[Fibrosis-driving cells in patients with primary myelofibrosis and myelodysplastic syndromes with myelofibrosis].

Objective: To compare fibrosis-driving cells in patients with primary myelofibrosis (PMF) and patients with myelodysplastic syndromes (MDS) with myelofibrosis (MF) (MDS-MF) .
Methods: Bone marrow biopsy sections of patients with newly diagnosed PMF and MDS (10 each randomly selected for MF-0/1, MF-2, and MF-3) were stained with specific immunofluorescence antibodies to label Gli1, LeptinR, alpha smooth muscle actin (α-SMA) , CD45, and ProcollagenⅠ. Images captured by confocal microscopy were analyzed by Fiji-ImageJ to calculate the cell counts of Gli1(+), LeptinR(+) cells, and fibrosis-driving cells including α-SMA(+), α-SMA(+)/Gli1(+), α-SMA(+)/LeptinR(+), and ProcollagenⅠ(+)/CD45(+) cells.
Results: Patients with PMF and MDS with MF-2/3 had higher LeptinR(+), α-SMA(+), α-SMA(+)/Gli1(+), and Procollagen Ⅰ(+)/CD45(+) cell counts compared with those with MF-0/1 (all P values<0.05) . However, patients with PMF with MF-2/3 presented with higher Gli1(+) and α-SMA(+)/LeptinR(+) cell counts than those with MF-0/1 (P=0.001 and 0.006) , whereas these cells were similar between patients with MDS with MF-0/1 and MF-2/3 (P=0.169 and 0.067) . In patients with MF-0/1, all fibrosis-driving cells did not differ between PMF and MDS (all P>0.05) . However, in patients with MF-2/3, Procollagen Ⅰ(+)/CD45(+) cell counts were higher in patients with PMF compared with those with MDS (P=0.007) , while other fibrosis-driving cell counts were similar between these two groups (all P>0.05) . MF grade and fibrosis-driving cell counts were not correlated with overall survival in patients with either PMF or MDS.
Conclusion: α-SMA(+) cells in patients with PMF originated from both Gli1(+) and LeptinR(+) cells, whereas α-SMA(+) cells in patients with MDS-MF only originated from Gli1(+) cells; patients with PMF had higher ProcollagenⅠ(+)/CD45(+) cell counts than those with MDS-MF.

骨髓纤维化（MF）常见于骨髓增殖性肿瘤（MPN）中的原发性骨髓纤维化（PMF），或继发于真性红细胞增多症（post-PV MF）和原发性血小板增多症（post-ET MF）。此外，约16％的原发性骨髓增生异常综合征（MDS）患者伴有MF改变（MDS-MF）[1]。早期研究证实PMF患者骨髓中纤维增多主要是克隆性异常增生的巨核细胞α颗粒分泌释放转化生长因子β（TGF-β）、血小板衍生生长因子（PDGF）等刺激多克隆纤维母细胞反应性高度增生的结果[2]–[4]。近期研究发现，骨髓纤维驱动细胞主要来源于间充质干细胞（MSC）和单核细胞[5]–[7]。我们对PMF和MDS-MF患者的骨髓纤维驱动细胞进行初步研究，报道如下。

病例与方法

1. 研究对象：随机选取2016年4月至2019年5月在我院MDS诊疗中心确诊的30例初诊PMF患者（MF-0/1、MF-2、MF-3级各10例）和30例初诊MDS患者（MF-0/1、MF-2、MF-3级各10例）纳入研究（表1）。所有患者均保存有取材于髂后上棘的骨髓活检标本且取材满意（长度≥15 mm，直径≥2 mm）。骨髓活检组织切片按WHO（2016）诊断标准[8]进行重新评估。骨髓纤维化按欧洲骨髓纤维化分级标准[9]，分为MF 0、1、2、3级。

表1

PMF和MDS患者临床和实验室特征

临床指标	PMF（30例）	MDS（30例）
年龄［岁，M（范围）］	51.5（14～71）	56.5（22～75）
男性［例（％）］	13（43.3）	20（66.7）
骨髓原始细胞［％，M（范围）］	0.5（0～5.0）	5.2（0～17.5）
HGB［g/L，M（范围）］	107（60～165）	78（36～133）
WBC［×109/L，M（范围）］	5.99（1.73～47.60）	2.52（1.10～6.64）
ANC［×109/L，M（范围）］	4.23（0.98～17.32）	0.95（0.17～2.92）
PLT［×109/L，M（范围）］	227.5（10～1698）	60.5（10～397）
查体可触及脾肿大［例（％）］	14（46.7）	4（13.3）

注：PMF：原发性骨髓纤维化；MDS：骨髓增生异常综合征；ANC：中性粒细胞绝对计数

2. 骨髓活检组织切片的免疫荧光染色：调取病理组织库中初诊患者石蜡包埋的骨髓活检组织。每例连续切取8张骨髓活检组织切片，切片厚度约4 µm。4张切片用于标记Gli1、LeptinR和平滑肌肌动蛋白（α-SMA），另4张切片用于标记CD45和ProcollagenⅠ。3张切片一抗孵育后加入二抗染色标记作为实验组，第4张切片仅加入二抗染色标记作为对照组以调整背景荧光。染色按试剂说明书进行。染色步骤简述如下：①石蜡切片脱蜡、水化后以0.01 mmol/L柠檬酸修复液（pH 6.0）微波加热至沸腾进行抗原修复；②PBS洗涤、破膜、10％血清封闭后加入特异性一抗孵育，4°C过夜，PBST洗涤后加入荧光标记的二抗室温孵育1 h，PBST洗涤2 h、DAPI室温复染30 min后加入组织自发荧光淬灭剂室温孵育45 min；③ddH2O洗涤后封片剂封固。

3. 纤维驱动细胞计数：选取以下纤维驱动细胞：①肌纤维母细胞（α-SMA+）及起源于Gli1+ MSC[5]或LeptinR+ MSC[6]的α-SMA+细胞亚群（α-SMA+/Gli1+或α-SMA+/LeptinR+）；②成纤维细胞（ProcollagenⅠ+/CD45+）[7]。Perkin Elemer共聚焦显微镜200倍视野下随机选取多个视野并拍照。从采集视野中随机选取30个视野，Volocity软件导出图片。利用Fiji-ImageJ软件将导出图片作高斯模糊处理，图片二值化后行Gli1+、LeptinR+、α-SMA+、α-SMA+/Gli1+、α-SMA+/LeptinR+细胞及ProcollagenⅠ+/CD45+成纤维细胞计数。

4. 随访：随访资料来源于病历记录及电话联系资料。所有病例随访至2019年11月30日，总生存（OS）期按确诊至死亡的时间或随访截止日期计算。

5. 统计学处理：符合正态分布的计量资料以±s表示，不符合正态分布的计量资料以中位数表示。两组间计量资料的比较根据数据正态性采用t检验或Mann-Whitney U检验。连续性变量生存分析界值由R包survminer确定。生存分析采用Kaplan-Meier法分析，以Log-rank检验进行比较。应用SPSS22.0软件进行数据分析，双侧检验P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1. PMF患者纤维驱动细胞计数与纤维化程度的关系：MF-0/1和MF-2/3级PMF患者纤维驱动细胞计数比较见表2。在PMF患者中，MF-2/3级患者Gli1+、LeptinR+细胞及α-SMA+、α-SMA+/Gli1+、α-SMA+/LeptinR+和ProcollagenⅠ+/CD45+细胞（图1）等纤维驱动细胞计数显著高于MF-0/1级患者。在部分α-SMA+细胞中可观察到Gli1和LeptinR共表达（图1A）。进一步分析表明，MF-2/3级PMF患者α-SMA+/Gli1+或LeptinR+细胞计数显著低于α-SMA+细胞计数［21（1～71）个/30视野对102（14～248）个/30视野，P<0.001］。

表2

MF-0/1和MF-2/3级原发性骨髓纤维化患者纤维驱动细胞计数比较（个/30视野）

纤维驱动细胞	MF-0/1（10例）	MF-2/3（20例）	P值
Gli1+细胞［M（范围）］	67.5（0～233）	270（39～829）	0.001
LeptinR+细胞［M（范围）］	12.5（0～52）	54（7～157）	<0.001
α-SMA+细胞（x±s）	34.9±26.05	105.2±65.33	0.003
α-SMA+/Gli1+细胞［M（范围）］	1（0～20）	17（1～65）	0.002
α-SMA+/LeptinR+细胞［M（范围）］	2（0～12）	14.5（0～54）	0.006
α-SMA+/Gli1+或LeptinR+细胞［M（范围）］	2（0～20）	21（1～71）	0.002
ProcollagenⅠ+/CD45+细胞（x±s）	11.30±9.66	29.95±19.22	0.001

图1

骨髓病理切片特异性抗体免疫荧光染色后显微共聚焦成像

A：Gli1、LeptinR和α-SMA染色（×200）和共定位（×600）；B：CD45和ProcollagenⅠ染色（×200）和共定位（×600）

2. MDS患者纤维驱动细胞计数与纤维化程度的关系：MF-0/1和MF-2/3级MDS患者纤维驱动细胞计数比较见表3。MF-2/3级MDS患者LeptinR+细胞及α-SMA+、α-SMA+/Gli1+和ProcollagenⅠ+/CD45+细胞等纤维驱动计数均显著高于MF-0/1级MDS患者，但两组患者Gli1+和α-SMA+/LeptinR+细胞计数无显著差异。在部分α-SMA+细胞中可观察到Gli1和LeptinR共表达。MF-2/3级MDS患者α-SMA+/Gli1+或LeptinR+细胞计数显著低于α-SMA+细胞计数［22（0～48）个/30视野对87（8～296）个/30视野，P<0.001］。

表3

MF-0/1和MF-2/3级骨髓增生异常综合征患者纤维驱动细胞计数比较（个/30视野）

驱动细胞	MF-0/1（10例）	MF-2/3（20例）	P值
Gli1+细胞［M（范围）］	183（39～730）	301（59～935）	0.169
LeptinR+细胞［M（范围）］	26（0～95）	54（20～157）	0.006
α-SMA+细胞（x±s）	21.60±15.91	108.60±72.48	<0.001
α-SMA+/Gli1+细胞［M（范围）］	3（0～23）	15（0～47）	0.005
α-SMA+/LeptinR+细胞［M（范围）］	2（0～20）	9（0～30）	0.067
α-SMA+/Gli1+或LeptinR+细胞［M（范围）］	4（0～24）	22（0～48）	0.005
ProcollagenⅠ+/CD45+细胞（x±s）	6.90±5.13	16.20±8.35	0.003

3. PMF和MDS患者纤维驱动细胞计数比较：PMF患者ProcollagenⅠ+/CD45+成纤维细胞计数显著高于MDS患者［（23.73±18.73）个/30视野对（13.10±8.59）个/30视野，P＝0.007］，其余纤维驱动细胞计数差异无统计学意义（P>0.05）。MF-0/1级患者中，PMF患者骨髓各纤维驱动细胞计数与MDS患者相比较差异均无统计学意义（P>0.05）。但MF-2/3级PMF患者ProcollagenⅠ+/CD45+成纤维细胞计数显著高于MF-2/3级MDS患者（P＝0.007），其他纤维驱动细胞计数相比较差异均无统计学意义（P值均>0.05）。

4. MF分级和纤维驱动细胞计数与生存分析：采用survminer程序包计算最大统计量，根据骨髓α-SMA+细胞计数将PMF患者分为α-SMA+细胞≤117个/30视野组（25例）及α-SMA+细胞>117个/30视野组（5例），根据骨髓ProcollagenⅠ+/CD45+成纤维细胞计数将PMF患者分为成纤维细胞≤42个/30视野组（24例）及成纤维细胞>42个/30视野组（6例）。截至末次随访时间，30例PMF患者均存活。α-SMA+细胞、成纤维细胞计数及MF分级均与OS时间无关。

采用survminer程序包计算最大统计量，根据骨髓α-SMA+细胞计数将MDS患者分为α-SMA+细胞≤85个/30视野组（18例）及α-SMA+细胞>85个/30视野组（12例），根据骨髓ProcollagenⅠ+/CD45+成纤维细胞计数将MDS患者分为成纤维细胞≤14个/30视野组（18例）及成纤维细胞>14个/30视野组（12例）。截至末次随访时间，30例MDS患者中死亡3例（均为MF-2/3级患者）。α-SMA+细胞及成纤维细胞计数均与OS时间无关（P值分别为0.453、0.777）。比较MF-0/1级与MF-2/3级MDS患者中位OS时间，差异无统计学意义（均未达到，P＝0.259）。

讨论

在过去的几十年里关于骨髓纤维来源细胞一直存在争议[10]。近年在肺纤维化等脏器纤维化机制研究中发现在器官定植的血管旁MSC样细胞衍生成肌纤维母细胞（myofibroblast）参与了纤维化的进程[10]。在正常骨髓中，Gli1+ MSC主要定位于骨髓骨内膜龛、窦周血管龛和动脉周围血管龛[5]。LeptinR+ MSC主要定位于窦周血管龛和动脉周围血管龛[11]–[12]。以往研究发现PMF小鼠骨髓中Gli1+ MSC和LeptinR+ MSC从骨髓龛中迁移至骨髓基质，增殖并分化为表达α-SMA的肌纤维母细胞，进而促进MF的发生、发展[5]–[6]。

Schneider等[5]在60例MPN患者骨髓活检切片中证实骨髓Gli1+ MSC细胞数与MF分级呈正相关，Gli1+ MSC细胞数与是否有JAK2和CALR基因突变无关。本研究中，MF-2/3级PMF患者Gli1+细胞较MF-0/1级患者显著扩增，与上述结果一致。但本研究进一步表明，除了Gli1+细胞，MF-2/3级PMF患者LeptinR+和α-SMA+细胞也较MF-0/1级患者显著增多，首次在患者中验证了PMF小鼠模型中的结果[5]–[6]。同时，MF-2/3级PMF患者骨髓中α-SMA+/Gli1+和α-SMA+/LeptinR+细胞亚群随MF程度增高而增多，提示PMF患者α-SMA+细胞来源于Gli1+和LeptinR+ MSC，这也与PMF小鼠模型研究[5]–[6]结果一致。此外，部分Gli1+细胞同时表达LeptinR，可能是因为Gli1+细胞分化发育过程中表达LeptinR[13]。

除了α-SMA细胞，Verstovsek等[7]利用免疫荧光染色技术发现PMF患者骨髓中由单核细胞分化而来的ProcollagenⅠ+ /CD45+成纤维细胞较正常人显著增多。本研究从临床角度进一步分析PMF患者骨髓成纤维细胞计数与MF程度的关系，发现MF-2/3级PMF患者骨髓中ProcollagenⅠ+/CD45+成纤维细胞较MF-0/1级患者显著扩增，提示成纤维细胞促进了PMF患者MF进展。上述结果说明α-SMA细胞及其亚群和成纤维细胞等纤维驱动细胞与PMF患者MF程度密切相关。

既往研究显示，MDS-MF发病机制与巨核细胞发育异常、TP53基因突变有关[14]–[15]，但纤维驱动细胞与MDS-MF关系如何尚无报道。本研究表明MF-2/3级MDS患者LeptinR+细胞较MF-0/1级MDS患者显著扩增，但两组患者Gli1+细胞计数相比较无显著差异，这与PMF患者不同。纤维驱动细胞的分析结果则表明α-SMA+、α-SMA+/Gli1+和ProcollagenⅠ+/CD45+等细胞促进了MDS患者MF进展，但α-SMA+/LeptinR+细胞与MDS患者MF程度无关。以上结果提示MDS患者α-SMA+细胞仅来源于Gli1+细胞，其促进MF进展的纤维驱动细胞与PMF患者不全相同。

本研究还发现MF-2/3级PMF和MDS患者骨髓α-SMA+/Gli1+或LeptinR+细胞计数显著低于α-SMA+细胞数，与文献[5]–[6]报道的结果一致，提示除了Gli1+或LeptinR+细胞，α-SMA+细胞还可能起源于其他细胞。有研究表明，在心脏纤维化、肺纤维化、肝纤维化及肾纤维化等疾病中促进纤维化进展的α-SMA+细胞有多种细胞来源，其中包括内皮细胞、纤维母细胞以及成纤维细胞[16]，PMF和MDS-MF患者α-SMA+细胞起源尚有待进一步研究。

本研究结果表明，MF-2/3级PMF患者骨髓成纤维细胞计数显著高于MF-2/3级MDS患者，但MF-0/1级PMF和MDS患者成纤维细胞计数无明显差异，进一步提示PMF和MDS患者MF发病机制不同。

以往研究表明MF分级影响PMF和MDS患者生存预后[17]–[18]，但本研究中MF分级、纤维驱动细胞计数均与OS时间无关，可能是病例数较少的缘故，需要扩大病例数后作进一步分析。

综上，本研究结果初步表明在细胞水平上PMF和MDS-MF发病机制存在差异。骨髓中α-SMA+细胞和成纤维细胞均促进PMF和MDS患者MF进展，但PMF患者骨髓α-SMA+细胞来源于Gli1+和LeptinR+细胞，而MDS-MF患者骨髓α-SMA+细胞仅来源于Gli1+细胞，且PMF患者成纤维细胞计数显著高于MDS-MF患者。这为PMF和MDS-MF发病机制的研究提供了新的线索。由于研究对象较少，上述结论需要更大规模的队列研究加以验证。