Evaluation of Histological Properties of Human Meniscal Grafts Stored in a Tissue Bank.

Objectives  The present paper aims to evaluate and compare the histological features of fresh and frozen menisci stored in a tissue bank for 1 month and for 5 years. Methods  The meniscal grafts were subjected to a histological study. A total of 10 menisci were evaluated; 2 were frozen for 5 years, 4 were frozen for 1 month, and 4 were fresh, recently harvested specimens. Histological properties were evaluated in sections stained with hematoxylin and eosin and Masson trichrome methods. Results  The menisci frozen for 1 month showed partially preserved collagen fiber structure and no significant hydropic tissue degeneration. The menisci frozen for 5 years presented an evident dissociation of collagen fibers and multiple foci of hydropic degeneration. Discussion  Degeneration was much more significant in menisci stored for 5 years, indicating that a long freezing period results in substantial progression of tissue deterioration. This may suggest that the 5-year period, considered the maximum time for graft storage before transplant, is too long. Conclusion  Grafts stored for 1 month showed a slight degenerative change in collagen fibers, whereas menisci frozen for 5 years presented significant tissue degeneration. Sociedade Brasileira de Ortopedia e Traumatologia. This is an open access article published by Thieme under the terms of the Creative Commons Attribution-NonDerivative-NonCommercial License, permitting copying and reproduction so long as the original work is given appropriate credit. Contents may not be used for commercial purposes, or adapted, remixed, transformed or built upon. ( https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ ).

Introduction

Treatment of meniscal injuries evolved continuously over the past few decades. Meniscal injury suture is the technique of choice to treat unstable meniscus damages in favor of a partial or total meniscectomy because it spares meniscal tissue. 1 2 Unfortunately, not all meniscal injuries can be repaired, especially if extensive tissue damage has occurred. 3 4

Patients usually experience a period of pain relief after a meniscectomy; over time, however, complaints can return, accompanied by a recurrent joint effusion mainly related to impact activities. In young, active patients, knee pain after meniscectomy can be a challenge. 4 Homologous meniscal transplantation is a therapeutic option for young, active patients who have undergone meniscectomy and present activity-limiting symptoms. 3

The success of homologous meniscal transplantation depends on a number of factors, including graft storage and availability. The most used preservation method is freezing of fresh menisci. 3 5 According to the standards set forth by the Brazilian National Sanitary Surveillance Agency (ANVISA, in the Portuguese acronym) and the Ministry of Health, the meniscal tissue can remain stored in a tissue bank for 5 years until transplantation. 6

Few studies have compared the histological properties of menisci stored for < 1 year or up to 5 years to assess whether biological features change significantly. Our objective was to compare the histological properties of fresh, nonfrozen meniscal grafts and frozen menisci stored for 1 month or 5 years in a tissue bank.

Material and Method

Meniscal grafts stored in the tissue bank of our institution were submitted to a histological study. A total of 10 meniscal grafts were evaluated. Two grafts remained stored, under freezing at - 80°C, in the tissue bank for 5 years; another 4 grafts were stored, also frozen at -80°C, for 1 month; and another 4 grafts were studied while fresh, right after harvest. All of the grafts included in the study were taken from donors, whose families allowed their use for both transplantation and research purposes according to a Donation Term filled in before harvesting. The present study was approved by the Ethics Committee in Research from our institution.

The menisci were sent to the Department of Pathological Anatomy in 10% formaldehyde for evaluation of their histological properties and comparison with fresh, nonfrozen, recently harvested menisci.

The menisci were embedded in paraffin and sectioned in a rotating microtome at 5 μm thickness. Two slides were made for each of the 10 menisci; 1 sample was obtained through a perpendicular section at the transition between the anterior horn and the meniscus body, whereas the other sample was obtained through a perpendicular section at the posterior horn region. For all 20 samples, tissue was obtained from both central and peripheral meniscal regions.

The samples were stained with hematoxylin-eosin (H&E), which is the standard staining for histological evaluation of nucleus, cytoplasm and tissue fundamental amorphous substance, and with Masson trichrome, a histochemistry method to analyze collagen fibers and complement the H&E assessment. Analysis was carried out by counting random points on each region of the meniscus and recording the coincident points on chondrocytes and fibroblasts/fibrocytes, under 10x magnification. The expressed results assessed the distribution and cell viability in these two regions, as well as the integrity of fibrocartilaginous tissue.

Results

When compared with fresh, nonfrozen, recently harvested meniscal tissue, menisci frozen for 1 month showed partial structural disorganization of their collagen fibers, which were more compact in the central portion and presented a slight dissociation at the periphery, but no significant hydropic tissue degeneration. A change in basophilic appearance (hematoxylin color) revealed tissue degeneration. Two of these menisci presented collagen fibers condensation and homogenization, while the other two showed slight fragmentation of collagen fibers, with the formation of small vacuolized areas of hydropic aspect.

The menisci frozen for 5 years showed more significant changes, resulting in evident dissociation of collagen fibers throughout their length and the presence of multiple foci of hydropic degeneration, sometimes forming vacuolar accumulations ( Figures 1 and 2 ).

Fig. 1

( A ) Fresh meniscus with its usual eosinophilic color. ( B ) Meniscus preserved for 1 month presenting basophilic discoloration and collagen fibers fragmentation. ( C ) Meniscus preserved for 5 years showing more accentuated changes, extensive hyaline degeneration and interstitial accumulations due to edema. (Hematoxylin & Eosin, 10x magnification).

Fig. 2

( A ) Fresh meniscus with no fiber fragmentation. ( B ) Meniscus preserved for 1 month showing fiber discontinuity and accumulated hyaline material stained in blue. ( C ) Meniscus preserved for 5 years exhibiting severe fiber fragmentation and marked interstitial dissociation due to edema (Masson's trichrome, 10x magnification).

Discussion

Human meniscus transplantation is no longer considered an experimental treatment, since several clinical studies, with hundreds of cases and a high percentage of good and excellent outcomes, have been published in the international literature. 7 8 9 10 The ideal candidate for meniscal transplantation is an active patient, < 50 years old, with an aligned limb, a stable knee, who underwent a total or subtotal meniscectomy, and presents with pain in the involved knee compartment and no significant degenerative changes. 3

Several factors make homologous meniscal transplantation a technical and logistical challenge, including graft storage and availability, costs, risk of disease transmission and graft remodeling after implantation. 3 5 The main factors associated with the medical team are the choice of appropriate sized meniscal grafts, their precise positioning and stable fixation. 3 7 9 The meniscal graft must accurately match the dimensions of the recipient knee to increase the chance of restoration of normal biomechanical function. 11 12 13 Proper graft implantation and its fixation affect the load transmission function around the knee, and the choice of a graft corresponding morphologically to the recipient knee is essential to optimize the conformity between the meniscus and the femoral condyle. 12 14

Grafts can be preserved fresh, fresh frozen, cryopreserved and lyophilized. However, since lyophilized grafts tend to shrink significantly after implantation, this method of preservation is no longer recommended. The use of fresh grafts presents obvious logistical problems, such as finding a recipient within 7 days of harvesting, before the beginning of graft cell deterioration; in addition, there is an increased risk of disease transmission. Fresh frozen grafts are the most used today, with higher success rates and the lowest risk of disease transmission or biomechanical degradation. 3 5

Animal studies have shown that transplanted menisci present proper peripheral incorporation and healing, with no inflammatory reaction or evident rejection aspect. 5 15 16 17 Cury et al. 17 evaluated the viability of frozen meniscal grafts transplanted into rabbits. The medial meniscus from 12 rabbits were harvested, frozen at - 80°C for 30 days, and then reimplanted in other rabbits. After 60 days, the menisci were macroscopically and histologically evaluated and compared to a control group, which consisted of the undamaged, contralateral knee. The authors observed that transplanted frozen menisci maintained the biological features from the original menisci regarding size and appearance, with good peripheral healing in the synovial membrane and no apparent immunological rejection.

The ANVISA and the Ministry of Health state that meniscal tissue can remain stored in a tissue bank for 5 years until transplantation. 6 The biomechanical behavior of the menisci depends on the organization of their collagen fibers; as such, the ideal preservation method should not lead to significant changes in tissue microstructure, regardless of its cellularity. 18 Our study revealed marked histological degeneration of menisci stored under freezing for 5 years, while menisci frozen for just 1 month showed milder degeneration.

Both human and animal studies show that deep freezing alters the normal architecture of collagen fibers and increased water tissue content, similarly to what was observed in our study. 5 16 18 19 20 Gelber et al. 19 found changes in meniscus collagen fibers frozen for 7 days, suggesting that deep freezing, regardless of the storage period, leads to structural changes in the graft. Our study showed that even menisci stored for just 1 month presented architectural changes when compared to nonfrozen menisci.

However, the significant progression of tissue degeneration in grafts stored for extended periods may suggest that the 5-year time point, considered the maximum amount of time a graft can remain stored before being transplanted, is too long.

Nevertheless, degeneration was much more pronounced in menisci stored for a longer time, indicating that not only freezing itself, but the extended storage period, leads to significant progression of meniscal tissue deterioration. Our findings suggest that the 5-year period, considered the maximum amount of time a graft can remain stored before being transplanted, is excessive. We did not find any case series of meniscus transplant with fresh frozen grafts describing the maximum period of storage before the procedure. In a biochemical, biomechanical and histological study, Lewis et al. 20 showed that menisci submitted to multiple freezing cycles presented decreased resistance to compression, with higher microstructure compromise. Verdonk et al. 9 performed a series of homologous meniscus transplantation with viable fresh, nonfrozen grafts arguing that this not only contributes to cell survival but also to the production of extracellular matrix. Although the authors did not focus on the ultrastructural aspect of the grafts, we can assume that the use of nonfrozen grafts has the advantage of no significant change in the structure of meniscal collagen fibers.

The main limitation of our study is the small sample size. Our limiting factor was the small number of menisci in the tissue bank available for study. Our sample did not allow definitive conclusions regarding the optimal maximum storage period for meniscal tissues. However, we hypothesize that the 5-year period, currently accepted as the limit, may be too long. Further studies are required to assess this hypothesis and also to determine whether histological changes are associated with tissue biomechanical changes. Studies with a larger sample and analyzing an intermediate storage time (1 or 2 years of freezing) would be important to ascertain what would be the maximum ideal freezing time.

Treatment of knee ligament, meniscal and osteochondral lesions with homologous grafts has become progressively more popular in recent decades all over the world. The low availability of grafts in musculoskeletal tissue banks is associated with the difficulty in popularizing these techniques in our country, Brazil. Stimulus policies for musculoskeletal tissue harvesting and storage are critical.

Conclusion

Meniscal grafts stored under freezing for 1 month showed variable, slight degenerative change in collagen fibers, but with no large intercellular accumulations. Menisci frozen for 5 years presented significant tissue degeneration in its entire length, in addition to marked fiber fragmentation and dissociation by interstitial edema.

Introdução

Ao longo das últimas décadas, o tratamento das lesões meniscais vem evoluindo continuamente. A sutura da lesão meniscal é a técnica de escolha no tratamento das lesões instáveis de menisco, em detrimento a uma meniscectomia parcial ou total, preservando o tecido meniscal. 1 2 Infelizmente, nem todas lesões meniscais podem ser reparadas, especialmente se tiver ocorrido dano extenso no tecido. 3 4

Após uma meniscectomia, os pacientes geralmente apresentam um período de alívio da dor, mas com o tempo a queixa pode retornar, acompanhada de derrame articular de repetição, principalmente associado a atividades de impacto. Em pacientes jovens e ativos, dor no joelho após meniscectomia pode ser um problema desafiador. 4 O transplante meniscal homólogo é uma opção terapêutica para pacientes jovens e ativos que foram submetidos à meniscectomia e apresentam sintomas que limitam suas atividades. 3

O sucesso do transplante meniscal homólogo depende de diversos fatores. Entre esses fatores temos o armazenamento e disponibilidade dos enxertos. O método de preservação mais utilizado é o congelamento a fresco do menisco. 3 5 De acordo com as normas da Agência Nacional de Vigilância Sanitária e do Ministério da Saúde, o tecido meniscal pode permanecer armazenado em banco de tecido por 5 anos até ser transplantado. 6

Poucos estudos comparam as propriedades histológicas dos meniscos com < 1 ano de armazenamento com as características dos meniscos armazenados por 5 anos para avaliar se existem alterações significativas nas propriedades biológicas destes enxertos. Nosso objetivo foi comparar as características histológicas do tecido de enxertos meniscais frescos não congelados com as características de meniscos congelados armazenados por 1 mês e meniscos congelados por 5 anos em banco de tecidos.

Material e Método

Foi feito um estudo histológico com enxertos meniscais armazenados no Banco de Tecidos da nossa instituição. Foram avaliados 10 enxertos meniscais. Dois enxertos permaneceram armazenados, sob congelamento a - 80°C, no banco de tecidos por 5 anos, outros 4 enxertos permaneceram armazenados, também sob congelamento a -80° C, por um período de 1 mês, e outros 4 enxertos foram captados e estudados a fresco. Todos os enxertos incluídos no estudo foram captados de doadores, cujas famílias doaram seus tecidos tanto para transplante quanto para fins de estudo e pesquisa, de acordo com o Termo de Doação preenchido previamente à captação dos órgãos. O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da nossa instituição.

Os meniscos foram enviados ao Departamento de Anatomia Patológica em formol a 10%, para avaliação das propriedades histológicas dos enxertos e comparação entre os grupos, usando os meniscos frescos não congelados, recém-captados, como parâmetro para comparação com os meniscos armazenados sob congelamento.

Os meniscos foram incluídos em parafina e seccionados em micrótomo rotativo a 5um de espessura. Foram confeccionadas duas lâminas de cada um dos 10 meniscos, sendo uma amostra obtida através de corte perpendicular na transição entre o corno anterior e o corpo do menisco, e a outra amostra obtida através de corte perpendicular na região do corno posterior. Em todas as 20 amostras, foi obtido tecido tanto da região central quanto da região periférica do menisco.

As amostras foram coradas pelo método de hematoxilina e eosina (H&E), coloração padrão para avaliação histológica do núcleo, citoplasma e substância fundamental amorfa do tecido, e para complementar a H&E, foi utilizado o Tricrômico de Masson, método de histoquímica que avalia as fibras colágenas. A análise foi realizada pela contagem de pontos aleatórios sobre cada região do menisco, registrando-se os pontos coincidentes sobre condrócitos e fibroblastos/fibrócitos, sendo os resultados expressos, utilizando-se objetiva de 10x, para avaliar a distribuição e a viabilidade celular nas duas regiões, assim como a integridade do tecido fibrocartilaginoso.

Resultados

Quando comparados com o tecido meniscal fresco não congelado recém-captado, os meniscos que permaneceram congelados por 1 mês apresentaram desorganização parcial da estrutura de suas fibras colágenas, estando estas mais compactas na porção central e com discreta dissociação na porção periférica do menisco, e não houve degeneração hidrópica significativa do tecido. A degeneração do tecido exibia alteração de aspecto basofílico (coloração evidente na hematoxilina). Dois destes meniscos apresentavam condensação e homogeneização das fibras colágenas, enquanto os outros dois apresentavam discreta fragmentação das fibras colágenas, com formação de pequenas áreas vacuolizadas de aspecto hidrópico.

Os meniscos que permaneceram congelados por 5 anos apresentavam alterações mais significativas, cursando com dissociação evidente das fibras colágenas em toda sua extensão, com presença de múltiplos focos de degeneração hidrópica que por vezes formavam acúmulos vacuolares ( Figuras 1 e 2 ).

Fig. 1

( A ) Menisco a fresco com sua coloração habitual, eosinofílica. ( B ) Menisco conservado por 1 mês com alteração da cor para basofílica e fragmentação das fibras colágenas. ( C ) Menisco conservado por 5 anos com alterações mais acentuadas, exibindo extensa degeneração hialina formando acúmulos intersticiais por edema. (Hematoxilina & Eosina, aumento de 10x).

Fig. 2

(A) Menisco a fresco sem fragmentação da fibra. ( B ) Menisco conservado por 1 mês com descontinuidade das fibras, com acúmulos de material hialino corados em azul. ( C ) Menisco conservado por 5 anos com fragmentação severa das fibras e acentuada dissociação intersticial por edema. (Tricrômico de Masson, aumento de 10x).

Discussão

O transplante de menisco humano não é mais considerado um tratamento experimental, uma vez que diversos estudos clínicos, com centenas de casos, com alta porcentagem de bons e excelentes resultados, foram publicados sobre o tema na literatura internacional. 7 8 9 10 O candidato ideal ao transplante meniscal é um paciente ativo, com menos de 50 anos, com membro alinhado, joelho estável, que foi submetido a uma meniscectomia total ou subtotal, e apresenta quadro de dor no compartimento envolvido do joelho, sem alterações degenerativas significativas. 3

Vários fatores tornam o transplante meniscal homólogo um desafio técnico e logístico. Entre esses fatores temos armazenamento e disponibilidade de enxertos, custos, risco de transmissão de doenças e remodelação do enxerto após a implantação. 3 5 Dentre os principais fatores associados à equipe médica temos escolha do tamanho adequado, posicionamento preciso e fixação estável do enxerto meniscal. 3 7 9 O enxerto meniscal deve corresponder com precisão às dimensões do joelho receptor para aumentar a chance de restaurar sua função biomecânica normal. 11 12 13 A implantação adequada do enxerto e sua fixação afetam a função de transmissão de carga ao redor do joelho, e a escolha de um enxerto que corresponda à morfologia do joelho receptor é essencial para otimizar a conformidade entre o menisco e o côndilo femoral. 12 14

Os quatro métodos de preservação do enxerto descritos são enxerto fresco, congelado fresco, criopreservado e liofilizado. Entretanto, enxertos liofilizados tendem a encolher de maneira significativa após a implantação, e esse método não é mais recomendado como um método de preservação. O uso de enxertos frescos apresenta problemas logísticos óbvios, como encontrar um receptor em um período de 7 dias após a captação, antes que se inicie a deterioração celular do enxerto, além do risco aumentado de transmissão de doenças. Enxertos congelados a fresco são os mais utilizados atualmente, com maiores taxas de sucesso, e com o menor risco de transmissão de doenças ou degradação biomecânica. 3 5

Estudos em animais demonstraram que meniscos transplantados apresentam incorporação e cicatrização adequada na periferia, sem reação inflamatória ou aspecto de rejeição evidente. 5 15 16 17 Em nosso meio, Cury et al. 17 avaliaram a viabilidade de enxertos meniscais congelados transplantados em coelhos. Os autores retiraram o menisco medial de 12 coelhos, mantiveram o menisco congelado à temperatura de - 80°C por um período de 30 dias, e reimplantaram o menisco em outro coelho. Após 60 dias, os meniscos foram avaliados do ponto de vista macroscópico e histológico, comparando-os com o grupo controle, que foi o joelho contralateral ileso. Os autores observaram que o menisco congelado transplantado manteve as características biológicas do menisco original em relação ao tamanho e aspecto, apresentando boa cicatrização periférica na membrana sinovial, e não foi observado aspecto de rejeição imunológica.

De acordo com as normas da Agência Nacional de Vigilância Sanitária e do Ministério da Saúde, o tecido meniscal pode permanecer armazenado em banco de tecido por 5 anos até ser transplantado. 6 O comportamento biomecânico dos meniscos depende da organização das suas fibras colágenas; dessa forma, o método de preservação ideal não deveria levar a alterações significativas na microestrutura do tecido, independente de sua celularidade. 18 Em nosso estudo, encontramos degeneração acentuada das propriedades histológicas dos meniscos armazenados sob congelamento por 5 anos, enquanto que os meniscos armazenados congelados por apenas 1 mês apresentavam degeneração mais leve.

Estudos tanto em humanos quanto em animais mostram que o congelamento profundo altera a arquitetura normal das fibras de colágeno, com aumento do conteúdo de água no tecido, de forma semelhante ao que encontramos em nosso estudo. 5 16 18 19 20 Gelber et al. 19 encontraram alterações nas fibras colágenas de meniscos armazenados sob congelamento por um período de 7 dias, sugerindo que o congelamento profundo, independente do período de armazenamento, leva a alterações estruturais no enxerto. Em nosso estudo, observamos que mesmo os meniscos armazenados por apenas 1 mês apresentaram alterações em sua arquitetura quando comparados com os meniscos que não foram congelados.

Contudo, a progressão significativa da degeneração do tecido nos tecidos armazenados por período mais longo pode sugerir que o período de 5 anos, considerado período máximo que o enxerto pode permanecer armazenado antes de ser transplantado, é um período muito longo.

Não obstante, os meniscos que permaneceram armazenados por mais tempo tiveram uma degeneração bem mais acentuada, indicando que não apenas o congelamento em si, mas o tempo prolongado de armazenamento sob congelamento leva à progressão significativa da degeneração do tecido meniscal. Nossos achados sugerem que o período de 5 anos, considerado período máximo que o enxerto pode permanecer armazenado antes de ser transplantado, é um período muito longo. Não encontramos nenhuma série de casos de transplante de menisco realizado com enxerto congelado a fresco que descreva o período máximo que os enxertos permaneceram congelados antes do procedimento. Lewis et al. 20 mostraram em estudo bioquímico, biomecânico e histológico que meniscos submetidos a múltiplos ciclos de congelamento apresentavam diminuição na sua resistência a compressão, com maior desarranjo da sua microestrutura. Verdonk et al. 9 realizaram sua série de transplante de menisco homólogo com meniscos frescos viáveis não congelados, defendendo que isso não apenas contribui na sobrevivência das células, mas também na produção da matriz extracelular. Apesar dos autores não focarem seus trabalhos no aspecto ultraestrutural dos enxertos, podemos considerar que o uso de enxertos não congelados também apresenta a vantagem de não ocorrer alteração significativa na estrutura das fibras colágenas do tecido meniscal.

A principal limitação do nosso estudo é a amostra reduzida. Nosso fator limitador foi o número pequeno de meniscos no banco de tecidos disponíveis para o estudo. Com nossa amostra, não conseguimos chegar a conclusões definitivas a respeito do período de armazenamento máximo ideal dos tecidos meniscais. Mas levantamos a hipótese que o tempo de 5 anos, aceito atualmente como tempo limite, talvez seja excessivamente prolongado. Mais estudos para avaliar esta hipótese são necessários, além de determinar se as alterações histológicas estão associadas a alterações biomecânicas do tecido. Estudos com uma amostra maior e com análise de um tempo intermediário de armazenamento (1 ou 2 anos de congelamento) seriam importantes para responder a pergunta de qual seria o tempo máximo ideal de congelamento.

O tratamento das lesões ligamentares, meniscais e osteocondrais do joelho com enxertos homólogos tem se tornado progressivamente mais popular nas últimas décadas, em todo mundo. A baixa disponibilidade de enxertos nos bancos de tecido musculoesquelético está associada com a dificuldade na popularização dessas técnicas no país. Políticas de estímulo para captação e armazenamento de tecido musculoesquelético são fundamentais.

Conclusão

Os enxertos meniscais armazenados sob congelamento por 1 mês apresentaram discreta alteração degenerativa das fibras colágenas, em quantidade variável, porém sem grandes acúmulos intercelulares. Os meniscos com 5 anos de congelamento apresentaram degeneração significativa do tecido em toda sua extensão, fragmentação e acentuada dissociação das fibras por edema intersticial.