Serum Thiol Levels and Thiol/Disulfide Homeostasis in Patients with Rheumatic Mitral Valve Disease and Healthy Subjects.

BACKGROUND: Rheumatic mitral valve disease (RMVD) is the most common presentation of rheumatic heart disease (RHD). Inflammation and fibrosis processes also play significant roles in its pathogenesis. Recent studies showed that thiols and thiol-disulfide are promising novel oxidative stress markers.
OBJECTIVES: The present study aimed to evaluate differences in the serum thiol and thiol-disulfide levels in patients with RMVD and the control group.
METHODS: Ninety-two patients with RMVD were enrolled in the study. Fifty-four healthy subjects, age, and gender-matched with the study group, were also included in the study as a control group. This study investigated thiol levels in patients with RMVD and the control group. P-values lower than 0.05 were considered statistically significant.
RESULTS: The patients with RMVD presented higher systolic pulmonary artery pressure (SPAP) and left atrial (LA) diameter levels than the control group. Native thiol (407±83 μmol/L vs. 297±65 μmol/L, p<0.001) and total thiol (442±82 μmol/L vs. 329±65 μmol/L, p<0.001) levels were higher in the control group. Disulfide (16.7±4.9 μmol/L vs. 14.8±3.7 μmol/L, p=0.011) levels were higher in the group of patients with RMVD. A positive correlation was found between disulfide/native and disulfide/total thiols ratio with SPAP, LA diameter, and MS severity. Disulfide/total thiols ratio was significantly higher in patients with severe MS than with mild to moderate MS patients.
CONCLUSIONS: To the best of our knowledge, this is the only study of its kind that has evaluated thiol/disulfide homeostasis as a novel predictor, which was more closely related to RMVD and the severity of MS.

Introdução

A doença cardíaca reumática (DCR) é a doença cardiovascular mais amplamente observada em crianças e adolescentes.[1] A doença valvar mitral reumatismal (DVMR) é a apresentação mais comum das DCR.[2] O estudo em 2015 relatou que o número estimado de pacientes com DCR era de 33,4 milhões globalmente.[3] No estudo PROVAR, os autores fizeram a triagem de 5996 alunos com mediana de idade de 11,9 (faixa de 9,0 a 15,0), com ecocardiograma. Os autores relataram que a prevalência de DCR era de 42/1000 em crianças brasileiras.[4]

A doença cardíaca reumática ocorre após uma reação autoimune, que é desencadeada por uma infecção estreptocócica do trato respiratório superior não tratada. Esse processo causa lesão valvar grave em sujeitos geneticamente suscetíveis.[5] Apesar de a fisiopatologia das DCR ser desconhecida, há hipóteses de que várias reações inflamatórias e autoimunes, stress oxidativo, genes do sistema imune, e polimorfismos estejam relacionados às DCR.[5 - 9]

Os tióis são agentes antioxidantes cruciais na fisiologia humana. As concentrações de tiol são mais baixas em plasma. Isso acontece porque os tióis são compostos majoritariamente por albumina de plasma humano com tióis de baixo peso molecular, incluindo a cisteína (Cys), a homocisteína, a glutationa, a cisteinil glicina, e a γ-glutamilcisteína.[10] Os processos oxidativos podem transformar os tióis em várias moléculas diferentes. O tiol-dissulfeto é um dos produtos das reações oxidativas em que os tióis estão envolvidos.[11] A oxidação dos resíduos de Cys podem gerar a produção reversível de vários dissulfetos, tais como tióis de massa molecular baixa e moléculas de tiol proteico. Além disso, os resíduos de dissulfeto poderiam ser convertidos em grupos de tiol para manter a homeostase tiol/dissulfeto estável.[12] Portanto, os tióis representam uma parte crucial da quantidade total de antioxidantes e têm um papel significativo no mecanismo antioxidante para espécies reativas oxidativas (ERO).[13]

Os estudos atuais demonstraram que a razão tiol-dissulfeto tinha um valor significativo como marcador de stress oxidativo promissor.[14 , 15] Embora a importância do metabolismo de tióis tenha sido avaliada para procedimentos e doenças cardiovasculares diferentes, tais como o infarto do miocárdio ou cirurgia para ponte arterial, sua expressão em DCR não é conhecida.[14 , 16] Neste estudo, devido ao componente fisiopatológico da DVR, buscamos avaliar os níveis de tiol em pacientes com DVMR e em sujeitos saudáveis.

Métodos

Noventa e dois pacientes com DVMR que foram atendidos em nossa clínica entre abril de 2018 e dezembro de 2019 foram cadastrados no estudo. Cinquenta e quatro sujeitos saudáveis, e com correspondência em relação ao grupo de estudo, também foram incluídos no estudo como um grupo de controle. Foram considerados sexo, idade, índice de massa corporal (IMC), comorbidades, fração de ejeção do ventrículo esquerdo, e tabagismo para o pareamento dos grupos.

O termo de consentimento informado escrito foi obtido de todos os participantes. Os critérios de exclusão foram pacientes com síndrome de Marfan, válvula aórtica bicúspide, patologias de válvula mitral não reumáticas, ou cirurgia aberta prévia. Além disso, pacientes com doenças hepáticas, tireoidianas e renais, doenças hematológicas, doenças do tecido conjuntivo ou inflamatórias, qualquer histórico de câncer, e infecção aguda ou crônica também foram excluídos do estudo.

Os dados relevantes demográficos, antropométricos e de histórico médico foram registrados. Informações clínicas, tais como os fatores de risco coronarianos de Framingham (hipertensão (HT), diabetes mellitus (DM), tabagismo, hiperlipidemia, e histórico familiar de doença coronariana), também foram coletadas.

O ecocardiograma transtorácico bidimensional com Doppler colorido foi utilizado em todos os pacientes, utilizando-se ultrassom com transdutores de 2,5-MHz (Toshiba SSH160A). Foi utilizado o ecocardiograma modo M para medição do diâmetro atrial esquerdo, e os métodos de planimetria e meia-pressão foram utilizados para acessar a área da válvula mitral. O gradiente transmitral foi definido com um Doppler de onda contínua em um corte apical de quatro câmaras. O Doppler colorido foi realizado para detectar a presença e a gravidade da regurgitação mitral (RM). A pressão sistólica da artéria pulmonar foi medida por estudos de Doppler de onda contínua, utilizando-se a equação de Bernoulli. Os critérios para diagnóstico de DVMR incluem área da válvula mitral ≤ 2,5 cm2, a presença de espessamento de folhetos, fusão comissural, e alteração na área subvalvar, detectada por ecocardiograma.[17]

Foram coletadas amostras sanguíneas da veia antecubital durante a admissão no hospital. As amostras sanguíneas dos grupos de pacientes e controle foram coletadas pela manhã, após um período de jejum de 12 horas. Todas as amostras de sangue foram coletadas em tubos que não continham aditivos. Foi obtido soro após a centrifugação a 1500 g por 10 minutos, que foi armazenado a -80°C até a análise.

A homeostase tiol/dissulfeto foi realizada pelo procedimento determinado por Erel et al.,[18] Em seguida, grupos de tiol funcional livre foram obtidos com a redução de ligações de dissulfeto. O boro-hidreto de sódio foi aplicado como redutor, e o redutor não utilizado foi retirado por formaldeído. Depois da reação com o ácido 5,5’-ditio-bis-(2-nitrobenzóico), todos os grupos de tiol, tanto os nativos quanto os reduzidos, foram definidos. A quantidade de dissulfeto dinâmico (−S-S) foi confirmada por metade da diferença entre tióis nativos e totais. Depois de avaliar a magnitude do tiol nativo (−SH) e do dissulfeto (−S-S), a razão dissulfeto/tiol nativo (−S-S−/−SH) foi calculada.[18]

Análise estatística

A normalidade dos dados foi analisada utilizando-se o teste Kolmogorov-Smirnov. As variáveis quantitativas com distribuição normal foram apresentadas como média e desvio padrão. As variáveis com distribuição não normal foram apresentadas como mediana (faixa interquartil), e dados categóricos, como número e porcentagem. O teste t com amostras independentes foi utilizado para comparar os grupos em relação aos dados contínuos com distribuição normal, enquanto o teste U de Mann-Whitney foi realizado para variáveis com distribuição não normal. Os dados categóricos foram analisados usando o teste Qui-quadrado ou teste exato de Fisher. As relações entre as variáveis categóricas e numéricas foram analisadas pela análise da correlação de Spearman. As diferenças foram consideradas significativas no nível de p <0,05 de dois lados. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o programa Statistical Package for Social Sciences (SPSS) para Windows versão 22 (IBM SPSS Inc., Chicago, IL).

Resultados

Um total de 146 sujeitos, dos quais 92 apresentavam DVMR, e 54 não, foi incluído no estudo. Os dados demográficos, clínicos e laboratoriais dos grupos estudados são apresentados na Tabela 1 . No grupo de pacientes com DVMR, um total de 22 (24%) eram do sexo masculino e 70 (76%) eram do sexo feminino, enquanto 15 (28%) pacientes eram do sexo masculino e 39 (72%) eram do sexo feminino no grupo de controle. A idade média era de 48±10 anos e 46,7±11,2 anos nos grupos de pacientes com DVMR e de controle, respectivamente. Não foram encontradas diferenças entre os grupos em termos de idade, sexo, IMC, HT, DM, tabagismo e outros parâmetros laboratoriais. Como esperado, os pacientes com DVMR apresentaram pressão sistólica da artéria pulmonar (PSAP) e níveis de diâmetro do átrio esquerdo (AE) mais altos que os do grupo de controle.

Tabela 1

– Características clínicas, demográficas de laboratoriais na linha de base dos pacientes com doença valvar mitral reumatismal

			Controle (n:54)	DVMR (n:92)	p
Idade (Mediana, FIQ1- FIQ3)			45 (39,3 - 54,5)	48 (42 - 55,8)	0,304 m
Sexo (n,%)	Masculino		15 (28%)	22 (24%)	0,604 X2
	Feminino		39 (72%)	70 (76%)
DM (n,%)	Não		48 (89%)	88 (96%)	0,133 X2
	Sim		6 (11%)	4 (4%)
HT (n,%)	Não		46 (85%)	79 (86%)	0,492 X2
	Sim		8 (15%)	13 (14%)
Tabagismo, n(%)	Não		40 (74%)	58 (63%)	0,134 X2
	Sim		14 (26%)	34 (37%)
IMC (Mediana, FIQ1- FIQ3)			24 (22 - 25,8)	24 (21,9 - 25)	0,139 m
Glicemia (mg/dL) (Mediana, FIQ1- FIQ3)			94 (88,5 - 102)	90 (21,9 - 25)	0,054 m
Creatinina sérica (mg/dL) (Mediana, FIQ1- FIQ3)			0,8 (0,6 - 0,8)	0,7 (0,6 - 0,8)	0,128 m
Hemoglobina (g/dL) (Mediana, FIQ1- FIQ3)			14 (13 - 14)	13,8 (12 - 14)	0,509 m
Contagem WBC (x1000/mm3) (Mediana, FIQ1- FIQ3)			6,4 (5,9 - 7,3)	6,2 (6 - 7)	0,423 m
Contagem de plaquetas (x1000/mm3) (Mediana, FIQ1- FIQ3)			300 (254,5 - 348,8)	301 (277 - 313)	0,766 m
Colesterol total (mg/dL) (Mediana, FIQ1- FIQ3)			215 (195,3 - 235)	197 (195 - 225)	0,075 m
LDL, (mg/dL) (Mediana, FIQ1- FIQ3)			120 (103,3 - 125)	114 (100 - 121)	0,086 m
HDL, (mg/dL) (Mediana, FIQ1- FIQ3)			49 (45 - 55,8)	51 (45,8 - 72)	0,113 m
Triglicérides (mg/dL) (Mediana, FIQ1- FIQ3)			150 (90,8 - 185)	148 (64 - 150)	0,282 m
FEVE (Mediana, FIQ1- FIQ3)			61 (60 - 66)	60 (62,8 - 66)	0,155 m
AE, (mm) (Mediana, FIQ1- FIQ3)			36 (35 - 37)	43 (38 - 47)	<0,001 m
PSAP (mmHg) (Mediana, FIQ1- FIQ3)			20 (18 - 20)	31 (27,8 – 39,3)	<0,001 m
RM Mo/G		Ausente	54 (100%)	60 (65%)
		Presente	0 (0%)	32 (35%)
EMi Grave		Ausente	54 (100%)	77 (84%)
		Presente	0 (0%)	15 (16%)
Histórico de VMPB			0 (0%)	15 (16%)
TV cirúrgica			0 (0%)	0 (0%)
AVM			-	2,2 ± 1,3
DVAR			0 (0%)	47 (51%)

IMC: Índice de massa corporal; DM: diabetes mellitus; HDL: lipoproteína de alta densidade; HT: hipertensão; AE: átrio esquerdo; LDL: lipoproteína de baixa densidade; FEVE: fração de ejeção ventricular esquerda; DVMR: doença valvar mitral reumatismal; PSAP: pressão sistólica da artéria pulmonar; WBC: leucócitos; RM Mo/G: Regurgitação mitral moderada ou grave; VMPB: valvoplastia mitral percutânea por balão; TV: troca valvar; AVM: área valvar mitral; DVAR: doença valvar aórtica reumática (estenose ou regurgitação).

Os níveis de tiol nativo (407±83 μmol/L vs. 297±65 μmol/L, p<0,001) e tiol total (442±82 μmol/L vs. 329±65 μmol/L, p<0,001) são mais altos no grupo de controle. Os níveis de dissulfeto (16,7±4,9 μmol/L vs. 14,8±3,7 μmol/L, p=0,011) são elevados no grupo de pacientes com DVMR. As razões dissulfeto/tiol total e as razões dissulfeto/tiol nativo médias são mais altas no grupo de pacientes com DVMR, enquanto as razões tiol nativo/dissulfeto e as razões tiol total/dissulfeto são mais altas no grupo de controle. Os níveis de tiol nativo, tiol total, dissulfeto, razão dissulfeto/tióis e razão tióis/dissulfeto entre pacientes com ou sem DVMR são apresentadas na Tabela 2 .

Tabela 2

– Nível de tiol nativo, tiol total, dissulfeto, razão dissulfeto/tióis e razão tióis/dissulfeto entre pacientes com ou sem doença valvar mitral reumatismal

	Controle (n:54)	DVMR (n:92)	p
Tiol total, (mmol/L) (Média ± DP)	442±82	329±65	<0,001 t
Tiol nativo, (mmol/L) (Média ± DP)	407±83	298± 65	<0,001 t
Dissulfeto, (mmol/L) (Mediana, FIQ1- FIQ3)	15,1 (13,4 – 17,6)	17 (14,8 - 19,9)	0,011 m
Dissulfeto/tiol total, %x100 (Mediana, FIQ1- FIQ3)	3,4 (2,8 - 4)	5,4 (4,3 - 6,6)	<0,001 m
Dissulfeto/tiol nativo, %x100 (Mediana, FIQ1- FIQ3)	3,7 (3 - 4,4)	5,8 (4,7 – 7,4)	<0,001 m

DVMR: doença valvar mitral reumatismal;

A análise de correlação mostrou que houve correlação positiva entre os níveis de dissulfeto e a gravidade da estenose mitral (área da válvula mitral <1,5 cm2); entre a razão dissulfeto/tiol total e nativo com PSAP, diâmetro de AE, e gravidade da estenose mitral. Além disso, houve correlações negativas entre o tiol nativo e o tiol total com PSAP, diâmetro de AE, e gravidade da estenose mitral. A análise de correlação entre os parâmetros de tiol e dissulfeto com achados de ecocardiogramas está listada na Tabela 3 .

Tabela 3

– Análise da correlação entre parâmetros de tiol e de dissulfeto com achados ecocardiográficos

		PSAP	EMi Grave	AE
Tiol nativo	Rô de Spearman	-0,598	-0,319	-0,532
	p	<0,001	<0,001	<0,001
Tiol total	Rô de Spearman	-0,596	-0,300	-0,549
	p	<0,001	<0,001	<0,001
Dissulfeto	Rô de Spearman	0,135	0,188	0,107
	p	0,106	0,023	0,201
Dissulfeto/tiol nativo	Rô de Spearman	0,469	0,331	0,403
	p	<0,001	<0,001	<0,001
Dissulfeto/tiol total	Rô de Spearman	0,473	0,333	0,405
	p	<0,001	<0,001	<0,001

AE: átrio esquerdo; EMi: estenose da válvula mitral; PSAP: pressão sistólica da artéria pulmonar.

O nível de tiol nativo, tiol total, dissulfeto, razão dissulfeto/tióis e razão tióis/dissulfeto entre pacientes com ou sem estenose mitral reumática grave (EMRG) está listado na Tabela 4 . Não houve uma diferença significativa em tiol nativo, tiol total, e dissulfeto entre os pacientes que tinham EMi leve a moderada e EMi grave ou histórico de valvoplastia mitral percutânea. Entretanto, as razões de dissulfeto/tiol total e dissulfeto/tiol nativo foram significativamente mais altas em pacientes com EMi grave ou histórico de valvoplastia mitral percutânea. Por outro lado, não foram observadas diferenças significativas nos níveis de tiol nativo, tiol total, dissulfeto, e nas razões dissulfeto/tiol total e dissulfeto/tiol nativo de acordo com a gravidade de regurgitação mitral do paciente.

Tabela 4

– Nível de tiol nativo, tiol total, dissulfeto, razão dissulfeto/tióis e razão tióis/dissulfeto entre pacientes com ou sem estenose mitral reumática

	EMi leve - moderada (n:62)	EMi grave ou Histórico de VMPB (n:30)	p
Tiol total, (mmol/L) (Média ± DP)	335±66	317±62	0,125 t
Tiol nativo, (mmol/L) (Média ± DP)	304±67	282±59	0,215 t
Dissulfeto, (mmol/L) (Média ± DP)	17±5	19±7	0,093 t
Dissulfeto/tiol total, %x100 (Média ± DP)	5,2±1,7	6,1±2,1	0,045 t
Dissulfeto/tiol nativo, %x100 (Média ± DP)	5,8±2,1	7,1±3,7	0,048 t

EMi: Estenose mitral; VMPB: valvoplastia mitral percutânea por balão;

Discussão

Os níveis de tiol plasmático foram significativamente mais baixos em pacientes com DVMR em comparação com o grupo de controle. Os níveis de dissulfeto e a razão dissulfeto/tióis foram maiores em pacientes com DVMR. Até onde se sabe, este é o único estudo que avaliou a homeostase tiol/dissulfeto como um novo preditor, que está relacionado de forma mais próxima à DVMR e à gravidade da EMi.

A doença cardíaca reumática e a DVMR são as complicações graves da febre reumática aguda e causa lesões valvares crônicas, levando a morbidade e mortalidade.[2] A DCR é responsável por uma parte crucial da carga de saúde em muitos países em desenvolvimento.[19] A DVMR tem um mecanismo complexo em que o principal é a inflamação crônica e as reações autoimunes.

Estudos anteriores apresentaram evidências convincentes de que houve uma inflamação progressiva na DCR, e essa inflamação persistente já causou danos ao tecido valvar.[7] Vários estudos avaliaram marcadores de inflamação crônica em pacientes com DCR. Alguns desses estudos demonstram que níveis séricos mais elevados de PCR ultrassensível e Pentraxina-3, em comparação com sujeitos saudáveis, poderiam ser considerados marcadores de inflamação em pacientes com DVMR.[20 , 21] Em uma pesquisa recente, a razão neutrófilo-linfócito (NLR) era significativamente mais alta em pacientes com DVMR grave que em pacientes com DVMR leve a moderada.[22]

Estudos recentes demonstraram a possibilidade de interações entre as interleucinas e a inflamação crônica, inclusive com o desenvolvimento de DCR. Davutoglu et al. e Bilik et al. demonstraram que pacientes com DVMR tinham níveis plasmáticos mais elevados de fator de necrose tumoral alfa (TNFa), IL-2, IL-6, IL-8, e IL-17, IL-23 como preditores de inflamação progressiva e resposta autoimune que sujeitos saudáveis.[23 , 24] Em estudos anteriores, marcadores de stress oxidativo no tecido e no plasma foram investigados em pacientes com DCR. Ele determinou que os níveis de produtos proteicos de oxidação avançada eram mais altos em pacientes com DCR que no grupo de controle.[25 , 26] Além disso, nosso estudo foi o primeiro a avaliar o papel da razão tiol-dissulfeto e marcadores de stress oxidativo inéditos em pacientes com DCR.

O stress oxidativo (SO) é o desequilíbrio entre espécies reativas do oxigênio (ERO) e substâncias antioxidantes, e ele pode ser tóxico às células levando à peroxidação lipídica da membrana e lesão à membrana.[27 , 28] Os tióis são antioxidantes significativos e desempenham um papel importante na eliminação não enzimática de ERO.[10 , 13] Embora as oxidações de tióis proteicos tenha sido considerada uma reação colateral indesejável do stress oxidativo, a identificação de proteínas redox reguladas mostrou que modificações reversíveis do tiol foram importantes para ajustar sua atividade às condições de redox prevalentes no ambiente.[29] A definição da importância funcional de modificações de tiol continua a ser um desafio significativo no campo e ainda exige que estudos bioquímicos sejam feitos em casos e doenças diferentes.

Recentemente, a significância da homeostase dissulfeto/tiol foi demonstrada em vários estudos. Um destes, realizado por Kundi et al.,[14] demonstrou que a razão dissulfeto/tiol aumentava no IAM, e os autores concluíram que esse valor poderia ser usado como preditor para a detecção de lesão miocárdica aguda.[14] Em outro estudo, Topuz et al. demonstraram que a homeostase tiol/dissulfeto pode se alterar durante o tromboembolismo pulmonar agudo. Além disso, ela pode estar relacionada a medições hemodinâmicas comprometidas.[30] Vários estudos relatam que a redução das concentrações de tiol e da razão tiol/dissulfeto pode ser um fator crucial no desenvolvimento da aterosclerose, da ectasia da artéria coronária (EAC), e da toxicidade cardíaca induzida por quimioterapia.[15 , 31 , 32] Resumidamente, os autores concluíram que o stress oxidativo pode envolver o fator principal de patogênese. Em nosso estudo, os níveis de tiol e a razão tiol/dissulfeto estão relacionados à DVMR e à gravidade do envolvimento mitral reumático, confirmando a hipótese de que a válvula reumática seja a causa do stress oxidativo além da inflamação crônica.

Até onde se sabe, este é o primeiro estudo a avaliar a relação entre a homeostase tiol/dissulfeto e seus impactos na DCR, e a intensidade do dano à válvula em pacientes com DVMR. Nossos achados mostram que a homeostase tiol/dissulfeto poderia ter um papel essencial na fisiopatologia da lesão à válvula reumática. Informações definitivas sobre o assunto poderiam ser conseguidas por meio de estudos de tecido in vitro e in vivo.

Limitações

Este estudo tem várias limitações. Primeiramente, uma amostra relativamente pequena restringiu a possibilidade de generalização dos achados de nossa pesquisa. A falta de dados de monitoramento e alterações em série de tióis, e a ausência de medições simultâneas de outros mediadores inflamatórios e autoimunes inéditos são outras limitações do estudo. Os valores de tiol/dissulfeto não são comparáveis a outros marcadores enzimáticos e não enzimáticos de stress oxidativo. Finalmente, o estudo poderia ser melhorado, acrescentando-se o polimorfismo genético a pacientes com DVMR.

Conclusões

O presente estudo é o primeiro a demonstrar a associação entre os níveis de tiol e a homeostase de tiol/dissulfeto em pacientes com DVMR. Nossos achados demonstraram seu possível papel na gravidade do dano à válvula na fisiopatologia da DVMR.

Introduction

Rheumatic heart disease (RHD) is a widely observed cardiovascular disease in children and adolescents.[1] Rheumatic mitral valve disease (RMVD) is the most common presentation of RHD.[2] A study in 2015 reported that the estimated number of RHD patients was 33.4 million worldwide.[3] In the PROVAR study, the authors screened 5,996 students, whose median age was 11.9 (range 9.0 to 15.0), with echocardiography. The authors reported that RHD prevalence was 42/1,000 in Brazilian children.[4]

Rheumatic heart disease occurs after an autoimmune reaction, which is triggered by an untreated streptococcal upper respiratory tract infection. This process causes severe valvular injury in genetically susceptible subjects.[5] Despite the unknown pathophysiology of RHD, there are hypotheses that several autoimmune and inflammatory reactions, oxidative stress, immune system genes, and polymorphisms are related to RHD.[5 - 9]

Thiols are crucial antioxidant agents in human physiology. Thiol concentrations are lower in plasma. This occurs because thiols mostly consist of human plasma albumin with low-molecular-weight thiols, including cysteine (Cys), homocysteine, glutathione, cysteinyl glycine, and γ-glutamyl-cysteine.[10] The oxidative processes can transform thiols into many different molecules. The thiol-disulfide is one of the products of the oxidative reactions in which thiols are involved.[11] The oxidation of Cys residues may produce a reversible production of various disulfides, such as low-molecular-mass thiols and protein thiol molecules. Furthermore, disulfide residues can be converted into thiol groups to keep the thiol/disulfide homeostasis stable.[12] Therefore, thiols consist of a crucial part of the total amount of antioxidants and play a significant role in the antioxidant mechanism for radical oxygen species (ROS).[13]

The current studies demonstrated that the thiol-disulfide ratio had significant value as a promising oxidative stress marker.[14 , 15] Although the importance of thiol metabolism was evaluated in different cardiovascular diseases and procedures, such as myocardial infarction or coronary artery bypass surgery, its expression in RHD is unknown.[14 , 16] This study, due to the pathophysiological component of RVD, aimed to evaluate the thiol levels in RMVD patients and healthy subjects.

Methods

Ninety-two patients with RMVD who were admitted to our cardiology clinic between April 2018 and December 2019 were enrolled in the study. Fifty-four healthy subjects, matched to patients, were also included in the study as a control group. Gender, age, body mass index (BMI), comorbidities, left ventricle ejection fraction, and smoking status were considered for the pairing of the groups.

Written informed consent was obtained for all participants. The exclusion criteria were patients with Marfan syndrome, bicuspid aortic valve, non-rheumatic mitral valve pathologies, or prior open-heart surgery. Furthermore, patients with liver, thyroid, and kidney diseases, blood disorders, connective tissue or inflammatory disease, any history of cancer, and acute or chronic infection were also excluded from the study.

The relevant demographic, anthropometric, and medical history data were recorded. Clinical information, such as Framingham’s coronary risk factors (hypertension (HT), diabetes mellitus (DM), smoking, hyperlipidemia, and family history of coronary disease history), were also collected.

Transthoracic two-dimensional and color flow Doppler echocardiography was used in all patients using ultrasound with 2.5-MHz transducers (Toshiba SSH160A). The M-mode echocardiography was used to measure the left atrial diameter, and the planimetric and pressure half time methods to assess the mitral valve area. The transmitral gradient was defined with a continuous wave Doppler in an apical four-chamber view. Colour-flow Doppler was performed to observe the presence and severity of mitral regurgitation (MR). Pulmonary artery systolic pressure was measured by continuous-wave Doppler studies using the Bernoulli equation. The criteria for the diagnosis of RMVD included the mitral valve area ≤ 2.5 cm[2] , the presence of leaflet thickening, commissural fusion, and changing in the subvalvular area, detected by an echocardiogram.[17]

Blood samples were drawn from the antecubital vein during hospital admission. The blood samples of the patients and control groups were taken in the morning after a 12-hour fasting period. All blood samples were collected into tubes containing no additives. Serum was obtained after centrifugation at 1,500 g for 10 minutes and stored at -800C until analysis.

Thiol/disulfide homeostasis was conducted by the procedure determined by Erel et al.[18] Subsequently, free functional thiol groups were obtained with the reduction of disulfide bonds. Sodium borohydride was applied as a reductant, and unused reductant was removed by formaldehyde. After 5, 5′-dithiobis-(2-nitrobenzoic) acid reaction, all thiol groups, both native and reduced, were defined. Dynamic disulfide quantity (−S-S) was confirmed by half of the difference between the native and total thiols. After evaluating the magnitude of native thiol (−SH) and disulfide (−S-S), the disulfide/native thiol (−S-S−/−SH) ratio was calculated.[18]

Statistical Analysis

The normality of data was analyzed using the Kolmogorov-Smirnov test. Quantitative variables with normal distribution were presented as mean and standard deviation. The variables with non-normal distribution were presented as median (interquartile range), and categorical data as number and percentage. Independent samples t-test was used to compare groups for continuous data with normal distribution, whereas the Mann-Whitney U test was performed for variables with non-normal distribution. Categorical data were analyzed using the Chi-square or Fisher’s Exact tests. The relations among the numerical and categorical variables were analyzed with Spearman correlation analysis. Differences were accepted as significant at the two-sided p<0.05 level. All statistical analysis was carried out using the Statistical Package for Social Sciences program (SPSS) for Windows version 22 (IBM SPSS Inc., Chicago, IL).

Results

A total of 146 subjects, of which 92 had RMVD and 54 did not, were included in the study. The demographic, clinical, and laboratory data of the study groups are displayed in Table 1 . In patients with RMVD, a total of 22 (24%) were male and 70 (76%) were female, whereas 15 (28%) patients were male and 39 (72%) were female in the control group. The mean age was 48±10 years and 46.7±11.2 years in the patients with RMVD and control groups, respectively. No differences were found between the groups in terms of age, gender, BMI, HT, DM, smoking, and other laboratory parameters. As expected, the patients with RMVD had higher systolic pulmonary artery pressure (SPAP) and left atrial (LA) diameter levels than in the control group.

Table 1

– Baseline Clinical, Demographic, and Laboratory Characteristics of The Patients with and without Rheumatic Mitral Valve Disease

			Control (n:54)	RMVD (n:92)	p
Age (Median,IQR1-IQR3)			45 (39.3 - 54.5)	48 (42 - 55.8)	0.304m
Sex (n,%)	Male		15 (28%)	22 (24%)	0.604X²
	Female		39 (72%)	70 (76%)
DM (n,%)	No		48 (89%)	88 (96%)	0.133X²
	Yes		6 (11%)	4 (4%)
HT (n,%)	No		46 (85%)	79 (86%)	0.492X²
	Yes		8 (15%)	13 (14%)
Smoking (n,%)	No		40 (74%)	58 (63%)	0.134X²
	Yes		14 (26%)	34 (37%)
BMI (Median,IQR1-IQR3)			24 (22 - 25.8)	24 (21.9 - 25)	0.139m
Glucose (mg/dL) (Median,IQR1-IQR3)			94 (88.5 - 102)	90 (21.9 - 25)	0.054m
Serum creatinine (mg/dL) (Median,IQR1-IQR3)			0.8 (0.6 - 0.8)	0.7 (0.6 - 0.8)	0.128m
Hemoglobin(g/L) (Median,IQR1-IQR3)			14 (13 - 14)	13.8 (12 - 14)	0.509m
WBC count (x1000/mm3) (Median,IQR1-IQR3)			6.4 (5.9 - 7.3)	6.2 (6 - 7)	0.423m
Platelet count (x1000/mm3) (Median,IQR1-IQR3)			300 (254.5 - 348.8)	301 (277 - 313)	0.766m
Total cholesterol (mg/dL) (Median,IQR1-IQR3)			215 (195.3 - 235)	197 (195 - 225)	0.075m
LDL, (mg/dL) (Median,IQR1-IQR3)			120 (103.3 - 125)	114 (100 - 121)	0.086m
HDL, (mg/dL) (Median,IQR1-IQR3)			49 (45 - 55.8)	51 (45.8 - 72)	0.113m
Triglycerides (mg/dL) (Median,IQR1-IQR3)			150 (90.8 - 185)	148 (64 - 150)	0.282m
LVEF,(%) (Median,IQR1-IQR3)			61 (60 - 66)	60 (62.8 - 66)	0.155m
LA, (mm) (Median,IQR1-IQR3)			36 (35 - 37)	43 (38 - 47)	<0.001m
SPAP, (mmHg) (Median,IQR1-IQR3)			20 (18 - 20)	31 (27.8 – 39.3)	<0.001m
Mo/S MR		Absent	54 (100%)	60 (65%)
		Present	0 (0%)	32 (35%)
Severe MS		Absent	54 (100%)	77 (84%)
		Present	0 (0%)	15 (16%)
P-MBVP History			0 (0%)	15 (16%)
Surgical VR			0 (0%)	0 (0%)
MVA			-	2.2 ± 1.3
RAVD			0 (0%)	47 (51%)

BMI: body mass index; DM: diabetes mellitus; HDL: high-density lipoprotein; HT: hypertension; LA: left atrium; LDL: low-density lipoprotein; LVEF: left ventricular ejection fraction; RMVD: rheumatic mitral valve disease; SPAB: systolic pulmonary artery pressure; WBC: white blood cell; Mo/S MR: moderate or severe mitral regurgitation; P-MBVP: prcutaneous mitral balloon valvuloplasty; VR: valve replacement; MVA: mitral valve area; RAVD: rheumatic aortic valve disease (Stenosis or Regurgitation).

Native thiol (407±83 μmol/L vs. 297±65 μmol/L, p<0.001) and total thiol (442±82 μmol/L vs. 329±65 μmol/L, p<0.001) levels were higher in the control group. Disulfide (16.7±4.9 μmol/L vs. 14.8±3.7 μmol/L, p=0.011) levels were elevated in patients with RMVD group. The mean disulfide/total thiol ratios and disulfide/native thiol ratios were higher in patients with RMVD group, while native thiol/disulfide ratios, and total thiol/disulfide ratios were higher in the control group. The levels of native thiol, total thiol, disulfide, disulfide/thiols, and thiols/disulfide ratio between the patients with and without RMVD are shown in Table 2 .

Table 2

– The Level of Native Thiol, Total Thiol, Disulfide, Disulfide/Thiols, and Thiols/Disulfide Ratio Between the Patients with and without Rheumatic Mitral Valve Disease

	Control (n:54)	RMVD (n:92)	p
Total Thiol, (mmol/L) (Mean ± SD)	442±82	329±65	<0.001t
Native Thiol, (mmol/L) (Mean ± SD)	407±83	298± 65	<0.001t
Disulfide, (mmol/L) (Median,IQR1-IQR3)	15.1 (13.4 - 17.6)	17 (14.8 - 19.9)	0.011m
Disulfide/Total Thiol, %x100 (Median,IQR1-IQR3)	3.4 (2.8 - 4)	5.4 (4.3 - 6.6)	<0.001m
Disulfide/Native Thiol, %x100 (Median,IQR1-IQR3)	3.7 (3 - 4.4)	5.8 (4.7 - 7.4)	<0.001m

RMVD: Rheumatic mitral valve disease;

Correlation analysis showed that there were positive correlations between disulfide levels and mitral stenosis severity (mitral valve area <1.5 cm[2] ); between the disulfide/total and the native/thiol ratio with SPAP, LA diameter, and mitral stenosis severity. Furthermore, there were negative correlations between native thiol and total thiol with SPAP, LA diameter, and mitral stenosis severity. Correlation analysis of thiol and disulfide parameters with echocardiographic findings is listed in Table 3 .

Table 3

– Correlation Analysis of Thiol and Disulfide Parameters with Echocardiographic Findings

		SPAB	Severe MS	LA
Native thiol	Spearman’s Rho	-.598	-.319	-.532
	P	<0.001	<0.001	<0.001
Total thiol	Spearman’s Rho	-.596	-.300	-.549
	P	<0.001	<0.001	<0.001
Disulfide	Spearman’s Rho	.135	.188	.107
	P	0.106	0.023	0.201
Disulfide / Native thiol	Spearman’s Rho	.469	.331	.403
	P	<0.001	<0.001	<0.001
Disulfide / Total thiol	Spearman’s Rho	.473	.333	.405
	P	<0.001	<0.001	<0.001

LA: Left atrium; MS: mitral valve stenosis; SPAB: Systolic pulmonary artery pressure

The level of native thiol, total thiol, disulfide, disulfide/thiols, and thiols/disulfide ratio between the patients with and without severe rheumatic mitral valve stenosis (RMVS) is listed in Table 4 . No significant difference was observed in native thiol, total thiol, and disulfide between the patients who had mild to moderate MS and severe MS or percutaneous mitral valvuloplasty history. However, disulfide/total and disulfide/native thiols ratios were significantly higher in patients with severe MS or percutaneous mitral valvuloplasty history. On the other hand, any significant difference in native thiol, total thiol, disulfide levels, and disulfide/total and disulfide/native thiols ratios was not observed according to the patients’ severity of mitral regurgitation.

Table 4

– The Level of Native Thiol, Total Thiol, Disulfide, Disulfide/Thiols and Thiols/Disulfide Ratio Between the Patients with and without Severe Rheumatic Mitral Valve Stenosis

	Mild-Moderate MS (n:62)	Severe MS or P-MBVP History (n:30)	p
Total Thiol, (mmol/L) (Mean ± SD)	335±66	317±62	0.125t
Native Thiol, (mmol/L) (Mean ± SD)	304±67	282±59	0.215t
Disulfide, (mmol/L) (Mean ± SD)	17±5	19±7	0.093t
Disulfide/Total Thiol, %x100 (Mean ± SD)	5.2±1.7	6.1±2.1	0.045t
Disulfide/Native Thiol, %x100 (Mean ± SD)	5.8±2.1	7.1±3.7	0.048t

MS: Mitral Stenosis; P-MBVP: Percutaneous Mitral Balloon Valvuloplasty;

Discussion

Plasma thiol levels were significantly lower in patients with RMVD, when compared to the control group. Disulfide levels and the disulfide/thiols ratio were higher in patients with RMVD. To th best of our knowledge, this is the only study that has evaluated thiol/disulfide homeostasis as a new predictor, which was more closely related to RMVD and the severity of MS.

RHD and RMVD are the severe complications of acute rheumatic fever and lead to chronic valvular lesions causing the morbidity and mortality.[2] RHD holds a crucial part of the health burden in many developing countries.[19] RMVD has a complex mechanism, the main ones of which are chronic inflammation and autoimmune reactions.

The previous studies have reported convincing evidence that there has been a progressive inflammation in RHD, and this persistent inflammation has led to damage to the valvular tissue.[7] Several studies assessed chronic inflammation markers in RHD patients. Some of these studies showed that elevated serum levels of hsCRP and Pentraxin-3 could be considered as markers of inflammation in RMVD patients than in healthy subjects.[20 , 21] In a recent survey, the neutrophil-to-lymphocyte ratio (NLR) was significantly higher in patients with severe RMVD than in patients with mild to moderate RMVD.[22]

Recent studies have shown that there were possible interactions between interleukins and chronic inflammation, including RHD development. Davutoglu et al. and Bilik et al. demonstrated that patients with RMVD had elevated plasma levels of tumor necrosis factor-alpha (TNFa), IL-2, IL-6, IL-8, and IL-17, IL-23 as predictors of progressive inflammation and autoimmune response than in healthy subjects.[23 , 24] In previous studies, plasma and tissue oxidative stress markers were investigated in patients with RHD. They determined that levels of advanced oxidation protein products were higher in RHD patients than in controls.[25 , 26] Furthermore, our study was the first to assess novel oxidative stress markers thiol-disulfide ratio role in patients with RHD.

Oxidative stress (OS) is the imbalance between reactive oxygen species (ROS) and antioxidant substances; it may be toxic to cells by leading to membrane lipid peroxidation and membrane injury.[27 , 28] Thiols are significant antioxidants and play a substantial role in the non-enzymatic elimination of ROS.[10 , 13] Although protein thiol oxidations have been considered undesirable side reactions of oxidative stress, the identification of redox-regulated proteins showed that reversible thiol modifications were important to adjust their activity to the prevailing redox conditions of the environment.[29] Defining the functional importance of thiol modifications remains a significant challenge in the field, and still requires biochemical studies in different cases and diseases.

Recently, the significance of disulfide/thiol homeostasis has been demonstrated by various studies. One of these studies, by Kundi et al.,[14] showed that the disulfide/thiol ratio elevated in AMI, and the authors concluded that this value could be used as a predictor for the detection of acute myocardial injury.[14] In another study, Topuz et al. demonstrated that thiol/disulfide homeostasis might change during acute pulmonary thromboembolism. Moreover, this might be related to impaired hemodynamic measurements.[30] Several studies reported that decreased thiol concentrations and thiol/disulfide ratio might be a crucial factor in the development of atherosclerosis, coronary artery ectasia (CAE), and chemotherapy-induced cardiac toxicity.[15 , 31 , 32] Briefly, the authors concluded that oxidative stress may well involve the main factor of pathogenesis. In our study, thiol levels and the thiol/disulfide ratio are related to RMVD and the severity of rheumatic mitral valve involvement, confirming the hypothesis that the rheumatic valve is the cause of oxidative stress in addition to chronic inflammation.

To the best of our knowledge, this is the first study to evaluate the relationship between thiol/disulfide homeostasis and its impacts on RHD, as well as the intensity of valve damage in patients with RMVD. Our findings showed that thiol/disulfide homeostasis could play an essential role in the pathophysiology of rheumatic valve damage. Definitive information about the topic could be provided with in-vivo and in-vitro tissue studies.

Limitations

The present study has several limitations. First, a relatively small sample size restricted the generalizability of the findings of our research. The lack of follow-up data and serial changes in thiols, and the absence of simultaneous measurement of another novel autoimmune and inflammatory mediators are other limitations. Thiol/disulfide values did not compare with other enzymatic and non-enzymatic oxidative stress markers. Finally, the study could be enhanced by adding genetic polymorphisms in patients with RMVD.

Conclusions

The present study is the first to show the association between thiol levels and thiol/disulfide homeostasis in patients with RMVD. Our findings demonstrated its possible role in the severity of valve damage and in the pathophysiology of RMVD.