nucleus, whereas transportation of m7G-pre-miRN to the cytoplasm is exportin-1-dependent. Finally, the difference between canonical and non-canonical processing involving shRNAs, its due to the participation of Ago2 proteins instead of Dicer.(,)

MECHANISM OF ACTION OF MicroRNAs

MiRNA binds to target mRNAs through sequence complementarity, leading to changes in the translation pattern of mRNA proteins. Pairing may be total or partial and, apparently, the greater the sequence complementarity, the stronger and longer lasting the interaction. MiRNAs are thought to be important regulators of gene expression and act via dynamic mechanisms which are influenced by molecule localization and mechanisms of interaction with targets.()

The mechanism of action of miRNAs includes several steps, and involves several proteins.() MiRNAs bind to their targets primarily at untranslated region 3’ (UTR). Alternatively, miRNAs bind to other regions, such as 5’UTR, or even to promoter regions in the target mRNA. Binding site determines the biological consequences of these interactions. Most miRNAs inhibit gene expression by hindering target mRNA protein translation. However, the binding of a miRNA to the promoter region of a gene may have the opposite effect, that is, enhanced gene expression.()

Interactions between miRNAs and target mRNAs may lead to mRNA degradation through cleavage, mediated by an endonuclease in RISC, to which the miRNA is bound.() At first, total complementarity was thought to be required for this step, and only transient inhibition was thought possible in cases of partial complementarity. However, more recent studies have shown that, in animal cells, most miRNAs are only partially complementary to target mRNAs, which seems to be enough to permanently inhibit target mRNA translation.(,)

The small size of miRNAs and the tolerability to partial complementarity with its targets allows interactions with many mRNAs. The biological consequences of variations in a given miRNA may differ according to the cellular context. Hence, experimental verification is required, considering the cellular effects of miRNAs depend on target mRNA function. In the presence of sequence complementarity with target mRNAs with antagonistic functions, a single miRNA may have opposite biological effects in different cells. Therefore, to understand the role of different miRNAs, the profile of mRNAs transcripts in each cell type must be taken into account. Given the complexity of miRNA-mRNA interaction networks, bioinformatics modeling may be used for deeper understanding of this relation and recognition of additive or contradictory effects of different miRNAs.()

Also, each mRNA can be the target of more than one miRNA. To understand the effects of a given miRNA, interactions between the target mRNA and other miRNAs must be considered, since biological outcomes may reflect the sum of effects of several miRNAs expressed in the same cell.() Therefore, it can be argued that a given miRNA can regulate opposite processes in different cell types, such as increased cell proliferation and apoptosis rates. Nonetheless, similar levels of a specific miRNA may have different biological effects, since these depend upon targets and interactions with other molecules in a given cell type.

MicroRNAS IN CANCER

The role of miRNAs in cancer has been the object of investigations since the early 2000´s, when Calin et al.,() reported decreased expression of miR-15 and miR-16 in patients with chronic lymphoblastic leukemia. Ever since, important relations between the dysregulation of these molecules and carcinogenesis have been proposed, based on changes in expression of several miRNAs in tumor cells.(,) In theory, all tumors have some level of dysregulated miRNA expression. Recent data suggest more than half of miRNA codifying genes in humans are located in genomic regions that have been shown to be dysregulated in cancer.(,)

Cancer-related miRNAs can be classified according to target mRNA function as tumor suppressor or oncogenic miRNAs (oncomiRs). This segregation is based on the ability of miRNA molecules to interfere in carcinogenesis-related processes, including mechanisms associated with cell migration and invasion, apoptosis and proliferation. Given most miRNAs inhibit target mRNA expression, miRNA and target RNA may have opposite classifications. Tumor suppressor miRNAs regulate the expression of mRNAs required for cell division or survival, whereas oncomiRs are more strongly expressed in cancer cells and down-regulate tumor suppressor genes, leading to enhanced cancer cell division.()

Changes in miRNA expression patterns detected in cancer cells emphasize the significant role of miRNAs in cancer development and progression.() Variations in miRNA profile have been associated with processes driving cancer progression, metastasis formation and even cell death rates, and may be related to patient prognosis. Dysregulated miRNA expression in some malignant tumors that progress or metastasize justifies the investigation of these molecules as potential therapeutic targets in advanced cancer.() In addition, defining microRNA expression profile may be useful to identify and diagnose tumor subtypes, and to revise prognosis in oncologic patients.(,)

There has recently been an exponential growth in the number of studies investigating relations between miRNAs and cancer. Literature searches conducted at Pubmed® ( www.pubmed.ncbi.nih.gov ) and Scientific Electronic Library Online (Scielo) ( www.scielo.org ) showed increasing numbers of miRNA-related scientific investigations in the last 7 years ( Table 1 ).

Table 1

Number of articles investigating relations between microRNAs and cancer published in the last 7 years, according to keywords cited in the title or abstract

Database	Keywords	2013	2014	2015	2016	2017	2018	2019	Total
PubMed®	“miRNA” and “cancer”	1,387	1,680	1,988	1,980	2,123	2,454	2,737	14,349
	“microRNA” and “cancer”	1,579	1,976	2,361	2,402	2,775	2,949	3,222	17,264
	“circulating microRNA” and “cancer”	24	32	33	32	35	35	49	240
	“circulating microRNA” and “cancer”	19	26	40	37	35	32	37	226
SciELO	“miRNA and “cancer”	4	2	1	4	4	4	3	22
	“microRNA and “cancer”	2	0	1	2	6	4	2	17
	“circulating microRNA” and “cancer”	0	0	1	0	0	0	0	1
	“circulating microRNA” and “cancer”	0	0	1	0	0	0	0	1

Understanding the particularities of different miRNAs is crucial to determine the role of these molecules in diseases and cancer. Several databases collect and provide miRNA-specific data. With the rising volume of scientific data, several databases are being created to document the characteristics of these molecules. The website tools4miRs ( www.tools4mirs.org ) lists several webpages that collect miRNA data, in which sequences, target-miRNAs and scientific publications addressing different miRNAs can be found.

One of the most popular is the miRBase, in which the properties of each miRNA, including current and prior names, related publications, and molecular sequences can be found. Links to several other databases containing complementary information about different miRNAs are also provided.()

Complete descriptions of the level of expression of miRNAs per type of tissue or cell line can be found in the miRmine website ( https://guanfiles.dcmb.med.umich.edu/mirmine/ ) and facilitate the investigation of pathological changes that may be explored as potential biomarkers. Moreover, information about cancer cell-specific miRNA expression may be found in the database miRCancer ( http://mircancer.ecu.edu/ ), where scientific data on levels of expression according to cancer type are available.

Websites and software, miRDB ( www.mirdb.org ) and miRTar ( https://mcube.nju.edu.cn/jwang/mirTar/docs/mirTar/ ), in particular, can also be used to examine the biological effects of the expression of a given miRNA. These include mathematical algorithms and complementarity analyses of molecular sequences that can be used to predict potential target mRNAs for different mature miRNAs. Given the use of specific algorithms, findings may vary across websites. Hence the need for a critical analysis. In addition, complementary data may be found in websites providing exclusively scientifically validated data for each miRNA, the most popular being miRTarBase ( https://mirtarbase.cuhk.edu.cn/∼miRTarBase/miRTarBase_2019/php/index.php ) and TarBase ( https://carolina.imis.athena-innovation.gr ).

Most data available in these websites and software are periodically updated. Novel databases are constantly being created and reformulated to include updated information derived from published, acquired miRNA knowledge.

CIRCULATING MicroRNAs

It has recently been shown that miRNAs are not found only inside cells. These molecules are also released outside cells and can be found in several body fluids, and are called circulating miRNAs (c-miRNAs).() C-miRNAs appear to play an important role in intercellular communication, as well as in physiological and pathological processes. C-miRNA transport and release mechanisms involve binding to proteins and/or encapsulation in lipoprotein vesicles, which protect them from enzymatic degradation. However, mechanisms responsible for c-miRNA release have not been fully understood yet.(,)

The first publication reporting the detection of c-miRNAs dates from 2008, when the presence of different amounts of miR-155 and miR-21 in the serum of healthy individuals and B-cell lymphoma patients was described.() Within a short period of time, the presence of different levels of c-miRNAs has been demonstrated in other body fluids, including seminal fluid, colostrum, urine, saliva, breast milk, tears, amniotic fluid, bronchial secretion, plasma, pleural, peritoneal and cerebrospinal fluids.() The presence of c-miRNAs in several biological fluids allows for horizontal transfer of these molecules between different tissues. Hence, these molecules may have pleiotropic properties, for they may trigger short and distant biological effects.

Mechanisms involved in c-miRNA selection and release are controlled and involve a specific profile for each type of biological fluid. Different cellular changes lead to particular variations, which can be explored as biological markers of physiological or pathological conditions.() The use of c-miRNA profile in blood, plasma, serum or other body fluids to identify or monitor disease progression and therapeutic responses has been suggested.() The major advantages of using c-miRNAs are high specificity and sensitivity, wide availability of samples and high stability. These characteristics support their handling and exploration as important tools in individualized medicine. However, the lack of standardized protocols limits the use of c-miRNA in clinical practice, mainly due to the lack of universal normalizers that enable appropriate quantification and reliable comparison of findings.(,,)

Circulating miRNAs in cancer

Biological cell changes observed in carcinogenesis may lead to specific variations in c-miRNA expression profile. However, changes in intracellular miRNA expression are not always correlated with c-miRNA expression in biological fluids. To understand this relation, the effects of tumor growth on the body must be taken into account. Changes in c-miRNA profile may reflect enhanced or altered expression in cancer cells. Nevertheless, expression profile changes may also occur in response to immune reactions, inflammatory processes, therapy and physiological changes.(,)

In the last few years, the use of c-miRNA profile determination to detect, predict and monitor the progression of several types of cancer has been proposed.() The recognition of variations in c-miRNA expression profile is promising, particularly due to the benefits of these molecules for tumor classification.(,) Moreover, variations in c-miRNA expression profile allow early identification of therapeutic responses and may be used to predict clinical outcomes and to infer survival rates.() Given the role of c-miRNAs in intercellular communication, these molecules may affect gene expression in distant cells. Hence their important role in tumor progression and metastasis formation.() Circulating miRNAs are thought to participate in the preparation of metastatic niches, facilitating the colonization of novel environments by cancer cells. Furthermore, the flow of information in tumor cells may affect the expression of specific genes, facilitating immune system evasion and tumor dissemination and progression.()

CONCLUSION

Any condition leading to or resulting from variations in gene expression can be studied in the light of miRNAs. Several studies have shown that miRNAs play an important role in carcinogenesis. Hence, variations in the profile of expression of these molecules can be used as markers for cancer identification and diagnosis, and may be explored as potential therapeutic targets. The role of miRNAs in gene expression control, and the fact that this interaction is cellular context-dependent, emphasize the applicability of these molecules as potential targets in personalized medicine. The release of miRNAs into the extracellular space and the circulation observed in body fluids suggest these molecules are important for intercellular communication, and may interfere with cancer dissemination and progression. The characteristics inherent to miRNAs and the wide availability of body fluid samples support the applicability of circulating miRNAs as biomarkers of disease progression and therapeutic response in some diseases, such as cancer. However, given the complexity of interactions with their targets and the dependency on cell´s characteristics, further studies are still needed before those molecules can be used in clinical practice.

INTRODUÇÃO

Os microRNAs (miRNAs) são pequenas moléculas de ácido ribonucleico (RNA) que não codificam proteínas, os quais têm ganhado destaque nos últimos anos por seu papel como reguladores da expressão gênica e envolvimento em doenças, como as neoplasias. De fato, o câncer corresponde a um conjunto de doenças genéticas que podem ser causadas por inativação de genes supressores tumorais e/ou ativação de proto-oncogenes. A malignização celular implica no acúmulo de mutações no ácido desoxirribonucleico (DNA), que levam à desregulação da expressão gênica, a qual, por sua vez, acarreta consequências biológicas e funcionais para as células. Adicionalmente, alterações em processos epigenéticos também têm sido relacionadas com o desenvolvimento de tumores malignos. Dentre eles os miRNAs ganharam visibilidade devido a relação dessas moléculas com a aquisição de características malignas durante o processo de carcinogênese.()

Considerando esse contexto, aqui são apresentados e discutidos os avanços científicos dos últimos anos relacionados ao processo de geração e funcionamento de miRNAs, bem como sua relação com o câncer. Este artigo traz informações atualizadas sobre o papel dessas moléculas, discutindo a potencialidade de uso de miRNAs para o avanço no tratamento e no monitoramento do câncer.

Os miRNAs foram descritos pela primeira vez na década de 1990 em Caenorhabditis elegans, e são atualmente considerados moléculas fundamentais na regulação da expressão gênica das células animais e vegetais.()Essas moléculas têm entre 17 e 25 nucleotídeos e regulam a expressão gênica de maneira pós-transcricional, alterando o padrão de tradução proteica por meio da interação com RNAs mensageiros (mRNAs).()Atualmente, existem mais de 18 mil miRNAs distintos em 168 espécies catalogados no banco de dados miRBase ( www.mirbase.org ). Na espécie humana, já foram identificados mais de 2.500 miRNAs, no entanto a função de muitos deles ainda não é totalmente compreendida.()Variações no padrão de expressão de miRNAs têm sido relacionadas com diversos processos biológicos e fisiológicos e descritas em praticamente todas as patologias humanas.(,)

BIOGÊNESES DOS MicroRNAS

O processo de geração de miRNAs é complexo, inicia-se no núcleo e é finalizado no citoplasma, além de incluir a participação de diversas enzimas e complexos proteicos celulares, que regulam todo o percurso até a produção de miRNAs maduros capazes de desempenhar sua função ( Figura 1 ). Existem ao menos três vias de produção de miRNAs conhecidas, sendo a canônica a mais estudada.()

Figura 1

Biogênese canônica de microRNAs. Os microRNAs são primeiramente traduzidos no núcleo em moléculas denominadas pri-microRNAs. A partir de sequências de DNA, os pri-microRNAs são processados pela enzima nuclear Drosha, dando origem a uma molécula menor, chamada pré-microRNA. O pré-microRNA é exportado ao citoplasma, com a ajuda da exportina-5, no qual será processado pela enzima Dicer, gerando uma molécula de microRNA de fita dupla, que se acoplará ao complexo proteico silenciador induzido por RNA. O microRNA associado ao complexo silenciador induzido por RNA terá suas fitas separadas, dando origem a microRNAs maduros e capazes de se ligar aos RNAs mensageiros, inibindo sua tradução

A biogênese por via canônica começa com a transcrição do DNA, sendo que os miRNAs podem estar codificados em regiões intragênicas (principalmente regiões intrônicas) e intergênicas, tanto da fita sense quanto da fita antisense do DNA. A transcrição é realizada geralmente pela RNA polimerase II e, alter­nativamente, pela RNA polimerase III.()O primeiro transcrito, chamado miRNA primário ou pri-miRNA, tem uma estrutura de hairpin , ou grampo de cabelo, existindo uma parte na qual a molécula está pareada formando uma região de dsRNA (RNA de cadeia dupla) e com seus extremos protegidos por encapamento (CAP - capped ) e cauda poli-A.()O pri-miRNA é processado no núcleo pelo complexo enzimático formado pela RNase III Drosha e a proteína Pasha ou DiGeorge Syndrome Critical Region 8 protein (DGCR8), que tem capacidade de se ligar essa molécula de RNA de cadeia dupla e remover a cauda de poli A e o encapamento dos extremos da mesma. Esse processamento resulta em uma molécula de RNA de dupla fita com aproximadamente 70 nucleotídeos, denominada miRNA precursor ou pré-miRNA, que é exportada para o citoplasma com o auxílio das proteínas exportina-5 e Ran-GTP.()No citoplasma, a enzima Dicer continua com o processamento do miRNA, removendo a alça não pareada da molécula e dando origem a um miRNA de fita dupla de aproximadamente 22 nucleotídeos. Alternativamente, a proteína argonauta 2 (Ago2) pode participar da clivagem do pré-miRNA no citoplasma.()Esse miRNA de fita dupla é associado a um complexo proteico chamado complexo silenciador induzido por RNA (RISC), formado por diversas proteínas, sendo as proteínas Ago um dos fatores mais importantes, uma vez que são as responsáveis pela interação com as moléculas de RNAs.()O RISC causa a separação das duas fitas do miRNA, e, geralmente, uma delas é degradada, enquanto a outra, que corresponde ao miRNA maduro, fica exposta para poder parear com o mRNA-alvo.(,)

No processo de biogêneses de miRNAs por vias não canônicas, a produção de pré-miRNAs ocorre no núcleo, a partir de outras moléculas, como short hairpin RNA (shRNAs), miRtron ou m7G-pre-miRN, sendo que existem também variações em algumas das etapas subsequentes. A produção de pré-miRNA a partir de miRtron requer a participação do spliceossomo no núcleo. Por outro lado, o m7G-pre-miRN precisa da proteína exportina-1 para ser transportado para o citoplasma. Por último, a diferença entre o processamento canônico e o não canônico, envolvendo os shRNAs, se deve a participação das proteínas Ago2 no lugar da Dicer.(,)

MECANISMO DE AÇÃO DOS MicroRNAS

Para cumprir sua função, o miRNA se liga por meio do reconhecimento de mRNAs-alvo, de acordo com a complementariedade de sequências, alterando o padrão de tradução em proteínas dessas mRNAs. Esse pareamento pode ser total ou parcial, e quanto maior a complementariedade das sequências, mais forte e douradora parece ser essa interação. Os miRNAs são considerados importantes reguladores da expressão gênica, e seu mecanismo é dinâmico e influenciado pela localização dessas moléculas e pelos mecanismos de interação com seu alvo.()

O mecanismo de ação dos miRNAs incluem diversas etapas com a participação de várias proteínas.()O miRNA se liga ao seu alvo principalmente na região 3’ não traduzida (UTR) e, alternativamente, a outras regiões, como a 5’UTR, ou até em regiões promotoras do mRN-alvo, o que determina a consequência biológica dessa interação. A maioria dos miRNAs apresenta efeito inibitório na expressão gênica, causado pelo impedimento da tradução proteica do mRNA-alvo. No entanto, quando o miRNA se liga à região promotora de um gene, seu efeito pode ser oposto, causando a ativação de sua expressão.()

A interação entre o miRNAs e o mRNA-alvo pode resultar na degradação do mRNA, por meio do processo de clivagem dessa molécula, causada por uma endonuclease presente no RISC, ao qual o miRNA está associado.()Inicialmente, foi descrito que, para que isso aconteça, deveria haver complementaridade total entre as moléculas, e, no caso de complementariedade parcial, ocorreria apenas uma inibição temporária da tradução. No entanto, estudos mais recentes têm demonstrado que, em células animais, a maioria dos miRNAs apresenta apenas complementariedade parcial ao mRNA-alvo, o que parece ser suficiente para inibir de maneira permanente sua tradução.(,)

O pequeno tamanho dos miRNAs e a tolerância de complementariedade parcial com seu alvo permitem a interação com grande número de mRNAs. Assim, as consequências biológicas de variações em um miRNA determinado podem ser diferentes, dependo do contexto celular, fazendo-se necessária a verificação experimental, uma vez que o efeito celular do miRNA é dependente da função do mRNA-alvo. Um único miRNA pode ter consequências biológicas opostas em células diferentes, no caso de apresentar complementariedade de sequências com mRNAs-alvo com funções antagônicas. Desse modo, para entender o papel de cada miRNA, é fundamental considerar o perfil de mRNA transcritos em cada tipo celular. A rede de interação miRNA-mRNA é complexa, e os modelos bioinformáticos podem auxiliar no entendimento dessa relação, para identificar efeitos aditivos ou contraditórios entre miRNAs distintos.()

Adicionalmente, cada mRNA pode ser alvo de mais de um miRNA, e, quando se pretende entender os efeitos de um miRNA determinado, é necessário ponderar a interação entre o mRNA-alvo e outros miRNAs, uma vez que o desfecho biológico pode ser dependente da adição de efeitos dos diversos miRNAs expressos na mesma célula.()Assim, é possível afirmar que um determinado miRNA pode regular processos opostos em distintos tipos celulares, como, por exemplo, aumentar a proliferação celular e da taxa de apoptose, ainda que níveis semelhantes de um miRNA específico podem não ter o mesmo efeito biológico, uma vez que dependem dos alvos e da interação com outras moléculas em um determinado tipo celular.

MicroRNAS NO CÂNCER

O papel dos miRNAs no câncer vem sendo pesquisado desde o começo dos anos 2000, quando foi publicado o estudo realizado por Calin et al.()Eles mostraram que pacientes com leucemia linfoblástica crônica apresentam diminuição na expressão dos miR-15 e miR-16. A partir de então, alterações na expressão de diversos miRNAs em células tumorais têm apontando relação importante entre a desregulação dessas moléculas e o processo de carcinogênese.(,)Teoricamente, todos os tipos de tumores apresentam desregulação na expressão de algum tipo de miRNA. De fato, hoje sabemos que mais da metade dos genes que codificam miRNAs em humanos está localizada em regiões genômicas que foram descritas como desreguladas no câncer.(,)

Os miRNAs relacionados com o câncer podem ser classificados, de acordo com a função do mRNA-alvo, em supressores tumorais e miRNAs oncogênicos (oncomiRs). Essa segregação considera a habilidade dessas moléculas em interferir nos processos relacionados à carcinogênese, incluindo mecanismos associados com a migração e invasão celular, a apoptose e a proliferação. Pelo fato de a maioria dos miRNAs desempenhar um papel inibitório na expressão do mRNA-alvo, em geral sua classificação é oposta à de seu alvo. Assim, os miRNAs que agem como supressores tumorais são aqueles que regulam a expressão de mRNAs necessários para a divisão ou sobrevida celular, e os oncomiRs caracterizam-se por ter sua expressão aumentada nas células cancerosas, impedindo a atuação de genes capazes de suprimir o crescimento do tumor, estimulando a divisão de células cancerosa.()

As mudanças no padrão de expressão de miRNAs observadas nas células cancerosas demonstram a importância destas no surgimento e na progressão do câncer.()Variações no perfil de miRNAs têm sido associadas com processos que determinam a progressão do câncer, a formação de metástase e até com as taxas de morte celular, podendo ser relacionadas com o prognóstico do paciente. A desregulação na expressão de miRNAs observada em tumores malignos que progridem ou metastizam justifica a exploração dessas moléculas como potencial alvo terapêutico para neoplasias em estádio avançado.()Adicionalmente, a definição do perfil de expressão de miRNAs pode auxiliar na identificação e no diagnóstico de subtipos tumorais, podendo auxiliar a rever o prognóstico dos pacientes oncológicos.(,)

Nos últimos anos, a quantidade de estudos investigando a relação entre miRNAs e câncer tem crescido exponencialmente. Levantamento no PubMed®( www.pubmed.ncbi.nlm.nih.gov ) e na Scientific Electronic Library Online (SciELO) ( www.scielo.org ) das publicações científicas sobre o tema durante os últimos 7 anos demonstra o aumento no número de pesquisas científicas sobre miRNAs ( Tabela 1 ).

Tabela 1

Quantidade de artigos publicados por ano relacionando microRNAs e câncer, nos últimos 7 anos, de acordo com os descritores citados no título ou resumo

Base de dados	Descritores	2013	2014	2015	2016	2017	2018	2019	Total
PubMed®	“miRNA” e “câncer”	1.387	1.680	1.988	1.980	2.123	2.454	2.737	14.349
	“microRNA” e “câncer”	1.579	1.976	2.361	2.402	2.775	2.949	3.222	17.264
	“miRNA circulante” e “câncer”	24	32	33	32	35	35	49	240
	“microRNA circulante” e “câncer”	19	26	40	37	35	32	37	226
SciELO	“miRNA e “câncer”	4	2	1	4	4	4	3	22
	“microRNA e “câncer”	2	0	1	2	6	4	2	17
	“miRNA circulantes” e “câncer”	0	0	1	0	0	0	0	1
	“microRNA circulante” e “câncer”	0	0	1	0	0	0	0	1

Entender as particularidades de cada miRNA é fundamental para compreender o papel que essas moléculas têm nas doenças e no câncer. Nesse sentido, é possível encontrar diversas bases de que coletam e disponibilizam informações específicas para cada miRNAs. Com o aumento de informações científicas sobre miRNAs, diversas bases de dados têm sido criadas para registrar características sobre tais moléculas. No site da tools4miRs ( www.tools4mirs.org ), são referenciadas diversas páginas web que coletam informações sobre miRNAs, nas quais podem ser encontradas as sequências, os mRNAs-alvo e os estudos científicos publicados sobre cada miRNA.

Uma das bases de dados mais usadas é a miRBase. Nela são explicitadas as propriedades de cada miRNA, incluindo nomes atuais e anteriores, publicações relacionadas e a própria sequência da molécula. Nesse site , são ainda mencionados diversos links para outras bases de dados com informações complementares para cada miRNA.()

No site miRmine, pode ser encontrada a descrição do nível de expressão de miRNAs por tipo de tecido ou linhagem celular ( https://guanfiles.dcmb.med.umich.edu/mirmine/ ), o que facilita o estudo de alterações patológicas potencialmente exploradas como biomarcadores. Adicionalmente, dados de expressão de miRNAs especificamente em células cancerosas podem ser verificados nas bases de dados miRCancer ( http://mircancer.ecu.edu/ ), que disponibiliza o nível de expressão de acordo com o tipo de neoplasia usando dados científicos publicados.

Ainda, para entender o efeito biológico da expressão de um determinado miRNA, podem ser consultados sites e softwares , que, por meio de algoritmos matemáticos e análises de complementariedade de sequência entre as moléculas, preveem quais são os potenciais mRNAs-alvo para cada miRNA maduro. Dentre eles, destacam-se o miRDB ( http://mirdb.org/ ) e o miRTar ( https://mcube.nju.edu.cn/jwang/mirTar/docs/mirTar/ ). Cada software usa de algoritmos específicos, e os resultados podem variar entre os sites utilizados, sendo fundamental uma análise crítica dos resultados. Complementarmente, a esses dados, ainda existem sítios na internet que registram apenas alvos validados experimentalmente para cada miRNA, estando entre os mais divulgados para essa categoria o miRTarBase ( https://mirtarbase.cuhk.edu.cn/∼miRTarBase/miRTarBase_2019/php/index.php ) e o TarBase ( https://carolina.imis.athena-innovation.gr ).

A maioria das informações disponíveis nesses sites e softwares é atualizada periodicamente com dados provenientes de pesquisas científicas publicadas. Novas bases de dados são criadas e reformuladas constantemente para incluir as informações atualizadas, de acordo com os conhecimentos adquiridos e publicados sobre miRNAs.

MicroRNAS CIRCULANTES

Recentemente, tem sido demonstrado que os miRNAs não se findam apenas ao interior celular. Essas moléculas também são liberadas para fora das células, podendo ser encontradas circulando em diversos fluidos corporais, sendo, nesses casos, chamadas de miRNAs circulantes (c-miRNAs).()Os c-miRNAs parecem desempenhar papel importante na comunicação intercelular, executando uma função tanto em processos fisiológicos como em patológicos. Os mecanismos de transporte e liberação de c-miRNAs implicam na participação e na associação dessas moléculas com proteínas e/ou o encapsulamento em vesículas formadas por lipoproteínas, que as protegem da degradação enzimática. Porém os mecanismos que controlam sua liberação ainda não foram totalmente desvendados.(,)

A primeira publicação que relata a detecção de c-miRNAs é de 2008, quando foi descrita a presença de miR-155 e miR-21 em quantidades diferentes no soro de pessoas saudáveis quando comparadas com pacientes com linfoma de células B.()Logo em seguida, foi demonstrada a presença de c-miRNAs em diferentes quantidades em outros tipos de líquidos biológicos, incluindo fluido seminal, colostro, urina, saliva, leite materno, lágrimas, líquido amniótico, secreção brônquica, plasma, líquido pleural, líquido peritoneal e líquido cefalorraquidiano.()A presença de c-miRNAs nos diversos líquidos biológicos permite que essas moléculas tenham capacidade de transferência horizontal, passando entre diferentes tecidos e desempenhando função pleiotrópica, uma vez que podem causar efeitos biológicos a curtas e longas distâncias.

O mecanismo de seleção e liberação de c-miRNAs é controlado e implica em perfil específico em cada tipo fluido biológico, sendo que alterações em células distintas acarretam em variações particulares, que podem ser exploradas como marcadores biológicos de condições fisiológicas ou patológicas.()De fato, tem sido sugerido usar o perfil de c-miRNAs no sangue, no plasma, no soro ou em outros fluidos corporais, para identificar ou monitorar a evolução de doenças e as respostas terapêuticas.()As principais vantagens do uso de c-miRNAs são alta especificidade e sensibilidade dessas moléculas; facilidade de obtenção de amostras e alta estabilidade. Isso facilita sua manipulação e favorece sua exploração como ferramenta importante para a medicina personalizada. No entanto, a falta de protocolos padronizados ainda limita seu uso na prática clínica, principalmente pela falta de normalizadores universais que permitam a quantificação de maneira que os resultados possam ser comparados.(,,)

miRNAs circulantes no câncer

As alterações biológicas celulares observadas durante o processo de carcinogênese podem acarretar variação no perfil de c-miRNAs de maneira específica. Porém tem sido reportado que mudanças na expressão de miRNAs intracelulares nem sempre se correlacionam diretamente com as variações na expressão de c-miRNAs observadas em fluidos biológicos. De fato, para entender essa relação, é necessário considerar os efeitos que o crescimento de um tumor tem no organismo. As modificações no perfil de c-miRNA podem ser ocasionadas não apenas pelo aumento ou pela alteração, observados nas células cancerosa, mas também podem ser conse­quências das respostas do sistema imune e/ou de processos inflamatórios, ou, ainda, serem causada pela terapia ou por mudanças fisiológicas.(,)

No entanto, nos últimos anos, a determinação do perfil c-miRNAs tem sido proposta para identificar, prever o prognóstico e acompanhar a evolução de diversas neoplasias.()O reconhecimento das variações no perfil de c-miRNAs é promissor, principalmente quando são levadas em consideração as vantagens de usar essas moléculas na classificação dos tumores.(,)Adicionalmente, variações do perfil de c-miRNAs permitem identificar precocemente a resposta terapêutica, podendo ser usadas para predizer resultados clínicos e inferir as taxas de sobrevivência.()

Considerando que os c-miRNAs tem um papel na comunicação intercelular, essas moléculas podem afetar a expressão gênica de células distantes e, dessa forma, desempenhar outro papel importante, dessa vez nos processos de progressão tumoral e de formação de metástases.()De fato, acredita-se que os c-miRNAs participam da preparação do nicho de metástase, facilitando a colonização de novos ambientes pelas células cancerígenas. Adicionalmente, esse fluxo de informação das células tumorais poderia ainda se importante no processo de evasão do sistema imunológico, pela regulação na expressão de genes específicos, favorecendo a disseminação e a progressão tumoral.()

CONCLUSÃO

Qualquer condição que cause ou seja causada por variações na expressão gênica pode ser estudada à luz dos miRNAs. Diversos estudos comprovaram que os miRNAs são importantes moléculas no processo de car­cinogênese. Por isso, variações no perfil de expressão dessas moléculas podem ser utilizadas como marcadores de identificação e diagnóstico do câncer e, ainda, exploradas como potenciais alvos terapêuticos. As funções que os miRNAs desempenham no controle da expressão gênica e o fato de a interação ser dependente do contexto celular individual destacam essas moléculas como potenciais alvos da medicina personalizada. Adicionalmente, a liberação de miRNAs para o espaço extracelular e a circulação observada nos fluidos biológicos apontam a importância dessas moléculas na comunicação intercelular, sugerindo que podem ter um papel durante a progressão e a disseminação do câncer. As características intrínsecas dos miRNAs, junto da facilidade de obtenção de amostra de fluidos corporais, destacam os miRNAs circulantes como biomarcadores para o acompanhamento da evolução e da resposta terapêutica de patologias como o câncer. No entanto devido à complexidade de interação com os alvos e a dependência com as características celulares, ainda são necessários mais estudos para poder utilizar essas moléculas na prática clínica.