Serological Tests in Chagas Disease: Another Enigmatic Evidence in a Disease Largely Neglected.

Cardiologistas e Gastroenterologistas atuando em ambientes variados da Faculdade de Medicina da USP em Ribeirão Preto frequentemente deparam-se com pacientes apresentando características epidemiológicas, clínicas e laboratoriais sugestivas da doença de Chagas (DC), mas os testes sorológicos específicos são negativos.[1] Em série de 65 pacientes estudados de 01/07/2011 a 31/12/2012 com coronariografia invasiva para esclarecer o sintoma cardinal de dor precordial, todos com alterações de mobilidade segmentar ventricular (incluindo 28 com o típico aneurisma apical na ventriculografia de contraste radiológico) a sorologia com dois testes foi positiva em apenas 11(17%) dos casos.[2] Como elucidar esse enigma, e como conduzir tais casos? A resposta talvez esteja, em parte, na experiência com esta entidade, e no conhecimento e convicção sobre a acuidade diagnóstica dos testes sorológicos empregados.

Mas o problema da questão se inicia com a assimetria conceitual que paira sobre a incerteza envolvendo o diagnóstico rotineiro de DC pela verificação sorológica de anticorpos antiparasitários. Assim, de acordo com diretrizes aceitas,[3 , 4] enquanto um teste negativo seria suficiente para afastar o diagnóstico (inclusive autorizando doação de sangue ou órgãos sólidos), a necessidade de dois testes sorológicos positivos com métodos distintos para confirmação diagnóstica da DC foi há muito reconhecida e implementada em rotinas clínicas e de pesquisa; tal se justificaria devido à heterogênea acurácia (média da sensibilidade e especificidade) dos testes, ex. fixação de complemento, hemaglutinação indireta, imunofluorescência indireta e aglutinação direta).[5] Mesmo com o surgimento da quimioluminescência baseada em ELISA, método automatizado para eliminar o componente subjetivo daqueles testes acima citados, a recomendação de utilizar dois testes distintos simultaneamente, seguido de um terceiro em caso de discordância inicial, persiste na recomendação da Organização Panamericana de Saúde.[6] Contraditoriamente, nota técnica da Organização Mundial da Saúde recomendou a utilização de um único teste baseado em ELISA, por quimioluminescência para “screening” em bancos de sangue, apoiada na alegada muito alta sensibilidade (seria próximo de 99%), e com o intuito de reduzir custos ao realizar grande volume de testes de triagem em hemocentros e demais bancos de sangue.[7] Contudo, há evidências bem documentadas de que tal protocolo possa ser inadequado.[8]

O estudo publicado[9], apresenta dados oriundos de hemocentros no Estado do Ceará relativos a sorologia para DC ao longo de extenso período temporal e reaviva a evidência suscitada por algumas reflexões inquietantes:[10]

Considerando ser essa região endêmica, com transmissão vetorial ainda ativa pelo próprio relato dos Autores, chama atenção o elevado número de exames inconclusivos (70%) nos considerados doadores inelegíveis, e levantando a possibilidade de reação cruzada com leishmania spp , também endêmica na região, e que poderia ser responsável, pelo menos em parte, por resultados tão intrigantes.[11] Mas é importante, desde já, enfatizar que pelo relato dos Autores, a inconclusividade inicial foi decorrente de um único teste ELISA que não seria nem positivo nem negativo. Isso é diferente de inconclusividade decorrente de dois testes sendo um positivo e outro negativo, situação reconhecida habitualmente em diretrizes.

Caracteristicamente no trabalho em pauta, a repetição do mesmo teste baseado em ELISA em segunda coleta mostrou que de 1.225 testes positivos ou inconclusivos pelo primeiro teste, em apenas 425 pacientes os resultados persistiam positivos ou inconclusivos. Isso sugere baixa reprodutibilidade, algo preocupante, e indiretamente corroborado pelo relato de que 43% dos excluídos no primeiro exame já haviam sido doadores. Assim, a negatividade no exame de triagem da doação anterior teria levado a potencial recepção de material oriundo de paciente “falso-negativo” para doença de Chagas.

Ainda, destes 425 pacientes dentre os 1.225 com resultados positivos (333) ou inconclusivos (92) persistindo após os dois primeiros testes baseados em ELISA na primeira e segunda amostras, foram escrutinizados outra vez nesta segunda amostra sanguínea com nova sorologia, desta feita com diferente método sorológico (imunofluorescência ou Western blot ), verificou-se que 305 foram negativos, 48 inconclusivos, e apenas 72 persistiram com testes positivos com base no terceiro exame sorológico.

Então, apenas houve concordância em 28% dos casos, cotejando-se os primeiros e os últimos testes. Afinal, os doadores assim aprovados são ou não portadores de DC? E os rejeitados como doadores, que probabilidade básica de DC possuem?

Verifica-se, portanto, nítida necessidade de aprimoramento no diagnóstico sorológico, pois a transmissão transfusional em nosso meio tem incidência incerta, por conta da paucidade de sintomas da fase aguda da DC, que muitas vezes se manifesta como quadro febril inespecífico, não incomum em pacientes hospitalizados. A transição para a forma indeterminada e a evolução ulterior para formas clínicas é tardia e pode não ser identificada se não forem feitas buscas ativas. Em tempos remotos descreveu-se a ocorrência de contaminação em 6 (25%) de 24 casos que receberam transfusão contaminada, tendo um caso desenvolvido sinais clínicos de miocardite na fase aguda.[12] Mais recentemente, casos graves foram descritos em outros países.[13] No que tange à transmissão associada a transplantes de órgãos sólidos infectados, com a concomitante imunossupressão, não são infrequentes manifestações graves e potencialmente letais na fase aguda.[14] Além disso, também pode se dar reativação da doença em receptor insuspeito de portar DC, quando a ausência de um teste padrão-ouro para diagnóstico contribui para as ocorrências mencionadas.

A caracterização pela Organização Mundial da Saúde da DC como “negligenciada” adquire certamente mais força com a constatação de que, 50 anos após o estabelecimento de testes obrigatórios para doadores em nosso meio, ainda se verifica o descarte de bolsas por conta do elevado número de testes inconclusivos. Os impactos sociais e financeiros desta “inconsistência” sorológica estão para serem determinados.

De toda forma, essas duas vertentes do dilema imposto pela incerteza são imanentes ao contexto de situações enigmáticas envolvendo diagnóstico quando inexiste padrão-ouro, e a acurácia de todo teste empregado no “mundo-real” vá ser aferida em ambiente amostral diverso daquele em que o teste foi padronizado. Assim, persiste por se comprovar cabalmente a correção da suficiência de apenas um teste negativo de alta sensibilidade para excluir a DC.[15] Além disso, mesmo o algoritmo sucessivo (teste positivo de alta sensibilidade seguido de outro, com alta especificidade) para comprovação diagnóstica[16] parece desafiado por evidências como as agora publicadas nos ABC por pesquisadores do Ceará.

Cardiologists and Gastroenterologists acting in distinct environments of our institution in Ribeirão Preto, not infrequently face patients with epidemiologic, clinical and laboratorial features of Chagas Disease (CD) in whom serological evaluation is negative for the disease.[1]In a series of 65 patients evaluated between 07/01/2011 and 12/31/2012 by invasive coronary angiography to elucidate the cardinal symptom of chest pain, all with wall motion abnormalities (including 28 presenting the typical apical aneurysm at contrast ventriculography), two distinct serological tests were positive in only 11(17%) patients.[2]How can we elucidate this enigma and provide guidance in this situation? The answer may be, in part, in the experience with this entity and in the knowledge and confidence in the diagnostic accuracy of the serological tests employed.

The hitch point begins with the asymmetrical concepts leading to uncertainty that involve the routine diagnostic procedures of CD by using serological verification of antiparasite antibodies. In accordance to current guidelines,[3 , 4]only one negative test is enough to exclude the diagnosis (granting blood donation or solid organ transplantation), while two distinct positive serological tests are needed to confirm CD diagnosis. This is an ancient practice in clinical and research routines, due to the heterogeneous accuracy (mean of sensibility and specificity) of the tests/ e. g. complement fixation, indirect hemagglutination, indirect immunofluorescence and direct agglutination).[5]Even after the development of chemiluminescence methods based on ELISA, capable of automated reading to avoid subjective interpretation as seen in the above-mentioned tests, the rule of two simultaneous distinct tests followed by a third one if a discordant result is obtained, remains in the latest PAHO guidelines for diagnosis of CD.[6]A conflicting technical note from the WHO recommended a single ELISA test for screening in blood banks, supported by its alleged high sensitivity (nearly 99%) and as a way of cost reduction when dealing with a high volume of screening as occurs in blood centers and blood banks.[7]Nevertheless, well-documented evidence exists suggesting that this protocol may not be entirely adequate.[8]

The study published in this issue of Arquivos Brasileiros de Cardiologia,[9]presents data from blood centers in Ceará state related to CD serological tests in an extensive period and renew the evidence leading to some unsettling reflections:[10]

Since it is an endemic region with vectorial transmission still present by the Authors report, the strikingly high number of inconclusive tests (70%) in those donors considered ineligible, rises the possibility of a cross reaction with leishmania spp , also endemic in the region, that could be responsible, at least partially, for those so intriguing results.[11]It is relevant, from now on, to emphasize that from the Authors report, the initial inconclusive result was based in only one ELISA neither positive nor negative. This is distinct from an inconclusive result of two tests, one positive and other negative, a common finding in clinical guidelines.

Characteristically in the present paper, the repetition of the ELISA test in a second sample in 1,225 previously positive or inconclusive results, only in 425 samples remained positive or inconclusive. This result suggests low reproducibility, a concerning result reinforced by their report that 43% of those excluded in the first test had previously donated blood. This indicates that the negative result in the first screening test led to the potential acceptance of a CD false-negative donor.

Furthermore, those 425 donors with positive (333) or inconclusive (92) results after two ELISA tests in two distinct samples, had their second sample submitted to another serological test (immunofluorescence or Western blot ). In this third test, 305 were negative, 48 inconclusive and only 72 remained positive.

In summary, there was a concordance of only 28% between the first and last tests. Can we state that those approved as donors are free of CD? What about those excluded as donors, what is their basic probability of having the disease?

There is clearly the necessity of improvement in serological diagnostic tests since transfusional transmission of CD in our country remains uncertain, due to the paucity of symptoms in the acute phase of CD, mainly a non-specific febrile condition commonly seen in hospitalized patients. The transition to the indeterminate form and its ulterior clinical forms occurs lately and may not be identified if not actively scrutinized. In ancient times a description of transfusional contamination in 6 (25%) of 24 recipients of one contaminated bag had only one case with clinical signs of the acute phase myocarditis.[12]Recently, severe cases have been described in other countries.[13]When occurring in solid organ transplants recipients, due to the concomitant immunosuppression, it is not rare severe and potentially lethal manifestations of the acute phase of CD.[14]In addition, reactivation of the disease may occur in an organ recipient not suspected of having CD. The absence of a gold-standard diagnostic test contributes to the above occurrences.

The definition by the World Health Organization of Chagas disease as “neglected” certainly acquires more strength by the recognition that 50 years after the establishment of mandatory tests in blood donors in our country, the number of discarded bags due to the number of inconclusive results is huge. Financial and social impact of this serological inconsistency are still to be established.

Anyway, these two pathways of the dilemma imposed by uncertainty are immanent to the context of enigmatic situations involving diagnosis when no gold-standard exists and accuracy of every test applied to the “real-world” will be assessed in a diverse environment from the one it was standardized. Therefore, it rests to be properly established the sufficiency of only one high sensibility serological test to exclude CD.[15]Besides, even a two-step algorithm (a positive high sensibility test followed by a high specificity one) to establish diagnosis[16]seems challenged by evidence now published by researches from the state of Ceará.