[The role and research progress of NOTCH1 in T-cell acute lymphoblastic leukemia].

急性T淋巴细胞白血病（T-ALL）是一组异质性极强的血液系统恶性肿瘤，在儿童和成人ALL中分别占10%~15%和20%~25%[1]。成人T-ALL由于原发化疗耐药以及早期复发等原因致预后不良，5年无事件生存（EFS）率仅为20%~50%[1]。目前对T-ALL发病机制的相关研究还很欠缺，同时缺少大样本的临床试验，缺乏有效的靶向药物和免疫治疗策略，导致T-ALL的基础和临床研究进展受限。值得注意的是，在60%以上的T-ALL患者中鉴定出NOTCH1基因功能获得性突变，导致非配体依赖性和持续激活的NOTCH1受体信号转导，为T-ALL的治疗干预提供了新思路[2]。迄今为止，NOTCH1是T-ALL基础研究中最为热门的癌基因之一。本文将重点对NOTCH1在T-ALL发病中的作用和最新研究进展作一综述，并对新型NOTCH1靶向治疗在临床上的应用前景进行了展望。

一、NOTCH1的结构和生理功能

人类NOTCH1基因位于染色体9q34.3区，其编码的蛋白属于异源二聚跨膜受体，可将胞外信号转化为核内基因表达变化，是一种配体激活的转录因子。作为NOTCH蛋白家族成员之一，NOTCH1受体蛋白由2555个氨基酸残基组成，相对分子质量约为272.5×103，其结构分为胞外结构域和跨膜胞内区域。胞外结构域主要由表皮生长因子样（endothelial growth factor-like，EGF-like）重复序列和Lin Notch重复序列（Lin Notch repeats，LNR）组成；跨膜胞内区域由核定位信号（nuclear localization signal，NLS）、RAM（RBP2J kappa associated molecular）基序、锚蛋白重复序列（ankyrin repeats，ANK）、翻译启动区（translational active domain，TAD）和末端PEST结构域（proline，glutamic acid，serine，and threonine domain，PEST）5部分组成[3]。目前已发现与NOTCH1相结合的五种配体为Delta样家族（DLL 1/3/4）和Jagged家族（Jagged 1/2）。

NOTCH1蛋白的成熟和激活实质上是一系列蛋白质酶切水解的过程。NOTCH1蛋白的成熟是由分泌途径中的弗林蛋白酶样转化酶（furin-like convertase）介导的：高尔基体内的弗林蛋白酶样转化酶在识别RQRR氨基酸序列之后，使NOTCH1前体蛋白在细胞外的S1位点处发生裂解，所得的多肽以异源二聚体（p120/p200）的形式存在于细胞表面。而NOTCH1的激活则需涉及到位于ala1710、val1711之间的S2和gly1743、val1744之间的S3两个位点的蛋白酶解，这是一个多步骤的连续过程。在细胞膜表面，NOTCH1蛋白受体与其同源配体相互作用引起构象改变，并被ADAM金属蛋白酶（S2）和γ-分泌酶复合物（γ-secretase complex，GSC）（S3）裂解两次，在S2位点的切割产生称为NEXT（Notch extracellular truncation）的瞬时中间肽，最终使释放的NOTCH1胞内结构域（intracellular NOTCH1，ICN1）移位至细胞核，与RBPJ（recombination signal binding protein for immunoglobulin Kappa J region）/RBPSUH（recombining binding protein suppressor of hairless）蛋白形成转录激活复合物后进而激活下游特定靶基因的表达，由此产生许多生物学效应[4]。

NOTCH信号通路是一种进化上保守的细胞间信号传导途径，在调节细胞分化、增殖、凋亡和个体发育中起着关键作用。研究表明，NOTCH1参与正常造血谱系特异性分化和血管生成，尤其对于正常T、B谱系选择分化至关重要。Notch受体-配体相互作用与pre-TCR（pre-T cell receptor）信号一起驱动不可逆的T系造血分化，是胸腺中CD4+和CD8+细胞生成的主要调节因子[5]。另外，经典的NOTCH1转录信号负调控内皮细胞的增殖、迁移以及血管新生[6]。近年，有学者利用灌注微血管的工程有机模型并在小鼠模型中验证后发现，NOTCH1跨膜受体的激活还可以直接通过一种非典型的、不依赖转录的信号传导机制驱动黏附连接组装、直接调控血管屏障功能[7]。

二、NOTCH1在T-ALL发生、进展中的作用机制

1．NOTCH1在T-ALL中被异常激活：Ellisen等[8]在1991年首次发现，大约1%的T-ALL患者存在一种罕见的t（7;9）（q34;q34.3）染色体异常，将ICN1融合到TCRβ启动子/增强子处，产生截短和组成型活性NOTCH1等位基因。

随后，Weng等[2]于2004年首次报道超过50%的T-ALL患者存在NOTCH1功能获得性突变，主要包括异二聚体（heterodimerization，HD）结构域和PEST结构域的错义突变、框内缺失或插入突变等。他们的发现极大地拓展了活化NOTCH1在人类T-ALL发病机制中的作用，并为干扰NOTCH1信号传导的靶向疗法提供了强有力的依据。T-ALL中的LNR突变、HD结构域突变、近膜延伸（juxtamembrane expansion，JME）突变会破坏受体的负调控区，引起不依赖配体的蛋白构象变化，使S2裂解位点从疏水性口袋中直接暴露出来，从而导致NOTCH1的转录活性形式，即ICN1的产生增多；PEST突变导致NOTCH1受体上位于C末端的PEST域被截短，ICN1无法经泛素蛋白酶体途径介导的蛋白降解而积累增多，NOTCH1信号终止受阻，也同样引起不依赖配体的NOTCH1组成性激活[4]。以上两种途径均能触发T-ALL的发生。

2007年，O'neil等[9]在10%~15%的T-ALL临床样本中发现FBXW7基因突变，突变后的E3泛素化连接酶FBXW7不识别NOTCH1受体末端PEST结构域中的磷酸化基序，因而不能介导ICN1泛素化和随后的蛋白酶体降解。这使得细胞内ICN1稳定性增加、半衰期延长，从而造成T-ALL中异常激活的Notch信号传导。有研究还发现，多种NOTCH1突变驱动的激活机制组合起来发挥作用时具有协同作用，可产生异常高水平的NOTCH1激活信号，加速T-ALL的发展[3]。

此外，Schwanbeck[10]和Ferrante等[11]最近发现，组蛋白去乙酰化酶3（HDAC3）通过对ICN1的去乙酰化作用，正调控ICN1蛋白的稳定性。这说明NOTCH1通路还可以通过表观遗传学调控，为其激活提供了另一种途径。

在小鼠和斑马鱼模型中也进一步证明了异常活化NOTCH1可以诱导T-ALL的发生[12]。这些发现均表明NOTCH1信号失调与T-ALL的发病机制直接相关。

需要注意的是，有一些研究发现NOTCH1突变是亚克隆性的，可以在初诊时不发生而在复发时才发生，甚至可以在复发时发生突变类型的转换。这说明NOTCH1突变有时是可以作为白血病发生中的继发性事件获得的，因此需要谨慎地将其用作独立的微小残留病（MRD）标志物[13]。近年，De等[14]通过单细胞测序等实验发现，NOTCH1突变通常是T-ALL疾病一系列基因组损伤中相对晚期发生的事件，且不一定在所有亚克隆群中都存在，这些也可能成为限制靶向NOTCH1治疗疗效的原因。

2．主要的下游分子调控机制：越来越多的研究开始关注于关键的NOTCH1下游信号和促成T-ALL发病的靶基因。在T-ALL中，激活的NOTCH1可通过PI3K/AKT/mTOR、NF/κB和MYC等多条通路来促进白血病的发生[5],[15]–[16]。

（1）NOTCH1与PI3K-AKT-mTOR通路：NOTCH1可以激活T-ALL中PI3K-AKT-mTOR致癌信号通路，导致细胞代谢、增殖、存活、分化和凋亡减弱。主要通过以下方式：①作为PI3K-AKT信号的新型调节因子，PP2A（protein phosphatase 2A）已被确定为NOTCH1基因的下游靶标，NOTCH1通过激活PP2A增加AKT、AMPK和p70S6K的去磷酸化；②抑癌基因PTEN（10q23）的丧失功能突变或缺失在T-ALL中也很常见，可导致PI3K-AKT-mTOR1信号的长期持续激活、GSI抵抗以及P53介导的细胞凋亡的抑制等；③在野生型PTEN的T-ALL中，NOTCH1本身可能调节PTEN的翻译后失活，或者通过直接转录抑制下调PTEN的表达以增强PIP3信号传导，继而磷酸化AKT蛋白的Ser473；④NOTCH1还可以通过上调IGF1R（insulin-like growth factor 1 receptor）和IL7Rα（interleukin-7 receptor subunit α）的水平，招募PI3K并启动PI3K-AKT的信号级联反应[15]。接下来，哺乳动物雷帕霉素复合物靶蛋白1（mTOR1）是NOTCH1和PI3K-AKT信号转导途径的主要汇集点，AKT进一步磷酸化PRAS40（proline-rich Akt substrate of 40 kDa），使其对mTOR的抑制作用失效而激活mTOR信号。PI3K-AKT-mTOR通路的激活可以与NOTCH1协同作用，促进白血病的发生和发展，并可减少白血病细胞增殖对NOTCH信号的依赖程度[17]。

（2）NOTCH1与NF-κB通路：经典的NF-κB信号通路已被描述为NOTCH1致癌功能的关键下游介质，激活IκB激酶（IκB kinase，IKK）复合物，导致NF-κB途径的激活，继而上调下游靶基因的转录水平。Wu等[16]还发现NOTCH1可以激活Asb2（Ankyrin repeat and SOCS box protein 2）的转录，然后刺激T-ALL细胞NF-κB中IκBα（Nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor-alpha）的降解和解离而发挥其作用。NF-κB途径在人T-ALL中异常活跃，并且已通过细胞系和动物模型证实对该通路的阻断可有效地限制具有活化NOTCH1突变白血病细胞的生长。这些发现表明NF-κB途径在NOTCH1的下游起作用以促进白血病细胞的生长，并且是潜在的治疗靶点。

（3）NOTCH1/MYC调控轴：ICN1入核后可作为转录因子直接激活一系列下游靶基因。其中，在众多肿瘤中发挥作用的原癌基因MYC已被证实是NOTCH1的下游靶基因，具有NOTCH1激活突变的T-ALL患者过表达MYC。NOTCH1通过一种高度进化保守的调控元件NMe（NOTCH1 dependent MYC enhancer）与MYC启动子中的近端调节序列直接相互作用，形成长距离染色质环，直接激活MYC表达[18]。对染色质标记的分析表明，NMe是位于MYC基因座+1，427 kb端粒的远端增强子，只能在T细胞中被选择性地激活，由此表明NMe是一种依赖于NOTCH1的T细胞特异性的超级增强子，并且被鉴定为是直接参与人类白血病发病机制的远程致癌增强因子，这些研究结果突出了NOTCH1-MYC调控轴在T细胞转化以及T-ALL中选择治疗靶点的重要性[5]。

（4）NOTCH1与其他下游靶基因：NOTCH1可以通过多种机制负调控T-ALL中抑癌基因P53的水平和活性。在9p21片段完整的T-ALL患者中，ARF（auxin response factor）通过靶向破坏MDM2（murine double minute2）来稳定P53，而ICN1的诱导性表达降低了ARF的水平，继而下调P53的表达水平；而在大多数9p21处CDKN2A缺失或突变的情况下，NOTCH1则通过另外一种机制来调节P53，由mTOR1信号下游的真核翻译起始因子eIF4E介导从而抑制P53在Ser15、Ser20和Ser392处的激活磷酸化，以及P53的核定位[15]。但有趣的是，P53错义突变在复发性T-ALL患者中更为常见（7%~28%），这与小分子γ-分泌酶抑制剂（γ-secretase inhibitors，GSI）耐药机制等相关[19]。

CD44上调是持续的NOTCH1信号传导的最早标志之一，研究人员由此鉴定黏附分子CD44为NOTCH1的直接下游靶标；同时，抗CD44抗体在T-ALL异种移植小鼠模型中观察到有效的治疗效果，这同样对复发T-ALL的疾病治疗具有借鉴意义[20]。致癌活性的NOTCH1还可以直接与SHQ1的启动子结合并激活其转录，SHQ1耗竭会削弱广泛的RNA剪接，引起包括MYC在内的一些基因的明显下调；而过表达MYC可显著挽救因SHQ1失活导致的T-ALL细胞死亡，阐明了SHQ1在RNA剪接和T-ALL发生中的关键作用[21]。

此外，其下游靶基因还包括Hes1（hairy and enhancer of split-1）、Cyclin D、NRARP（NOTCH-regulated ankyrin repeat protein）、RUNX3（runt-related transcription factor 3）、DEPTOR（DEP-domain containing mTOR-interacting protein）和USP7（ubiquitin-specifific protease 7）等，同时这些下游靶基因也是T-ALL发病过程中至关重要的调控因素[22]–[25]。

三、NOTCH1突变与T-ALL预后评估

NOTCH1突变最初在2006年被报道与T-ALL患者的预后相关，但也有研究认为NOTCH1突变并不影响T-ALL的临床结局和预后[26]–[27]。GRAALL研究小组证实NOTCH1/FBXW7（F-box/WD repeat-containing protein 7）突变组患者预后良好，可作为T-ALL个体治疗分层的依据[28]。之后的一些临床研究也发现NOTCH1/FBXW7突变是影响患者EFS和总生存（OS）率的良好预后因素[29]–[31]。2009年发表的UKALLXII/ECOG2993研究结果显示单独分析NOTCH1或FBXW7突变对预后没有影响；两者结合分析后发现：尽管NOTCH1和（或）FBXW7突变组成人T-ALL患者（58例）的EFS和OS率有高于NOTCH1和FBXW7野生组患者（30例）的趋势，但差异均无统计学意义（EFS：51%对27%，P=0.10；OS：54%对41%，P=0.30），这个结果可能和样本量较少有关[32]。此外，在儿童T-ALL中，EORTC-CLG临床试验也报道过类似的结果：NOTCH1/FBXW7突变对治疗的早期反应具有积极的影响，但突变组和野生组患者的5年EFS和5年OS率差异无统计学意义[33]。在成人T-ALL中，2013年的法国多中心随机临床研究GRAALL-2003和GRAALL-2005发现，在NOTCH1和FBXW7突变的基础上，结合RAS/PTEN基因突变的检测可明显增加预后指导价值：在RAS和PTEN未突变的前提下，伴有NOTCH1/FBXW7突变的患者预后更好；相反，NOTCH1/FBXW7无突变或伴有RAS/PTEN突变则提示预后不良[34]。

NOTCH1在T-ALL的预后指导方面存在争议，有可能是各临床研究报道的患者数量相对较少、患者种族、不同研究在治疗方法上的差异等所造成的[26]–[36]。随着临床试验中患者样本的扩大、治疗方案的改进、现代分子生物学和各种高通量测序手段的迅猛发展等，NOTCH1对T-ALL的预后意义将会越来越明确，有利于优化预后分层，及时调整治疗策略。

四、NOTCH1分子靶向治疗

抑制NOTCH1可诱导伴NOTCH1突变的T-ALL细胞系发生细胞周期阻滞、细胞凋亡等，同时在T-ALL动物模型中也显示出强大的抗白血病作用[3]。这些临床前研究为NOTCH1抑制剂治疗T-ALL提供了理论依据，目前临床上正在利用多种不同的策略来开发抑制NOTCH1受体本身或NOTCH1信号通路的其他组成部分的靶向药物[37]。

1．小分子抑制剂：第一代NOTCH1抑制剂是一种小分子GSI，它可以通过阻断GSC对NOTCH1受体S3位点的裂解步骤来有效抑制NOTCH信号传导。然而，针对GSI的多项早期临床试验仅表现出有限的抗白血病作用，剂量限制的靶标毒性和原发耐药性迅速出现，且消化道等不良反应严重[38]。这是因为非选择性NOTCH1抑制剂同时阻断NOTCH1和NOTCH2，对肠上皮的靶向作用引起肠道毒性反应[39]。

PSEN1（presenilin-1）是某些γ-分泌酶复合物的组成部分，在T-ALL中高表达。最近有一项研究发现选择性PSEN1抑制剂MRK-560处理T-ALL细胞系可有效减少突变的NOTCH1激活并导致细胞周期阻滞，显著降低PDX小鼠模型中的白血病负荷并延长OS期，而无任何相关的肠道毒性[40]。

另外，近年有研究尝试通过酯键将叶酸与SERCA（sarco-endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase）抑制剂thapsigargin的醇衍生物缀合，这种优化后的靶向药JQ-FT被胞膜上的叶酸受体识别后作为有效的抗白血病药物被递送至白血病细胞，进而靶向突变的NOTCH1受体，影响S1位点的切割，干预突变体NOTCH1异二聚体的正确折叠[41]。同时，新一代的选择性SERCA抑制剂CAD204520可在T-ALL的体内、外模型中实现抑制NOTCH1突变白血病细胞的生长且无Ca2+相关的心脏毒性，支持针对Notch依赖性癌症的SERCA抑制剂的开发和应用[42]。

2．NOTCH1抑制性抗体：目前的研究涉及到针对NOTCH1受体、配体、GSC的单克隆抗体。针对NOTCH1受体负调控区的抑制性单克隆抗体OMP-52M51能够干扰金属蛋白酶ADAM10依赖性的加工过程，阻断NOTCH1信号传导，而不会影响NOTCH2的活性[43]。Minuzzo等[44]的一项研究发现针对NOTCH1配体DLL4的抗体可以干扰配体诱导的NOTCH1信号的激活，消除T-ALL异种移植小鼠模型体内白血病细胞的生长并增加其凋亡。针对NOTCH1受体胞外域的特异性抗体也正在临床前研究阶段[45]。此外，针对γ-分泌酶NCT（nicastrin）胞外域的单克隆抗体A5226A通过与体外底物结合竞争来抑制GSC的活性，下调NOTCH1信号传导活性，并在T-ALL异种移植模型中显示出抗癌作用[46]。

与上文小分子抑制剂GSI相比，NOTCH1抑制性抗体由于特异性更好，对肠道隐窝祖细胞无影响，可避免GSI引起的肠道毒性反应，具有更好的安全性和更明显的优势，成为GSI之后的研究热点和新型治疗策略[43],[45]。

3．合成肽：除上述几类外，还有一类合成肽类的NOTCH1拮抗剂。Moellering等[47]的研究表明其合成的烃类短肽SAHM1是一种MAML1（dominant negative Mastermind-like 1）衍生物，可以高亲和力与MAML1竞争性结合并阻止NOTCH1活性转录复合物ICN1-CSL（cBFl/suppressor of Haidess/Lag-1）的组装，从而有效消除后续NOTCH1下游转录程序的激活；在白血病小鼠实验中未发现明显的不良反应，但仍需临床试验进一步评估安全性和有效性。

4．其他药物：鉴于第一代NOTCH1抑制剂需要克服的困难，也有学者试图寻找与其他药物联用或间接拮抗NOTCH1活性的策略。目前基础研究结果显示出有不少药物能协同增强NOTCH1抑制剂在T-ALL细胞系和疾病模型中的抗肿瘤作用，如PI3K-AKT-mTOR通路的抑制剂雷帕霉素、NF-κB抑制剂Parthenolide、BET（bromodomain and extra terminal domain）抑制剂、HDAC抑制剂和醉茄素A等[3],[48]–[49]。Khoshamooz等[50]发现，同时抑制NOTCH1和PI3K/AKT信号通路在T-ALL细胞中具有协同作用，有望成为T-ALL的一种治疗手段。Sanchez-Martin等[48]在一个基于表达的虚拟药物筛选中发现并验证了NF-κB抑制剂可以提高GSI的抗白血病活性。此外，近年有研究发现热休克蛋白90（HSP90）选择性抑制剂处理T-ALL细胞后可导致ICN1蛋白不稳定、显著降低ICN1水平，从而提供了拮抗致癌NOTCH1信号传导的一种替代策略[51]。

HDAC抑制剂是目前国内外研究、应用较多的药物。纳摩尔浓度级别的HDAC抑制剂即可导致ICN1蛋白和NOTCH1靶基因的下调，并伴随着组蛋白乙酰化的局部降低[11]。Waibel等[52]发现，泛HDAC抑制剂帕比司他可通过间接靶向NOTCH1驱动的转录网络（包括Myc的下调）影响T-ALL细胞的增殖和存活，显著降低T-ALL小鼠模型的肿瘤负荷，延长生存期。目前国外上市的泛HDAC抑制剂帕比司他、伏立诺他和贝利司他均处于临床试验阶段，结果尚未公布（ClinicalTrials.gov）。国产原研西达本胺可选择性抑制HDAC1/2/3/10，有效诱导体外培养的T-ALL细胞系线粒体功能障碍、坏死和凋亡，目前也已进入临床试验阶段（ChiCTR1800015885等）[53]。近期国内一项西达本胺临床试验共入组17例复发难治T-ALL/LBL患者，NOTCH1突变率约55%，结果令人鼓舞：与19例接受化疗的历史对照组相比，使用西达本胺联合化疗的患者在1个疗程后总有效率（ORR）达到71%，2个疗程后完全缓解（CR）率为65%，2年无进展生存（PFS）率为54.2%，均明显高于对照组（ORR为42%，CR率为37%，PFS率为23.2%）；11例获得CR的患者中有9例接受了异基因造血干细胞移植[54]。这些研究结果提示HDAC抑制剂联合化疗可能是针对T-ALL的极有前景的治疗策略。

五、小结与展望

NOTCH1突变在T-ALL的发生和进展机制中起着核心作用，以NOTCH1为靶点的治疗显示出有效的抗白血病活性。然而，目前有关NOTCH1的各种基础和临床研究仍存在许多问题需要解决，譬如更多的下游靶基因和确切的发病机制还有待于进一步探索，靶向NOTCH1的更为安全有效的治疗策略亟待进一步设计开发等。在T-ALL中，调节ICN1蛋白稳定性和活性的关键步骤取决于其翻译后修饰过程中PEST结构域的磷酸化和FBXW7-E3泛素连接酶的募集，那么是否可以从其降解途径下调已激活的NOTCH1信号也是解决这一难题的新思路。