[The prognostic value of cloned genetic mutations in patients with CBFβ-MYH11 fusion-positive acute myeloid leukemia receiving intensive consolidation therapy].

急性髓系白血病（AML）是成人最常见的恶性血液病。合并CBFβ-MYH11融合基因的AML占成人AML的8％～10％，美国国家综合癌症网（NCCN）（2020）指南将此类AML归为低危组[1]–[3]。该融合基因由16号染色体臂间倒位或相互易位形成，通过破坏核心结合因子（CBF）复合物阻断CBFα/β的转录功能，以阻断骨髓造血干细胞向成熟髓系、淋系细胞分化，协同促进增殖的关键靶基因的激活，“多步打击”导致AML的发生[3]–[5]。但近年来临床数据显示，CBFβ-MYH11阳性AML患者复发率可达45％[6]，这种结果可能与合并克隆性基因突变相关。不同基因突变与该人群预后的相关性仍需深入研究。基于二代测序（NGS）技术[7]的分子遗传学检测在AML诊疗中的临床价值已被逐渐认识。本研究旨在通过分析2011年7月至2017年8月我院收治的初次完全缓解（CR1）状态下接受高剂量化疗或自体造血干细胞移植的CBFβ-MYH11阳性AML患者的临床特征、实验室检查及预后结果，评价克隆性基因突变的预后价值，以期更好地协助诊治，指导临床决策。

病例与方法

一、病例资料

2011年7月至2017年8月就诊于我院的1 387例初治AML中CBFβ-MYH11融合基因阳性的AML患者共78例。所有患者均符合文献[7]诊断标准。排除未接受治疗或失访患者、经治疗未达到CR的患者、未能行NGS者、无法严格执行高剂量阿糖胞苷巩固化疗者，将其中CR1状态下接受高剂量巩固化疗和自体造血干细胞移植的63例患者纳入研究。初诊接受标准“7+3”方案诱导治疗达CR1后接受高剂量巩固化疗患者，后续采用异基因造血干细胞移植，为排除异基因造血干细胞移植对预后的影响，本研究将其纳入接受高剂量阿糖胞苷巩固化疗组，随访时间截至移植前，结局按照删失处理。对患者初治骨髓标本进行细胞形态学、免疫学、细胞遗传学及分子遗传学（NGS）等检测，统计分析患者的一般临床资料、实验室检查、治疗方案、随访结果等临床资料。

二、治疗方案

所有患者均依照成人AML中国诊疗指南[8]，接受阿糖胞苷联合蒽环类药物（“7+3”方案）为基础的标准诱导化疗方案，所有患者均为1个疗程诱导化疗达到CR，后采用大剂量阿糖胞苷（3 g/m2，每12 h 1次，6个剂量）3～4个疗程。结合患者意愿及经济状况选择性进行自体造血干细胞移植治疗。

三、NGS检测方法

1. 基因位点及检测方法：63例初诊CBFβ-MYH11融合基因阳性AML患者骨髓标本提取基因组DNA，利用Ion Torrent S5 NGS测序平台（美国Thermo Fisher公司产品）进行靶向扩增子法深度测序49个基因，并用PCR-毛细管电泳法检测FLT3-ITD突变，Sanger测序法检测CEBPA和NPM1第12号外显子突变。

2. 引物及测序文库：NGS扩增子测序法引物由Thermo Fisher公司设计、合成；采用Ion AmpliSeqTM文库试剂盒2.0制备文库，PCR初始模板量为12～16 ng；采用Ion library TaqMan文库定量试剂盒对文库进行qPCR检测；采用Ion 540TM OT2试剂盒进行乳液PCR和ISP富集，最终使用540芯片进行上机测序。

3. 结果分析及校对：NGS结果由Ion Torrent S5仪器自带软件和插件进行初步分析，得到该540芯片上样率、人类基因组参考序列匹配度、整体数据量和中位测序长度等，还可获得每个标本的在靶率、平均深度、均一度、BAM及VCF文件等数据。最后对VCF文件进行注释，并用IGV软件查看BAM文件进行确认，以排除假阳性。本研究在靶率97％～99％，平均深度2000×，均一度94％～97％，中位测序长度195 bp。

四、随访及定义指标

随访方式采取电话及电子邮件、门诊随诊、医院病例登记系统、家访随诊等。自患者确诊之日起进行随访，随访时间截至2019年12月1日，总生存（OS）时间定义为从疾病确诊至患者死亡或末次随访的时间。无事件生存（EFS）时间定义为从疾病确诊至疾病复发或非复发因素导致死亡或末次随访的时间。无病生存（DFS）时间定义为从患者化疗后达到CR1至疾病复发、死亡或末次随访的时间。复发定义为血液或骨髓中的原始细胞再次出现>5％或在达到CR后的任何髓外部位复发。

五、统计学处理

采用SPSS 25.0软件进行统计学处理，计数资料以百分率表示，生存分析采用Kaplan-Meier法描绘生存曲线。将单因素分析中P<0.1的因素纳入Cox回归模型进行多因素分析。多因素分析以α＝0.05，P<0.05为差异有统计学意义。NGS检测每个基因的突变比例，根据临床定义将突变率≥1％定义为突变阳性，<1％定义为突变阴性，以计数资料进行相关后续分析。

结果

1. 一般临床特征：所有接受强化巩固治疗的CBFβ-MYH11融合基因阳性AML患者共63例，男40例，女23例，男女比例为1.7∶1；中位年龄38（11～64）岁；初诊血常规检查中，中位WBC 29.1（1.9～178.2）×109/L，HGB 82.0（44～150）g/L，PLT 28（7～198）×109/L；中位LDH 404（107～1411）U/L；患者的初诊外周血中位原始细胞比例为52％（7％～90％）。初治骨髓检测结果中，中位骨髓原始细胞比例为56.0％（13.5％～87.0％）；合并其他染色体异常的类型主要为22号染色体三体（+22）、8号染色体三体（+8）和6号染色体三体异常，分别有13例（20.6％）、5例（7.9％）、2例（3.3％）。患者接受1个疗程诱导治疗后在CR1状态下进行高剂量化疗者54例，自体造血干细胞移植者9例。

2. 基因突变检测：63例接受强化巩固治疗的CBFβ-MYH11融合阳性的AML患者均接受NGS。其中55例（87.3％）患者检测到合并基因突变。KIT突变发生率最高，共26例（41.3％），其次为NRAS、KRAS基因，发生率分别为38.1％和20.6％，有11例（17.5％）发生FLT3突变，包含10例（15.9％）FLT3-TKD和1例FLT3-ITD；发生WT1突变5例（7.9％），PTPN11突变4例（6.3％）、PHF6、RUNX1、DNMT3A、CBL突变各2例，CEBPA、TET2、SETBP1、GATA2、U2AF1、CALR、IDH2、CSF3R、PDGFRB和BCOR突变各1例。

共突变情况：1例（1.6％）患者同时合并5种基因突变（NRAS、FLT3-TKD、KIT、CBL、DNMT3A），3例（4.8％）患者合并4种基因突变，7例（11.2％）患者合并3种基因突变，19例（30.4％）患者发生两种基因突变，25例（40.0％）患者存在单个基因突变，具体共突变基因分布及个数如图1所示。

图1

63例CBFβ-MYH11融合基因阳性患者二代测序基因突变热图

3. 预后分析：将可能影响预后的临床因素及基因突变进行单因素分析（表1）。单因素模型分析显示：初诊外周血原始细胞比例与患者的OS（P＝0.030）、EFS（P＝0.045）、DFS（P＝0.032）相关。基因突变中，合并FLT3突变的患者，特别是存在FLT3-TKD突变者，其OS（P＝0.001）、EFS（P＝0.002）及DFS（P＝0.001）时间均缩短，合并WT1突变影响OS（P＝0.040）和DFS（P＝0.029）（图2～3）。

表1

CBFβ-MYH11融合基因阳性急性髓系白血病患者预后单因素分析

因素	总生存		无事件生存		无病生存		无复发生存
	HR值（95％CI）	P值	HR值（95％CI）	P值	HR值（95％CI）	P值	HR值（95％CI）	P值
年龄	0.997（0.953～1.043）	0.901	0.998（0.953～1.034）	0.921	0.999（0.955～1.045）	0.962	0.992（0.935～1.052）	0.783
性别	1.075（0.321～3.602）	0.906	1.141（0.341～3.815）	0.871	1.038（0.311～3.460）	0.952	1.242（0.236～6.523）	0.798
初诊WBC（×109/L）	1.010（0.997～1.025）	0.127	1.009（0.996～1.023）	0.157	1.010（0.997～1.023）	0.137	0.993（0.966～1.021）	0.633
HGB（g/L）	0.996（0.975～1.017）	0.678	0.995（0.975～1.016）	0.655	0.995（0.974～1.017）	0.678	1.010（0.986～1.034）	0.422
PLT（×109/L）	0.986（0.961～1.012）	0.280	0.986（0.962～1.011）	0.280	0.986（0.960～1.013）	0.294	1.008（0.992～1.025）	0.325
LDH	1.000（0.997～1.003）	0.921	1.000（0.997～1.003）	0.991	0.922（0.997～1.003）	0.922	1.001（0.998～1.005）	0.451
初诊骨髓原始细胞比例	25.780（0.744～893.501）	0.072	23.274（0.634～854.929）	0.087	21.755（0.610～776.461）	0.091	0.219（0.003～15.689）	0.485
初诊外周血原始细胞比例	1.030（1.003～1.058）	0.030	1.026（1.001～1.053）	0.045	1.030（1.003～1.058）	0.032	0.989（0.962～1.016）	0.418
8号染色体三体	0.563（0.072～4.387）	0.584	0.637（0.082～4.978）	0.668	0.569（0.073～4.440）	0.591	0.872（0.105～7.260）	0.899
22号染色体三体	0.412（0.053～3.200）	0.397	0.465（0.060～3.607）	0.463	0.404（0.052～3.137）	0.386	2.338（0.452～12.088）	0.311
KIT突变	1.513（0.452～5.190）	0.494	1.572（0.463～5.333）	0.468	1.770（0.508～6.169）	0.370	1.301（0.251～6.752）	0.754
NRAS突变	1.790（0.574～5.587）	0.316	1.838（0.591～5.719）	0.293	1.712（0.549～5.339）	0.354	0.840（0.164～4.357）	0.840
KRAS突变	1.234（0.333～4.576）	0.753	1.264（0.341～4.678）	0.726	1.306（0.353～4.834）	0.689	1.520（0.294～7.858）	0.617
FLT3突变	9.816（2.710～35.678）	0.001	7.766（2.328～25.910）	0.001	9.622（2.658～34.832）	0.001	1.719（0.200～14.751）	0.621
FLT3-TKD突变	7.952（2.237～28.261）	0.001	6.883（2.042～23.202）	0.002	7.849（2.223～27.714）	0.001	2.920（0.338～25.202）	0.330
WT1突变	5.604（1.078～29.123）	0.040	4.833（0.968～24.138）	0.055	6.359（1.213～33.349）	0.029	0.047（0.000～370.618）	0.741
PTPN11突变	2.018（0.243～16.786）	0.516	2.006（0.241～16.687）	0.520	2.004（0.241～16.671）	0.520	-	-
突变个数	2.620（1.515～4.529）	0.001	2.591（1.510～4.447）	0.001	2.621（1.519～4.524）	0.001	1.453（0.562～3.761）	0.441
治疗方法（化疗/自体移植）	0.573（0.124～2.649）	0.476	0.506（0.109～2.353）	0.385	0.530（0.114～2.467）	0.418	0.530（0.114～2.467）	0.418

图2

合并FLT3-TKD基因突变的CBFβ-MYH11融合基因阳性急性髓系白血病患者总生存（A）、无事件生存（B）、无病生存曲线（C）

图3

合并WT1基因突变的CBFβ-MYH11融合基因阳性急性髓系白血病患者总生存（A）、无事件生存（B）、无病生存曲线（C）

对63例CR1状态下接受强化巩固治疗的CBFβ-MYH11阳性AML患者进行多因素分析，纳入单因素分析中P<0.1的因素，包含FLT3-TKD突变、WT1突变、初诊骨髓原始细胞比例、外周血原始细胞比例和共突变个数。多因素结果显示，合并WT1突变（OS，P＝0.027；EFS，P＝0.038）及突变个数（OS，P＝0.037；EFS，P＝0.032）是影响OS及EFS的独立危险因素，FLT3-TKD（P＝0.049）、WT1（P＝0.012）突变以及突变个数（P＝0.040）均为影响患者DFS的独立危险因素（表2），研究因素与复发未见明显统计学相关。

表2

CBFβ-MYH11融合基因阳性急性髓系白血病患者预后多因素分析

因素	总生存			无事件生存			无病生存
	HR值	95％CI	P值	HR值	95％CI	P值	HR值	95％CI	P值
FLT3-TKD突变	4.249	0.929～19.438	0.062	4.136	0.948～18.048	0.059	4.592	1.004～20.998	0.049
WT1突变	7.429	1.250～44.142	0.027	6.107	1.104～33.772	0.038	10.961	1.702～70.581	0.012
突变个数	1.994	1.043～3.813	0.037	1.956	1.956～1.059	0.032	1.964	1.030～3.744	0.040

讨论

CBFβ-MYH11融合基因由16号染色体倒位或相互易位形成，合并此融合基因的患者通常被认为预后良好。此类患者发病年龄小,多为中青年，常有外周血WBC升高、诱导化疗缓解率高等特点[9]，本组患者男性发病率高于女性，中位年龄38岁，中位WBC 29.1×109/L，临床基本特征与其他报道相符。此外，骨髓与外周血原始细胞比例是反映肿瘤负荷的重要指标，本研究发现，患者初诊外周血原始细胞比例高，其OS、EFS及DFS时间均缩短。CBFβ-MYH11融合基因常伴有其他染色体异常，如+8、7q−和+22[10]。研究发现附加染色体异常并不影响其OS率[9],[11]–[12]。

CBFβ-MYH11阳性AML患者受体酪氨酸激酶基因家族基因突变发生率较高，如FLT3、KRAS、KIT等，可能是促进AML发生和发展的协同因素[10]，检测基因异常将有助于预测治疗结果[13]。本研究人群多合并该家族基因突变。FLT3基因在成人AML中突变率为20％～30％，主要有FLT3-ITD和FLT3-TKD两种突变类型[14]–[15]。在CBFβ-MYH11阳性的AML人群中FLT3-TKD突变发生率较高，约为22％，FLT3-ITD突变率约3％，此前研究显示此类患者合并FLT3-TKD突变预后较差[13]。本组患者FLT3-TKD突变发生率为15.9％，FLT3-ITD突变发生率仅1.6％。合并FLT3-TKD基因突变的CBFβ-MYH11融合基因阳性AML患者其OS、EFS及DFS时间均缩短，且FLT3-TKD突变是影响DFS的独立危险因素，提示合并FLT3-TKD基因突变对判断该类患者的预后有一定价值。本组FLT3-ITD突变例数少，其结果仍需扩大样本量进一步研究。目前KIT基因突变对CBFβ-MYH11阳性AML患者的影响存在争议[4],[13],[16]。本研究中，KIT突变率最高，合并KIT基因突变，对患者预后无显著影响。同时未发现KRAS、NRAS、PTPN11和PHF6突变与OS、EFS和DFS的相关性。

WT1基因具有转录因子和调节组织发育的作用[17]，在造血过程中，WT1的表达对于髓系分化十分重要。AML患者WT1基因突变率约10％，主要发生框外缺失/插入或过早的终止密码子，导致蛋白截断，产生细胞功能障碍。研究证实，AML患者合并WT1突变预示不良临床结局[18]，而此前在合并CBFβ-MYH11融合基因阳性的亚型中的相关研究纳入病例较少[19]，本研究发现WT1基因突变在CBFβ-MYH11阳性AML患者中发生率较高，且是影响预后的独立危险因素。

综上，CBFβ-MYH11融合基因阳性AML患者，初诊外周血原始细胞高比例、FLT3-TKD、WT1基因突变均提示预后较差，且WT1、FLT3-TKD基因突变独立影响该类AML预后。本组数据分析表明CBFβ-MYH11融合基因阳性AML致病因素复杂，影响预后因素多样，特定基因突变与预后密切相关，预后良好和预后较差的多种因素交互影响结局。基因检测有必要常规进行，以协助诊断，细化危险度分层，明确疾病的预后并指导个体化治疗，发现新的治疗靶点，以期获得最佳预后。

本研究尚有不足之处，数据来源于单中心，最终筛选出的目标人群样本量受限。部分基因如CEBPA、TET2、GATA2等突变发生率较低，未能明确其与预后的关系。今后将加强多中心协作，延长随访时间，积累更多样本提高研究的准确性与代表性。