Liquid Biopsy in Breast Cancer.

In recent years, the blood-based analysis of circulating tumour cells (CTCs) and nucleic acids (DNA/RNA), otherwise known as liquid biopsy, has become increasingly important in breast cancer. Numerous trials have already underscored the high prognostic significance of CTC detection in both early and metastatic stages. Moreover, the changes in CTC levels and circulating tumour DNA (ctDNA) during the course of the disease correlate with the response to treatment. Research currently focuses on liquid-biopsy based therapeutic interventions in metastatic breast cancer. In this context, alpelisib, a PI3K inhibitor, was the first agent to be approved by FDA and EMA. The Author(s). This is an open access article published by Thieme under the terms of the Creative Commons Attribution-NonDerivative-NonCommercial License, permitting copying and reproduction so long as the original work is given appropriate credit. Contents may not be used for commecial purposes, or adapted, remixed, transformed or built upon. (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Introduction

In the last century, scientific and clinical advances in the diagnosis and treatment of breast cancer have resulted in a significant paradigm shift. The so-called “Halsted Doctrine”, which viewed breast cancer as a local event with healing only possible by the most radical surgery, was replaced by the “Fischer Doctrine”, which regards even early stage breast cancer as a systemic disease 1 . Today we know that haematogenous dissemination already takes place in very early stages of breast cancer and that the circulating tumour cells (CTCs) will even be found in patients with pre-invasive breast lesions 2 . At the same time the hypothesis of metastatic inefficiency states that most of these cells are eliminated by the immune system or the mechanical shear forces in the blood 3 ,  4 . Only a small CTC subpopulation can persist for long time in the blood or other “homing sites”, such as the bone marrow, and is considered a surrogate marker of minimal residual disease (MRD). These cells also exhibit long-term tumour cell dormancy and may be detected in the peripheral blood even many years after the initial diagnosis of the disease 5 .

It still remains unclear which characteristics contribute to certain CTCs being able to “wake up” and survive several steps of the metastatic cascade in order to later evolve into distant metastases. One theory currently under discussion states that these cells are particularly aggressive and undergo the so-called epithelial-mesenchymal transition (EMT). This process involves a number of changes, for example, the loss of polarity and intercellular adhesion, an increase in mobility and invasiveness, and finally the loss of the epithelial, and acquisition of the mesenchymal, phenotype 6 . Furthermore, EMT can generate cells with stem cell characteristics that have resistance mechanisms as well as a very high potential of self-renewal and may be regarded as actual precursors of distant metastasis 7 ,  8 .

The Concept of Liquid Biopsy

In breast cancer patients peripheral blood samples may contain not only circulating tumour DNA (ctDNA) and/or RNA fragments (non-coding RNA, ncRNA) but also intact CTCs. The ctDNA/RNA fragments are released continuously into the bloodstream by the primary cancer and/or the metastatic lesion itself and by the decaying CTCs. Liquid biopsy is defined as the detection and analysis of these blood-borne biomarkers in cancer patients. Thus, in heterogeneous tumours such as breast cancer, oncogene mutations and amplifications may be detected more effectively than with tissue biopsies, which only represent a limited tumour area 9 ,  10 . Further benefits compared to tissue biopsy include the possibility of serial analyses by simple blood sampling and the detectability of multiple or hard to reach metastases. In addition, due to its low invasiveness liquid biopsy acceptance is very high among patients. This paper presents the current data on clinical significance as well as the potential applications of liquid biopsy in primary and metastatic breast cancer.

Detection Techniques

Circulating tumour cells

In principle CTC detection involves two independent steps: Isolation of the cells from the whole blood and their actual detection. Isolation of these cells from the other constituents of the blood draws on various cell characteristics, mainly physical (size- and/or density-based) and biological (specific antigen expression). Examples include the so-called density gradient technique with Ficoll and antigen-based modalities with epithelial (e.g., EpCAM, cytokeratins) and/or tumour-specific markers such as CEA or HER2. In antibody-based isolation, the specific antibodies are mostly coupled to magnetic particles, with the enriched cells then being separated by a magnetic field for further analysis.

The subsequent CTC detection may then be based again on nucleic acid (RT-PCR, qRT-PCR, multiplex RT-PCR) or the antigen characteristics (immunocytochemistry, immunofluorescence, immunofluorescence flow cytometry) of the CTCs. While the sensitivity and specificity of nucleic-acid based detection is rather high, their drawback is CTC lysis during the analysis, making it impossible to assess cell morphology or perform further cell analysis.

The most common technique for CTC detection in clinical trials is the CellSearch system (Menarini Silicon Biosystems, Inc.), which has been approved by the U. S. Food and Drug Administration (FDA) for metastatic breast, colon and prostate cancer. With this standardised assay, EpCAM-positive CTCs are isolated immunomagnetically from 7.5 ml whole venous blood and subsequently stained by immunofluorescence with antibodies against cytokeratins (CK) 8, 18, 19, the specific leukocyte marker CD45, and the nuclear marker DAPI. The sample is then scanned by a semi-automatic fluorescence microscope and the potential CTCs are automatically imaged. Finally, the analysis is performed by an experienced examiner: CK 8/18/19 and DAPI-positive as well as CD45-negative cells with specific morphology are identified as CTCs ( Table 1 ,  Fig. 1 ). The CTCs detected by the CellSearch system can be harvested by micromanipulation and are available for further analysis (e.g., single-cell gene expression analysis). The downside of this technique is on the one hand the subjective assessment by the examiner, and on the other hand also the fact that it is an EpCAM-based technique and the cells cannot be detected after EMT due to the loss of epithelial characteristics 11 ,  12 .

Table 1  Examples of typical cytomorphological criteria for the identification of isolated tumour cells (based on 13 ).

Cell morphology/phenotype
Nuclear enlargement
Large nucleoli
Cell cluster
Cytoplasm with marked and/or irregular staining
Nucleus with irregular, granular structure
Cell size > size of haematopoietic cells
Nucleus partially covered by immunocytological staining
Cytokeratin filaments with mesh-like structure

Fig. 1

 Detection of isolated tumour cells by various techniques: a  Apoptotic tumour cell stained by immunocytochemistry (M30 antibody [AK]); b  Vital tumour cell stained by immunocytochemistry (anti-cytokeratin [CK]-AK); c  Immunofluorescence, double staining (anti-CK-AK: green, anti-oestrogen receptor-AK: red); d  Immunofluorescence-stained tumour cell cluster (anti-CK-AK).

Another challenge in CTC diagnostic work-up is the low detection rate, primarily in non-metastatic patient populations. Particularly in view of the known heterogeneity of the tumour, it is advisable to analyse as many CTCs of a patient as possible. In this context, many enrichment/isolation techniques have been explored in recent years to increase the detection rate. Another possible approach is the analysis of larger blood volumes, for example, as part of diagnostic leukapheresis (DLA). On average, this extracorporeal filtration procedure will filter 2770 ml of blood. The CTCs are isolated by density gradient and an aliquot of the DLA product is then analysed with the CellSearch system. This significantly increases the CTC detection rate and number of CTCs identified 14 . However, analysis of large blood volumes requires considerable time on the part of the patient: the procedure takes about one hour. Lab panel changes after DLA have also been observed, e.g., slight decreases in leukocyte and haemoglobin counts, though these are not clinically significant. It remains to be seen to what extent the collection of several thousand CTCs will have an impact on clinical significance and whether DLA will improve CTC-based diagnostic work-up.

Circulating tumour DNA

The term circulating tumour DNA (ctDNA) refers to free DNA fragments, originating from the tumour (primary tumour, metastasis, isolated tumour cells), which can be detected in blood and other body fluids. This must be distinguished from the broader term cell-free DNA (cfDNA) or free circulating DNA (fcDNA) , which refers to all non-tumour specific cell-free DNA fragments. Decaying normal cells can also release cfDNA into the blood. While the older trials primarily focused on the detection of the total amount of freely circulating DNA in the blood, more recent studies have addressed the specific detection techniques for ctDNA.

Detection is usually carried out on blood plasma. Detection is determined by the percentage of ctDNA compared to cell-free DNA from normal cells. Since this percentage may be quite small, ctDNA detection requires highly sensitive techniques. These include digital-droplet PCR (ddPCR), beads amplification magnetics-PCR (BEAMing-PCR), and digital next-generation sequencing (dNGS) 15 ,  16 ,  17 . Here, ddPCR and BEAMing-PCR are the so-called targeted detection techniques (targeted approach), in which only a few gene loci can be examined simultaneously. In other words, the search is targeted at specific, already known tumour mutations, e.g., in genes PIK3CA, ESR1, AKT1, ERBB2 and PTEN. The term dNGS, on the other hand, summarises several non-targeted gene analysis techniques (untargeted approach), where large DNA molecules are sequenced and thus numerous unknown genetic alterations and mutations can be detected. These include, for example, array CGH (array-comparative genomic hybridization), whole-genome sequencing and exome sequencing. These techniques usually identify gene mutations that may contribute to the assessment of developing resistance 15 ,  16 .

Clinical Applications of Liquid Biopsy in Early Breast Cancer

Improved prediction of prognosis

Individual tumour cells reaching the blood vessels and their subsequent dissemination are important steps in the metastatic cascade. According to studies, pre-invasive lesions of the breast, such as ductal carcinoma in situ (DCIS), can be accompanied by tumour cell dissemination 2 ,  18 , so that haematogenous tumour cell dissemination is considered an early event in the course of malignant disease. The CellSearch system can detect circulating tumour cells in 20 – 30% of patients with non-metastatic breast cancer 19 ( Table 2 ). In a pooled analysis, Janni et al. were able to evaluate the data of 3173 patients with stage I – III breast cancer and demonstrated that the detection of at least one CTC in 7.5 ml blood predicts a significantly worse clinical outcome 19 . CTC-positive patients were twice as likely to die from breast cancer as women who did not have CTCs at the time of diagnosis (hazard ratio [HR]: 2.04; 95% CI: 1.52 – 2.75). CTC-positivity also correlated with a statistically significant shorter overall survival (HR 1.97; 95% CI: 1.51 – 2.59), disease-free survival (HR 1.82; 95% CI: 1.47 – 2.26) and distant disease-free survival (HR 1.89; 95% CI: 1.49 – 2.40).

Table 2  Prognostic significance of circulating tumour cells in breast cancer: the most important trials.

Trial	Number of patients	Stage	Positivity raten (%)	Assay	Correlation with prognosis
1 defined as ≥ 1 CTC per 7.5 ml 2 defined as ≥ 5 CTCs per 7.5 ml Acronyms: BCSS – breast cancer-specific survival; DDFS – distant disease-free survival; DFS – disease-free survival; LRRFS – loco-regional recurrence-free survival; OS – overall survival; pCR – pathological complete response
Janni et al. 19	3173	Stage I – III	641 (20%) 1	CellSearch	DFS, DDFS, BCSS, OS
Cristofanilli et al. 20	2436	Stage IV	1099 (45.1%) 2	CellSearch	OS
Bidard et al. 21	1574	Stage I – III before neoadjuvant chemotherapy	398 (25.2%) 1	CellSearch	OS, DDFS, LRRFS; pCR rate higher in case of CTC positivity (24.2% vs. 17.4%)

While large meta-analyses ( Table 2 ) have confirmed the prognostic relevance of CTCs, the existing data on circulating DNA is much less extensive ( Table 3 ). A meta-analysis published in 2018 by Tan et al. included a total of 1127 patients from 10 trials, the majority with non-metastatic disease 22 . Unlike in the pooled analyses on CTC significance, the populations here were markedly smaller (336 patients maximum). In addition, the heterogeneity of the different assays used hampered direct comparison of the trials considerably. Some of the trials analysed the total amount of cfDNA, while the others studied the detection of pre-defined genomic alterations. Despite these shortcomings, the meta-analysis suggests a possible prognostic significance of cfDNA and mutation detection in non-metastatic breast cancer.

Table 3  Prognostic significance of circulating DNA in breast cancer patients (based on: 22 , only trials with at least 100 patients were included).

Trial	Number of patients	Setting	Technique:	Prognostic significance: OS
1 Serum 2 Plasma Acronyms: dPCR – digital PCR; HR – hazard ratio; OSMSP – one-step methylation-specific PCR; PCR-SSCP – PCR-single-strand conformation polymorphism; RFS – relapse-free survival
Fujita et al. 23	336	Stage I – II	OSMSP 1 Met-DNA (±)/Total cfDNA (high/low)	OS: Yes (HR for Met-DNA 3.17; for total cfDNA 4.03) DFS/RFS: Met-DNA: No (HR 2.3)Total cfDNA: Yes (2.70)
Fernandaz-Garcia et al. 24	194	Stage IV	TaqMan, RT-PCRTotal cfDNA (high/low)	OS: yes (HR 2.296)
BRE12–158 25	151	Stage I – IIItriple-negative, non-pCR	FoundationOne Liquid 2 ctDNA (±)	OS: yes (HR 2.7) DDFS: yes (HR 3.1)
Garcia et al. 26	142	Stage I – III	PCR-SSCP 2 ctDNA (±)	OS: no (HR 1.60) DFS/RFS: yes (HR 2.70)
Fujita et al. 27	120	Stage II – IIIpost-therapy	OSMSP 1 Met-DNA (±)/Total cfDNA (high/low)	OS: yes (HR for Met-DNA 4.91; for total cfDNA 4.11) DFS/RFS: yes (HR for Met-DNA 4.23; for total cfDNA 1.93)
Shaw et al. 28	112	Stage IV	ddPCR 2 Total cfDNA	OS: yes (HR 2.20)
Shaw et al. 29	110	Stage I – III	dPCR 1 mut. PIK3CA (±)	OS: no (HR 3.92) DFS/RFS: yes (HR 4.78)

Liquid biopsy treatment monitoring

Non-invasive diagnostic blood tests allow serial studies which can be repeated as often as needed during treatment or after its completion. This provides unique insight into the current cancer situation. Since systemic treatment exerts a selection pressure on MRD, blood samples can help assess the persistent tumour cell population 30 . This way, it is possible to monitor the response to treatment and identify those patients with increased risk of relapse who might benefit from additional therapeutic approaches.

We now know that CTCs can persist beyond (neo)adjuvant therapy (so-called persistent CTCs, Table 4 ). The SUCCESS trial, initiated in Germany, was the largest analysis of CTC persistence in non-metastatic disease to date 31 . In 2026 patients, CTCs were examined with the CellSearch system before the patients started adjuvant chemotherapy. At least one CTC was detected in 21.5% of the women. After completion of chemotherapy, a blood sample was taken from 1493 patients. The positivity rate was 22.1%. The detection of CTCs prior to chemotherapy correlated with clinical outcome (DFS, DDFS, BCSS and OS), but only to a limited extent with CTC persistence. For example, 76 patients had a positive CTC status both before and after chemotherapy. In 936 women both blood samples were CTC-negative. In 491 patients the CTC status changed (+ → − in 238 cases and − → + in 253 cases). The detection of persistent CTCs predicted unfavourable clinical outcomes (DFS: hazard ratio 1.124, p = 0.02, OS: hazard ratio 1.162, p = 0.06). This suggests the development of effective resistance mechanisms by the tumour cells, allowing them to evade the effects of cytotoxic treatment 21 ,  31 . In addition, neoadjuvant studies have shown that CTC response does not correlate with primary tumour response to treatment.

Table 4  Clinical significance of persistent CTCs in early breast cancer.

Trial	Number of patients	Setting	Positivity rate(%)	Correlation with survival
1 Analysed with CellSearch 2 Analysed with AdnaTest Acronyms: DDFS – distant disease-free survival; DFS – disease-free survival; NACT – neoadjuvant chemotherapy, OS – overall survival
Rack et al. 31	1493	Stage I – IIIN+ or high-risk N0Blood test after adjuvant chemotherapy	22% 1	yes: DFS, OS
Bidard et al. 21	1200	Stage I – IIIBlood test after NACT	15% 1	yes: OS, DDFS
Riethdorf et al. 32	207	high-riskBlood test after NACT	11% 1	not analysed
Kasimir-Bauer et al. 33	133	Stage II – IIIBlood test before and after NACT	8% 2	no

Numerous smaller studies have explored the question of how the detection of circulating DNA may complement treatment monitoring in early breast cancer ( Table 5 ). Li et al. studied plasma samples before, during and after neoadjuvant chemotherapy in 52 patients and demonstrated that ctDNA analysis after 2 cycles of treatment correlated better with pCR probability than radiological diagnostic work-up 34 . Similar results were reported by Magbanua et al., who performed ctDNA ultra-deep sequencing in 84 patients treated in the I-SPY 2 trial 35 . Within 3 weeks after treatment was started, the ctDNA positivity rate dropped sharply from 73 to 35%. All patients who achieved pCR were ctDNA negative after chemotherapy. In the non-pCR subset, the detection of persistent ctDNA after NACT predicted a significantly increased risk of metastasis (hazard ratio 10.4).

Table 5  Clinical significance of circulating DNA during and after neoadjuvant therapy in early breast cancer: Summary of the key trials.

Trial	Number of patients	Technique	Positivity rate (%)	Results
Acronyms: AUC – area under the curve; DFS – disease-free survival; ddPCR – digital droplet PCR; dPCR – digital PCR; DDFS – distant disease-free survival; EFS – event-free survival; NACT – neoadjuvant chemotherapy; NGS – next generation sequencing; OS-MSP – one-step methylation-specific PCR; RCB – residual cancer burden
Takahashi et al. 36	87	OS-MSP	23% before NACT	ctDNA persistence associated with RCB
Magbanua et al. 35	84	Ultra-deep sequencing	73% before NACT9% after NACT	Persistent ctDNA 3 weeks after start of NACT associated with pCR (pCR rate 17% vs. 48%, p = 0.012); ctDNA detection after NACT associated with DDFS
NeoALTTO trial 37	69	Mutation analysis PIK3CA and TP53 (ddPCR)	41% before NACT20% 2 weeks after start5% after NACT	Persistent ctDNA 2 weeks after start of NACT associated with a lower probability of pCR, but not EFS
Garcia-Murillas et al. 38	55	dPCR, high-depth DNA sequencing	69% before NACT19% 2 – 4 weeks postop.	ctDNA persistence 2 – 4 weeks postop. associated with DFS (hazard ratio 25.1)
Li et al. 34	52	NGS panel of 1021 genes	48% before NACT (most mutations in genes TP53, PIK3CA, GAB2, and IRS2); ctDNA persistence in 70% of initially ctDNA-positive pts.	ctDNA after 2 cycles predicted the pathological response (AUC 0.81); higher rate of relapse in case of persistent ctDNA (50 vs. 33%)
Sharma et al. 39	30	Methylation analysis (genes BRCA1, MGMT, GSTP1, stratifin, MDR1)	Methylation before NACT: 76% at least 1 gene; 53% (BRCA1), 37% (MGMT), 43% (GSTP1), 83% (stratifin), 60% (MDR1) (76%)	Tumour response associated with increased methylation before NACT and decreased methylation after NACT
Moss et al. 40	30	Methylation analysis	80% before NACT	marked decrease in cfDNA under NACT; cfDNA associated with pCR in last month of NACT (p = 0.006)

Liquid biopsy potential in follow-up

After completion of the primary therapy, which usually comprises surgery and, depending on the subtype and the extent of surgical treatment, radiotherapy and chemotherapy, possibly in combination with targeted therapy, when trying to estimate the remaining risk of relapse, the attending physician can nowadays only refer back to the characteristics of the disease at the time of the initial diagnosis. There are no other tools available allowing individualised risk estimation. On the other hand, during follow-up patients have a strong desire to learn their chances of recovery. In this context some women demand analysis of the classical tumour markers (e.g., CEA, CA 15-3), a step which the current guidelines expressly discourage 41 ,  42 . Several trials have explored how liquid biopsy can improve the prediction of prognosis in the follow-up of asymptomatic patients.

In 2018, the data from two large-scale adjuvant therapy trials were published, which studied the significance of CTC testing 5 years post-diagnosis in translational subprojects ( Table 6 ). The CellSearch system was used in both trials. Interestingly enough, the prognosis in women with persistent CTCs was significantly poorer than in the CTC-negative population, especially in the subgroup of HR-positive tumours. For example, the U. S. trial demonstrated that the annual risk of recurrence was 21.4% when at least one CTC was detected, compared to only 2% in CTC-negative women.

Table 6  Clinical significance of persistent CTC in follow-up.

Trial	Number of patients	Date of CTC analysis	Positivity rate (%)	Median follow-up period	Correlation with prognosis
ECOG-ACRIN E5103 47 ,  48	547HER2-negative stage II – III	4.5 – 7.5 years post-diagnosis	4.8%	2.6 years	Risk of relapse 12.7 × higher in patients with persistent CTCs; risk of relapse per patient/year in the HR-positive population: 21.4 vs. 2.0%
SUCCESS-A 49	206Stage I – III (high-risk)	median 62 months post-diagnosis	7.8%	1 year	In HR-positive population: risk of relapse higher in CTC-positive pts. (hazard ratio 5.95)

According to smaller trials the circulating DNA may also contribute to risk stratification in the follow-up of asymptomatic patients 43 ,  44 ,  45 ,  46 . In a group of 101 women Garcia-Murillas et al. were able to establish that serial ctDNA measurements can predict the risk of recurrence 44 . Blood tests were repeated every 3 months in the first year and then every 6 months for 5 years. ctDNA detection was based on the somatic mutations in the tumour tissue, which were analysed by dPCR in the blood. Patients in whom ctDNA was detected during the course of chemotherapy experienced a markedly shorter recurrence-free survival (hazard ratio 16.7, p < 0.001), with the first blood samples after completion of chemotherapy being initially ctDNA-negative in most patients. Clinical recurrence or distant metastasis was observed a median of 10.7 months after the first ctDNA-positive blood test. Interestingly enough, since ctDNA progression did not correlate with the presence of brain metastases, this location may remain “mute” in liquid biopsy-based detection.

The EBLIS trial also confirmed the potential of ctDNA-based monitoring in follow-up 45 . Here, in the first 4 years after completion of chemotherapy, blood tests were performed every 6 months. ctDNA detection relied on the detection of individual tumour-specific mutation signatures, which were established by analysing the primary tumours. Clinical assessment of the course of the first 49 patients revealed that ctDNA detection occurred a median 8.9 months before local or distant relapse.

It is still unclear how these findings can be implemented in routine clinical practice and which diagnostic or therapeutic consequences might derive from a positive ctDNA blood test result. In the British c-TRAK TN trial (NCT03145961), monitoring by ctDNA testing is performed every 3 months after completion of therapy in triple negative disease. Patients with persistent ctDNA are randomized to pembrolizumab or observation. In Germany, the SURVIVE trial initiated by the Department of Obstetrics & Gynaecology at Ulm University Medical Centre plans to study the significance of liquid biopsy in follow-up.

Liquid biopsy-based therapeutic interventions

The adoption of blood-based biomarkers in the practice of early breast cancer has been hampered to date by the uncertainty regarding the clinical consequences. One of the few trials exploring possible CTC-based therapeutic intervention in non-metastatic disease was the multicentre Treat CTC trial 50 . Here, patients with HER2-negative primary tumour and persistent CTCs after completion of (neo)adjuvant chemotherapy were randomised to 6 cycles of trastuzumab or observation. A total of 1317 patients were screened. CTCs were detected in 95 women, of which 63 were successfully randomised. Since the primary endpoint (successful CTC elimination by trastuzumab) was not met, the trial was terminated. Nor did HER2-targeted therapy improve clinical outcome: after a median follow-up of 13 months, invasive disease-free and overall survival were the same in both arms. The precise inclusion criteria must be taken into account when assessing this result. The HER2 status of the CTCs did not impact on possible enrolment in the trial. Thus, patients with HER2-negative CTCs who, as expected, did not benefit from trastuzumab were also randomised. When planning future trials, the phenotype and genotype characteristics of the detected cells should be included, if possible.

Clinical Applications of Liquid Biopsy in Metastatic Breast Cancer

In the metastatic setting, CTC detection can complement the prediction of prognosis as well. In 2019, the course in 2436 patients with metastatic disease was evaluated in a retrospective pooled analysis of 18 centres 20 ( Table 2 ). 54% of patients had already received systemic therapy for their metastatic disease. CTC detection in all trials analysed was performed on the CellSearch system. However, due to the higher concentration of CTCs in metastatic disease, a different cutoff proved to be effective: in most trials 5 or more CTCs per 7.5 ml of blood was considered elevated (or CTC-high). In the pooled analysis, patients with ≥ 5 CTCs per 7.5 ml blood were classified as CTC aggressive and those with < 5 CTCs as CTC indolent . The analysis confirmed that the presence of increased CTC levels in metastatic disease correlated significantly with shorter overall survival (median OS: 36.3 in CTC aggressive vs. 16.0 months in CTC indolent , p < 0.0001) and this association was observed in all subtypes of the tumour 20 . In multivariate analysis, the following factors were associated with shorter OS: prior treatment, poor differentiation, triple-negative phenotype, visceral metastasis, and presence of ≥ 5 CTCs, with the CTC count as the strongest predictor of OS (HR 2.71, 95% CI 2.35 – 3.12, p < 0.0001).

Few trials explored the prognostic value of circulating DNA in metastatic disease ( Table 3 ). Shaw et al. analysed blood samples from 112 patients with prior treatment 28 . Elevated cfDNA levels correlated with shorter overall survival. In addition, ctDNA and CTCs were detected. ctDNA was identified by detecting mutations in the genes PIK3CA, TP53, ESR1, and KRAS. Interestingly enough, elevated cfDNA levels were usually detected in patients with high ctDNA levels. In terms of the mutation profile, the ctDNA reflected the mutations that were detected in the CTCs.

According to several trials, clinical response in metastatic disease is reflected by changes in the CTC numbers 16 . A marked decrease in CTCs is usually noted even after the first cycle of palliative chemotherapy. Smerage et al. and Martin et al. were able to demonstrate that after the first cycle of therapy < 5 CTCs were detected in 47 – 57% of patients with initial counts of ≥ 5 CTCs 51 ,  52 . Consistently high CTC numbers 3 – 4 weeks after the start of treatment on the other hand indicate an increased risk of progression. This allows faster assessment of the response than with conventional radiological diagnostic work-up. However, the clinical consequences to be derived from consistently high CTC counts remain unclear. This question was explored by the randomised phase-III trial of the US SWOG study group 51 . A total of 595 patients with metastatic breast cancer received their first-line chemotherapy in the trial. 43% of the 319 women with elevated CTC levels before treatment was initiated continued to have ≥ 5 CTCs after the first cycle. These patients were randomised either to a different treatment regimen or to continued treatment without change. The best survival was observed in patients with low initial CTC levels (35 months), followed by women whose high initial CTC levels dropped after the first cycle (23 months) and patients with persistent CTC (13 months). Interestingly enough, since the change in treatment did not yield the hoped-for improvement in prognosis, the CTC persistence predicts resistance to traditional cytotoxic agents. It is possible that patients with sustained high CTC levels could benefit from immunological, targeted or experimental approaches.

The detection of circulating DNA was integrated into the translational adjunct programmes of several trials. In the BEECH trial, Hrebien et al. addressed the question of how serial ctDNA measurements could complement monitoring under chemotherapy 53 . In this randomized phase-II trial, patients with ER-positive, HER2-negative tumours received first-line treatment with paclitaxel and the AKT inhibitor capivasertib versus placebo. First, mutations in the baseline samples were evaluated, with the latter then undergoing detection by mutation-specific ddPCR. As early as one week after the start of treatment, changes in ctDNA levels were observed that could predict progression-free survival. The best correlation with progression-free survival (PFS) was observed for blood samples taken on day 1 of the second treatment cycle (q4w) (11.1 vs. 6.4 months, hazard ratio 0.2). Both arms showed an equally strong drop in ctDNA levels, reflecting the lack of clinical benefit of capivasertib that has since been demonstrated.

The PALOMA-3 trial also confirmed the high significance of early ctDNA testing 54 . In this phase-III trial, a total of 521 patients progressing under endocrine therapy were randomised to treatment with fulvestrant and the CDK4/6 inhibitor palbociclib vs. placebo. In 455 patients enrolled in the trial, the blood sample drawn before starting treatment was analysed by multiplex dPCR for hotspot mutations in the PIK3CA gene. At least one mutation was detected in 100 women, in 73 patients a blood sample was also analysed on day 15 of treatment. In the palbociclib arm, the drop in ctDNA between baseline and day 15 was markedly more pronounced than in the placebo arm. Based on these results, it may be surmised that ctDNA dynamics may serve as a suitable surrogate parameter for the early benefit assessment of new agents.

At the ASCO Symposium 2020 the results of two CDK4/6 trials were presented, which had studied ctDNA measurements in their translational adjunct programmes 55 ,  56 . The PADA-1 trial evaluated the clinical significance of the ESR1 mutation detected in cell-free DNA of 1017 patients under treatment with aromatase inhibitors and palbociclib 56 . All patients presented with ER-positive, HER2-negative metastatic disease and received first-line treatment in the trial. The serial blood samples were analysed by ddPCR. Before treatment was initiated, the ESR1 mutation was detected in 3.2% of patients, most of whom had already undergone adjuvant treatment with an aromatase inhibitor. In 78% of the patients the mutation was eliminated from the cfDNA within the first 5 months of treatment. Patients with a mutation in the ESR1 gene before starting treatment had a shorter PFS than women without a mutation in the cfDNA. It remains to be seen how these results might affect treatment decisions in ESR1 mut patients in everyday clinical practice. In addition, ctDNA analysis was presented at the ASCO Symposium 2020 in the context of the three trials on ribociclib, MONALEESA-2, -3 and -7 55 . The blood samples of 1503 patients in total were analysed by NGS for alterations in 557 genes before endocrine-based treatment was initiated. Alterations in the genes FRS2, PRKCA, MDM1, ERBB2, AKT1, and BRCA1/2 predicted a stronger PFS benefit for ribociclib (statistical trend), while patients with alterations in genes CHD4, BCL11B, ATM, and CDKN2A/2B/2C benefited little or not at all from ribociclib. Future trials must establish whether the genes studied can contribute to the early detection of resistance in the context of treatment monitoring.

Today, treatment of the patient with metastatic disease is based on the predictive properties of the primary tumour or metastases. This assumes the need for invasive tissue sampling to obtain material for histological examination and may be associated with complications in case of difficult locations. On the other hand, the clonal heterogeneity of the malignant disease must be taken into account. Thus, individual metastases may differ from each other in terms of phenotype and genotype, but different populations can also be present within a metastatic mass. The analysed markers may also vary over time. A meta-analysis of 39 trials demonstrated that 22.5% of patients with initially ER-positive primary tumours developed ER-negative metastases 57 . Loss of HER2 status was observed in 21.3% of patients. In contrast, 9.5% of patients with HER2-negative primary tumours developed HER2-positive metastasis. For this reason, the Breast Committee of the Working Group for Gynaecological Oncology (AGO-Kommission Mamma) recommends a re-evaluation of the receptor status in metastatic disease.

Assuming that the blood-based biomarkers reflect the characteristics of the dominant tumour populations, the possible use of the liquid biopsy as foundation for treatment decisions is under intense discussion.

The STIC CTC study is one of the most important trials looking at CTC-based treatment choice 58 . In this phase-III trial, a total of 778 women with hormone-receptor-positive HER2-negative disease were randomised before starting their first-line therapy. In the CTC arm, the choice of treatment was based solely on the results of the blood test: Patients with < 5 CTCs received endocrine monotherapy, while women with ≥ 5 CTCs underwent chemotherapy. Blood was also taken in the control arm and examined with the CellSearch system, but the result remained blinded. In this arm, treatment was decided by the attending physician based on the usual clinical criteria. As the study was initiated in 2012, the study design did not include CDK4/6 inhibitors, which were only approved later. The STIC CTC trial met its primary endpoint: the CTC-based choice of treatment was not inferior to the physicianʼs decision, referred to as “treatment of physicianʼs choice”. The clinical outcome (PFS and OS) was the same in both arms. Interestingly enough, patients with discordant risk assessment (clinically low-risk but with high CTC counts or clinically high-risk with low CTC counts) benefited from chemotherapy in terms of overall survival. Since the STIC CTC trial did not include any endocrine-based combined treatment with CDK4/6 inhibitors, the first-line therapy selected most often at present in the hormone receptor-positive population, this trial does not currently provide any recommendation for everyday clinical practice.

Unlike the STIC CTC trial, which analysed the CTC counts as the basis for treatment decisions, the CirCe T-DM1 study explored the question of how the characteristics of CTCs can affect the choice of treatment 59 . It studied whether patients with histologically HER2-negative disease (determined for the primary tumour and/or metastases) and HER2-positive CTC status could benefit from HER2-targeted treatment. A total of 154 women with prior treatment for breast cancer were FisH-screened for HER2-amplified CTCs. In 14 cases at least one HER2-positive CTC was detected, 11 of which were target-treated with T-DM1 in the trial. The response rate was rather low at 9.1%. Only partial remission was achieved. The median PFS was 4.8 months and the OS 9.5 months. The lack of benefit of HER2-targeted therapy may possibly be explained by the heterogeneous nature of the CTCs. The majority of CTCs detected had a negative HER2 status and only 4.4% of CTCs exhibited HER2 amplification.

Other CTC-based treatment concepts are currently being studied in the DETECT trials, the worldʼs largest trial programme on CTC-based treatment interventions 50 ( Fig. 2 ).

Fig. 2

 Trial algorithm in the DETECT programme.

Unlike in diagnostic CTC work-up, ctDNA can already be considered in the routine clinical practice when choosing a particular treatment. According to several trials, somatic genetic alterations in the PIK3CA, ESR1, HER2, and PTEN genes can be detected and specifically targeted as “targetable mutations” ( Table 7 ).

Table 7  Possible alterations detectable in the ctDNA and their potential significance.

Gene/Marker	potential clinical significance
ESR1	Imparting endocrine resistance and unfavourable prognosis, depending on the variant resistance to everolimus (ESR1 D538G and Y 537S ), exemestan ( D538G , ESR1 mut ), fulvestrant ( Y537S, Y537C ), relative fulvestrant sensitivity (ESR1 mut )
PIK3CA	Prediction of response to therapy with PI3K inhibitor (alpelisib approved in Europe in 2020); potentially useful in treatment monitoring
AKT1	Prediction of response to AKT inhibitors such as capivasertib (AKT1 E17K )
HER2	Prediction of the response to neratinib in HER2 mut Treatment monitoring under anti-HER2 therapy
TP53	Imparting resistance to treatment
PTEN	Imparting resistance to treatment
BRCA	Prediction of the response to PARP inhibitors and platinum salts in somatic BRCA mutations in the ctDNA
Microsatellite instability (MSI), loss of heterozygosity (LOH)	Prediction of the response to targeted and immunological therapeutic approaches

The first agent with liquid biopsy-based indication was approved as a result of the SOLAR 1 trial 30 . Here, the PI3K inhibitor alpelisib in combination with fulvestrant was studied in patients with hormone receptor-positive HER2-negative disease. Alpelisib inhibits the enzyme PI3 kinase coded by the PIK3CA gene. Mutations in the PIK3CA gene are seen in up to 40% of patients in advanced stages and result in increasingly aggressive disease by activating the PI3K/Akt/mTOR signaling cascade. In the SOLAR 1 trial, a total of 572 patients were randomised to treatment with fulvestrant and alpelisib versus fulvestrant and placebo. The patients suffered from metastatic disease and had already undergone prior endocrine treatment. In all women, the PIK3CA mutation status was determined in the tumour tissue and in some cases also in the ctDNA. Detection of a mutation was associated with a significant PFS benefit when alpelisib was added, regardless of whether the mutation was detected in the tissue or in the ctDNA. Alpelisib has already been approved by the U. S. FDA in 2019 and by the European Medicines Agency in 2020.

With modern sequencing techniques, it is possible to study several potentially treatment-relevant mutations simultaneously. The PlasmaMatch trial 60 followed this approach, in which blood samples from a total of 1044 women with metastatic breast cancer were screened. A number of genetic alterations in the ctDNA were detected. The TP53 gene was most often affected (44.1%), followed by PIK3CA (34.9%), ESR1 (oestrogen receptor 1) (33.1%), PTEN (6.9%), HER2 (6.4%), and AKT1 (5.0%). The study design provided for mutation-triggered targeted treatment. For example, patients with ESR1 gene mutations were treated with fulvestrant, while women with HER2 gene mutations received anti-HER2 treatment with neratinib. In case of mutations in the PTEN or AKT1 gene, treatment with capivasertib was initiated. After analysis of the response, treatment with neratinib and capivasertib proved particularly promising (response rates: neratinib 25%, capivasertib 22 – 33%).

Table 8 summarises the current knowledge on liquid biopsy in early and advanced breast cancer.

Table 8  Clinical significance of CTCs and circulating DNA in breast cancer.

		CTCs	Circulating DNA
M0	Prognostic significance	Very high (confirmed in meta-analyses)	Probably high; limitation: small case numbers, rather brief follow-up, differences in methodology
	Treatment monitoring	Persistence after (neo)adjuvant chemotherapy predicts worse outcome	Persistence after (neo)adjuvant chemotherapy predicts worse outcome; ctDNA dynamics correlate with pCR
	Follow-up complement	Potentially significant, especially in HR positive disease: CTC detection within 5 years post-diagnosis predicts an increased risk of relapse	Potentially significant: ctDNA positivity predicts an increased risk of relapse
	Liquid-biopsy based therapeutic interventions	No positive trials to date, potential unclear; TREAT CTC trial without benefit of trastuzumab in persistent CTC (HER2 status of CTCs not considered)	No positive trials to date, potential unclear
M1	prognostic significance	Very high (confirmed in meta-analyses)	Probably high; limitation: few trials, small case numbers, differences in methodology
	Treatment monitoring	High potential: Persistence after 1st cycle chemotherapy correlates with response, clinical consequence unclear	High potential: Persistence after 1st cycle of treatment correlates with response, clinical consequence unclear
	Liquid biopsy-based therapeutic interventions	First positive trial (STIC CTC): CTC-based choice of first-line therapy is not inferior to oncologistʼs choice; clinical consequence unclear; further trials pending (e.g. DETECT study programme)	Main area of use: Detection of somatic mutations in the ctDNA as basis of indication for targeted therapy: Alpelisib approved in the USA and Europe for patients with a mutation in the PIK3CA gene

Liquid biopsy refers to the study of circulating tumor cells and nucleic acids (DNA/RNA) in the blood.

The prognostic significance of CTC detection in patients with breast cancer is very high in both early and metastatic stages.

The dynamics of CTCs and ctDNA correlate with response to palliative treatment.

Oncologic research currently focuses on liquid biopsy-based therapeutic interventions in metastatic breast cancer. The PI3K inhibitor alpelisib is the first agent approved in this context.

Einleitung

Dank wissenschaftlicher und klinischer Erkenntnisse erlebten die Diagnostik und Therapie des Mammakarzinoms im letzten Jahrhundert einen erheblichen Paradigmenwechsel. Die sog. „Halsted-Doktrin“, die den Brustkrebs als lokales Geschehen und die Heilung in der möglichst radikalen Operation gesehen hatte, wurde von der „Fischer-Doktrin“ abgelöst, die das Mammakarzinom bereits in frühen Stadien als eine systemische Erkrankung betrachtet 1 . So wissen wir heute, dass die hämatogene Streuung schon in sehr frühen Brustkrebsstadien stattfindet und die zirkulierenden Tumorzellen (engl. circulating tumor cells = CTCs) sogar bei Patientinnen mit präinvasiven Läsionen der Mamma nachgewiesen werden können 2 . Gleichzeitig besagt die Hypothese der metastatischen Ineffizienz (engl. metastatic inefficiency), dass die meisten dieser Zellen vom Immunsystem oder durch mechanische Scherkräfte des Blutes eliminiert werden 3 ,  4 . Lediglich eine kleine CTC-Subpopulation ist in der Lage, langfristig im Blut oder in anderen „homing sites“, wie dem Knochenmark, zu persistieren, und gilt als Surrogatmarker der minimalen residualen Tumorerkrankung (engl. minimal residual disease = MRD). Diese Zellen können auch sehr lange Zeit in einem sog. Schlafzustand (engl. tumor cell dormancy) verharren und auch viele Jahre nach der Erstdiagnose der Erkrankung im peripheren Blut detektiert werden 5 .

Welche Eigenschaften dazu beitragen, dass bestimmte CTCs imstande sind, „aufzuwachen“ und mehrere Schritte der Metastasierungskaskade zu überleben, um später Fernmetastasen zu bilden, bleibt nach wie vor nicht endgültig geklärt. Eine der aktuell diskutierten Theorien besagt, dass es sich hier um besondere aggressive Zellen handelt, welche die sog. epithelial-mesenchymale Transition (EMT) durchlaufen. Hierbei handelt es sich um einen Prozess, der eine Reihe von Veränderungen beinhaltet, beispielsweise den Verlust der Polarität und der interzellulären Adhäsion, eine Zunahme der Mobilität und der Invasivität sowie schließlich den Verlust des epithelialen und Erwerb des mesenchymalen Phänotyps 6 . Des Weiteren können im Rahmen der EMT Zellen mit Stammzelleigenschaften generiert werden, die über einen sehr hohen Selbsterneuerungspotenzial sowie Resistenzmechanismen verfügen und als eigentliche Vorläufer der Fernmetastasierung angesehen werden 7 ,  8 .

Das Konzept der Liquid Biopsy

Neben den intakten CTCs können auch zirkulierende Tumor-DNA (ctDNA) und/oder RNA-Fragmente (non-coding RNA, ncRNA) im peripheren Blut der Mammakarzinompatientinnen nachgewiesen werden. Diese werden zum einem durch den Primärtumor und/oder die metastatische Läsion selber und zum anderen durch die zugrunde gehenden CTCs kontinuierlich in die Blutbahn abgegeben. Als Liquid Biopsy wird die Detektion und die Untersuchung dieser blutbasierten Biomarker bei Karzinompatienten bezeichnet. Auf diese Weise können bei heterogenen Tumoren wie dem Mammakarzinom z. B. Mutationen und Amplifikationen von Onkogenen ggf. adäquater als mit einer Gewebebiopsie, die nur ein begrenztes Tumorareal abbildet, nachgewiesen werden 9 ,  10 . Weitere Vorteile gegenüber der Gewebebiopsie sind die Möglichkeit der seriellen Untersuchungen durch einfache Blutentnahmen und die Erfassbarkeit multipler bzw. schwer erreichbarer Metastasenherde. Zudem ist die Akzeptanz der Liquid Biopsy aufgrund ihrer geringen Invasivität bei Patientinnen sehr hoch. Im folgenden Beitrag werden die aktuelle Datenlage zur klinischen Relevanz sowie die potenziellen Einsatzmöglichkeiten der Liquid Biopsy beim primären und metastasierten Mammakarzinom vorgestellt.

Zirkulierende Tumorzellen

Der Nachweis von CTCs erfolgt grundsätzlich in 2 voneinander unabhängigen Schritten: Isolation der Zellen aus dem Vollblut und ihre eigentliche Detektion. Zur Isolation der Zellen von den anderen Blutbestandteilen werden verschiedene, hauptsächlich physikalische (größe- und/oder dichtebasierte) und biologische (Expression bestimmter Antigene) Zelleigenschaften genutzt. Als Beispiele können hier die sog. Dichtegradiententechnik mit Ficoll oder antigenbasierte Methoden mit epithelialen (z. B. EpCAM, Zytokeratine) und/oder tumorspezifischen Markern, wie CEA oder HER2, genannt werden. Bei der Antikörper-basierten Isolierung werden die spezifischen Antikörper meist an magnetische Partikel gekoppelt, um dann mithilfe eines Magnetfeldes die angereicherten Zellen zu separieren und weiter zu analysieren.

Die anschließende CTC-Detektion kann dann wiederum Nukleinsäure-basiert (RT-PCR, qRT-PCR, Multiplex-RT-PCR) oder anhand der Antigen-Charakteristik (Immunzytochemie, Immunfluoreszenz, Immunfluoreszenz-Durchflusszytometrie) der CTCs erfolgen. Während die Sensitivität und Spezifität der Nukleinsäure-basierten Nachweisverfahren sehr hoch ist, besteht deren Nachteil darin, dass die CTCs im Rahmen der Analyse lysiert werden, sodass eine Beurteilung der Zellmorphologie oder weitere Zellanalysen nicht möglich sind.

Die am häufigsten in klinischen Studien eingesetzte Technik zum CTC-Nachweis stellt das für metastasiertes Mamma-, Darm- und Prostatakarzinom von der US-amerikanischen Kontrollbehörde FDA zugelassene CellSearch-System (Menarini Silicon Biosystems, Inc.) dar. Mithilfe dieses standardisierten Assays werden die EpCAM-positiven CTCs immunomagnetisch aus den 7,5 ml venösen Vollblutes isoliert und anschließend mit Antikörpern gegen Zytokeratine (CK) 8, 18, 19, dem spezifischen Leukozyten-Marker CD45 und dem Zellkern-Marker DAPI immunfluoreszent gefärbt. Danach wird die Probe durch ein semiautomatisches Fluoreszenzmikroskop gescannt und die potenziellen CTCs automatisch abgebildet. Schließlich erfolgt die Auswertung durch einen erfahrenen Untersucher: CK 8/18/19 und DAPI-positive sowie CD45-negative Zellen, die eine bestimmte Morphologie aufweisen, werden als CTCs identifiziert ( Tab. 1 ,  Abb. 1 ). Die mittels CellSearch detektierten CTCs können per Mikromanipulation gewonnen werden und stehen weiteren Analysen (z. B. Einzelzell-Genexpressionsanalysen) zu Verfügung. Der Nachteil dieser Methode besteht zum einem in der subjektiven Beurteilung des Untersuchers, zum anderen aber auch darin, dass es sich um ein EpCAM-basiertes Verfahren handelt und die Zellen nach EMT (ohne epitheliale Eigenschaften) nicht detektiert werden können 11 ,  12 .

Tab. 1  Beispiele typischer zytomorphologischer Kriterien zur Identifikation der isolierten Tumorzellen (modifiziert nach 13 ).

Zellmorphologie/Phänotyp
Zellkern-Vergrößerung
große Nukleoli
Zell-Cluster
Färbung des Zytoplasmas stark und/oder unregelmäßig
unregelmäßige, granulierte Struktur des Zellkerns
Größe der Zelle > Größe der hämatopoetischen Zellen
Zellkern partiell durch immunzytologische Färbung bedeckt
netzartige Struktur der Zytokeratinfilamente

Abb. 1

 Nachweis von isolierten Tumorzellen über verschiedene Detektionsverfahren: a  Immunzytochemisch gefärbte apoptotische Tumorzelle (M30-Antikörper [AK]); b  Immunzytochemisch gefärbte vitale Tumorzelle (Anti-Zytokeratin [CK]-AK); c  Immunfluoreszenz, Doppelfärbung (Anti-CK-AK: grün, Anti-Östrogenrezeptor-AK: rot); d  Immunfluoreszent gefärbtes Tumorzell-Cluster (Anti-CK-AK).

Eine weitere Herausforderung der CTC-Diagnostik stellen die niedrige Detektionsraten, in erster Linie im nicht metastasierten Patientenkollektiv, dar. Vor allem in Anbetracht der bekannten Tumorheterogenität ist die Analyse möglichst vieler CTCs einer Patientin anstrebenswert. In diesem Kontext wurden in den letzten Jahren viele Anreicherungs-/Isolationsmethoden zur Erhöhung der Detektionsrate untersucht. Einen anderen möglichen Ansatz stellt die Analyse größerer Blutvolumina dar, z. B. im Rahmen einer diagnostischen Leukapherese (DLA). Im Rahmen dieses Verfahrens können im Schnitt 2770 ml Blut extrakorporal gefiltert werden. Die CTCs werden hier Dichtegradient-basiert isoliert und ein Aliquot des DLA-Produktes anschließend mittels CellSearch-Systems untersucht. So können die CTC-Detektionsraten und die Anzahl der nachgewiesenen CTCs signifikant erhöht werden 14 . Allerdings ist die Untersuchung großer Blutvolumina mit einem erhöhten Zeitaufwand für die Patientin verbunden: So dauert die Prozedur ca. 1 Stunde. Ferner werden Laborveränderungen nach der DLA beobachtet, wie z. B. geringfügiger Abfall der Leukozytenzahlen und des Hämoglobins, die klinisch nicht relevant sind. Inwiefern sich die Gewinnung von mehreren Tausend CTCs auf die klinische Bedeutung auswirkt und ob die DLA die CTC-basierte Diagnostik verbessern wird, bleibt abzuwarten.

Zirkulierende Tumor-DNA

Der Begriff zirkulierende Tumor-DNA (ctDNA) definiert im Blut und anderen Körperflüssigkeiten nachweisbare, freie DNA-Fragmente, die aus dem Tumor stammen (Primärtumor, Metastase, isolierte Tumorzellen). Zu unterscheiden davon ist der übergeordnete Begriff zellfreie DNA (cfDNA) bzw. freie zirkulierende DNA (fcDNA) , worunter man alle zellfreien DNA-Fragmente, nicht tumorspezifisch, versteht. Auch normale Zellen, die zugrunde gehen, können cfDNA ins Blut abgeben. Während sich die älteren Studien vor allem mit der Detektion der Gesamtmenge der frei zirkulierenden DNA im Blut befassten, richtet sich der Fokus der neueren Studien auf die spezifischen Nachweismethoden der ctDNA.

Die Detektion erfolgt in der Regel aus dem Blutplasma. Für den Nachweis ist der Anteil der ctDNA im Vergleich zu zellfreier DNA aus normalen Zellen entscheidend. Da dieser zum Teil sehr gering sein kann, bedarf der ctDNA-Nachweis hochsensitiver Detektionsmethoden. Dazu gehören u. a. Digital-droplet PCR (ddPCR), Beads Amplification Magnetics-PCR (BEAMing-PCR) und Digital Next-generation Sequencing (dNGS) 15 ,  16 ,  17 . Hierbei stellen die ddPCR und BEAMing-PCR die sog. zielgerichteten Detektionsverfahren (targeted approach) dar, bei welchen nur wenige Genloci simultan untersucht werden können. Dies bedeutet, dass hier gezielt nach bestimmten, bereits bekannten Tumormutationen z. B. in den Genen PIK3CA, ESR1, AKT1, ERBB2 oder PTEN gesucht wird. Der Begriff dNGS fasst hingegen mehrere genanalytische, nicht zielgerichtete Verfahren zusammen (untargeted approach), im Rahmen derer große DNA-Moleküle sequenziert werden und somit eine Vielzahl unbekannter genetischer Alterationen bzw. Mutationen detektiert werden können. Dazu gehören beispielsweise Array-CGH (Array-Comparative-Genomic-Hybridization), Gesamtgenomsequenzierung (engl. whole-genome sequencing) oder Exomsequenzierung. Mit diesen Methoden werden in der Regel Genmutationen identifiziert, die zur Abklärung von Resistenzentwicklung beitragen können 15 ,  16 .

Verbesserung der Prognoseeinschätzung

Das Erreichen der Blutgefäße durch einzelne Tumorzellen und die nachfolgende Dissemination stellen wichtige Schritte der Metastasierungskaskade dar. Dabei können Studien zufolge bereits präinvasive Läsionen der Mamma, wie das duktale Carcinoma in situ (DCIS), von einer Tumorzellstreuung begleitet werden 2 ,  18 , sodass die hämatogene Tumorzelldissemination als frühes Ereignis im Verlauf einer Tumorerkrankung angesehen wird. Zirkulierende Tumorzellen können bei 20 – 30% der Patientinnen mit nicht metastasiertem Mammakarzinom mithilfe des CellSearch-Systems detektiert werden 19 ( Tab. 2 ). Janni et al. konnten in einer gepoolten Analyse die Daten von 3173 Mammakarzinompatientinnen im Stadium I – III auswerten und zeigen, dass der Nachweis von mindestens einer CTC in 7,5 ml Blut ein deutlich schlechteres klinisches Outcome voraussagt 19 . So war das Risiko, am Mammakarzinom zu versterben, bei CTC-positiven Patientinnen doppelt so hoch wie bei Frauen, die keine CTCs zum Zeitpunkt der Diagnose aufwiesen (Hazard Ratio [HR]: 2,04; 95%-KI: 1,52 – 2,75). Die CTC-Positivität korrelierte ebenfalls mit einem statistisch signifikant kürzeren Gesamtüberleben (HR 1,97; 95%-KI: 1,51 – 2,59), krankheitsfreien Überleben (HR 1,82; 95%-KI: 1,47 – 2,26) und fernmetastasenfreien Überleben (HR 1,89; 95%-KI: 1,49 – 2,40).

Tab. 2  Prognostische Bedeutung der zirkulierenden Tumorzellen bei Mammakarzinom: die wichtigsten Studien.

Studie	Anzahl der Patientinnen	Stadium	Positivitätsraten (%)	Assay	Korrelation mit der Prognose
1 definiert als ≥ 1 CTC pro 7,5 ml 2 definiert als ≥ 5 CTCs pro 7,5 ml Abkürzungen: BCSS – brustkrebsspezifisches Überleben; DDFS – fernmetastasenfreies Überleben; DFS – krankheitsfreies Überleben; LRRFS – lokoregionäres rezidivfreies Überleben; OS – Gesamtüberleben; pCR – pathologische Komplettremission
Janni et al. 19	3173	Stadium I – III	641 (20%) 1	CellSearch	DFS, DDFS, BCSS, OS
Cristofanilli et al. 20	2436	Stadium IV	1099 (45,1%) 2	CellSearch	OS
Bidard et al. 21	1574	Stadium I – III vor neoadjuvanter Chemotherapie	398 (25,2%) 1	CellSearch	OS, DDFS, LRRFS; pCR-Rate höher bei CTC-Positivität (24,2 vs. 17,4%)

Während die prognostische Relevanz der CTCs in großen Metaanalysen ( Tab. 2 ) bestätigt wurde, ist die bisherige Datenlage bez. der zirkulierenden DNA deutlich weniger umfassend ( Tab. 3 ). In einer 2018 veröffentlichten Metaanalyse von Tan et al. wurden insgesamt 1127 Patientinnen aus 10 Studien berücksichtigt, der Großteil im nicht metastasierten Setting 22 . Anders als in den gepoolten Analysen zur Relevanz von CTCs waren hier die Kollektive deutlich kleiner (max. 336 Patientinnen). Zudem wurden unterschiedliche Assays verwendet, sodass der direkte Vergleich der Studien aufgrund ihrer Heterogenität deutlich erschwert ist. So wurde in einem Teil der analysierten Studien die Gesamtmenge der cfDNA bestimmt, während die anderen den Nachweis von vordefinierten genomischen Alterationen untersuchten. Trotz dieser Mängel lässt die Metaanalyse auf eine mögliche prognostische Bedeutung der cfDNA und der Mutationsdetektion beim nicht metastasierten Mammakarzinom schließen.

Tab. 3  Prognostische Relevanz der zirkulierenden DNA bei Patientinnen mit Mammakarzinom (modifiziert nach: 22 , berücksichtigt wurden nur Studien mit mindestens 100 Patientinnen).

Studie	Anzahl der Patientinnen	Setting	Methode	prognostische Relevanz: OS
1 Serum 2 Plasma Abkürzungen: dPCR – Digital PCR; HR – Hazard Ratio; OSMSP – One-step methylation-specific PCR; PCR-SSCP – PCR-Single-strand Conformation Polymorphism; RFS – rezidivfreies Überleben (relapse-free survival)
Fujita et al. 23	336	Stadium I – II	OSMSP 1 Met-DNA (±)/Gesamt cfDNA (high/low)	OS: ja (HR für Met-DNA 3,17, für Gesamt cfDNA 4,03) DFS/RFS: Met-DNA: nein (HR 2,23)Gesamt cfDNA: ja (2,70)
Fernandaz-Garcia et al. 24	194	Stadium IV	TaqMan, RT-PCRGesamt cfDNA (high/low)	OS: ja (HR 2,296)
BRE12–158 25	151	Stadium I – IIItriple-negativ, non-pCR	FoundationOne Liquid 2 ctDNA (±)	OS: ja (HR 2,7) DDFS: ja (HR 3,1)
Garcia et al. 26	142	Stadium I – III	PCR-SSCP 2 ctDNA (±)	OS: nein (HR 1,60) DFS/RFS: ja (HR 2,70)
Fujita et al. 27	120	Stadium II – IIInach Therapie	OSMSP 1 Met-DNA (±)/Gesamt cfDNA (high/low)	OS: ja (HR für Met-DNA 4,91, für Gesamt cfDNA 4,11) DFS/RFS: ja (HR für Met-DNA 4,23, für Gesamt cfDNA 1,93)
Shaw et al. 28	112	Stadium IV	ddPCR 2 gesamt cfDNA	OS: ja (HR 2,20)
Oshiro et al. 29	110	Stadium I – III	dPCR 1 mut. PIK3CA (±)	OS: nein (HR 3,92) DFS/RFS: ja (HR 4,78)

Therapiemonitoring mittels Liquid Biopsy

Die nichtinvasive Blutdiagnostik erlaubt serielle Untersuchungen, welche beliebig oft unter einer Behandlung oder nach Abschluss der Therapie erfolgen können. Somit wird ein einzigartiger Einblick in das aktuelle Tumorgeschehen ermöglicht. Da die Systemtherapie einen Selektionsdruck auf die MRD ausübt, kann mittels Blutentnahmen die persistierende Tumorzellpopulation ermittelt werden 30 . Auf diese Weise kann potenziell das Therapieansprechen überwacht werden und es können jene Patientinnen identifiziert werden, die ein erhöhtes Rezidivrisiko aufweisen und möglicherweise von zusätzlichen Behandlungsansätzen profitieren würden.

Mittlerweile wissen wir, dass CTCs in der Lage sind, über die (neo)adjuvante Therapie hinaus zu persistieren (sog. persistierende CTCs, Tab. 4 ). Die größte bisher durchgeführte Analyse zur CTC-Persistenz im nicht metastasierten Setting erfolgte im Rahmen der in Deutschland initiierten SUCCESS-Studie 31 . Bei 2026 Patientinnen wurden die CTCs mittels CellSearch vor Beginn der adjuvanten Chemotherapie untersucht. Bei 21,5% der Frauen konnte mindestens eine CTC detektiert werden. Nach Abschluss der Chemotherapie erfolgte eine Blutentnahme bei 1493 Patientinnen. Die Positivitätsrate betrug 22,1%. Der Nachweis von CTCs vor der Chemotherapie korrelierte mit dem klinischen Outcome (DFS, DDFS, BCSS und OS), aber nur bedingt mit der CTC-Persistenz. So wiesen 76 Patientinnen einen positiven CTC-Status sowohl vor als auch nach der Chemotherapie auf. Bei 936 Frauen waren beide Blutentnahmen CTC-negativ. Bei 491 Patientinnen kam es zu einem Switch des CTC-Status (+ → − in 238 Fällen und − → + in 253 Fällen). Der Nachweis von persistierenden CTCs sagte ein ungünstiges klinisches Outcome voraus (DFS: Hazard Ratio 1,124, p = 0,02, OS: Hazard Ratio 1,162, p = 0,06). Dies lässt die Entwicklung effektiver Resistenzmechanismen durch die Tumorzellen vermuten, welche ihnen erlauben, sich der Wirkung der zytotoxischen Therapie zu entziehen 21 ,  31 . Zudem wurde in neoadjuvanten Studien gezeigt, dass das CTC-Ansprechen mit dem Ansprechen des Primärtumors auf die Behandlung nicht korreliert.

Tab. 4  Klinische Bedeutung der persistierenden CTCs beim frühen Mammakarzinom.

Studie	Anzahl der Patientinnen	Setting	Positivitätsrate(%)	Korrelation mit Überleben
1 untersucht mittels CellSearch 2 untersucht mittels AdnaTest Abkürzungen: DDFS – fernmetastasenfreies Überleben; DFS – krankheitsfreies Überleben; NACT – neoadjuvante Chemotherapie, OS – Gesamtüberleben
Rack et al. 31	1493	Stadium I – IIIN+ oder High-risk N0Blutentnahme nach der adjuvanten Chemotherapie	22% 1	ja: DFS, OS
Bidard et al. 21	1200	Stadium I – IIIBlutentnahme nach der NACT	15% 1	ja: OS, DDFS
Riethdorf et al. 32	207	High-riskBlutentnahme nach der NACT	11% 1	nicht untersucht
Kasimir-Bauer et al. 33	133	Stadium II – IIIBlutentnahme vor und nach der NACT	8% 2	nein

Zahlreiche kleinere Studien sind der Frage nachgegangen, wie die Bestimmung der zirkulierenden DNA das Therapiemonitoring beim frühen Mammakarzinom ergänzen kann ( Tab. 5 ). Li et al. untersuchten Plasmaproben vor, während und nach der neoadjuvanten Chemotherapie bei 52 Patientinnen und konnten zeigen, dass die Bestimmung der ctDNA nach 2 Zyklen der Therapie mit der pCR-Wahrscheinlichkeit besser korreliert als die radiologische Diagnostik 34 . Ähnliche Ergebnisse wurden von Magbanua et al. berichtet, die ctDNA mittels Ultra-deep Sequencing bei 84 im Rahmen der I-SPY 2-Studie behandelten Patientinnen untersuchten 35 . Bereits 3 Wochen nach Beginn der Therapie zeigte sich ein starker Abfall der ctDNA-Positivitätsrate von 73 auf 35%. Alle Patientinnen, die eine pCR erreichten, waren nach der Chemotherapie ctDNA-negativ. In der Non-pCR-Subgruppe sagte der Nachweis von persistierender ctDNA nach NACT ein deutlich erhöhtes Metastasierungsrisiko voraus (Hazard Ratio 10,4).

Tab. 5  Klinische Bedeutung der zirkulierenden DNA unter und nach der neoadjuvanten Therapie beim frühen Mammakarzinom: Übersicht der wichtigsten Studien.

Studie	Anzahl der Patientinnen	Methode	Positivitätsrate (%)	Ergebnisse
Abkürzungen: AUC – Area under the Curve; DFS – krankheitsfreies Überleben; ddPCR – digitale Droplet-PCR; dPCR – digitale PCR; DDFS – fernmetastasenfreies Überleben; EFS – ereignisfreies Überleben; NACT – neoadjuvante Chemotherapie; NGS – Next Generation Sequencing; OS-MSP – One-step methylation-specific PCR; RCB – Residual Cancer Burden
Takahashi et al. 36	87	OS-MSP	23% vor NACT	ctDNA-Persistenz mit RCB assoziiert
Magbanua et al. 35	84	Ultra-deep Sequencing	73% vor NACT9% nach NACT	ctDNA-Persistenz 3 Wochen nach Beginn der NACT assoziiert mit pCR (pCR-Rate 17 vs. 48%, p = 0,012); ctDNA-Nachweis nach NACT assoziiert mit DDFS
NeoALTTO-Studie 37	69	Mutationsanalyse PIK3CA und TP53 (ddPCR)	41% vor NACT20% 2 Wochen nach Beginn5% nach NACT	persistierende ctDNA 2 Wochen nach Beginn der NACT mit geringerer pCR-Wahrscheinlichkeit, aber nicht mit EFS assoziiert
Garcia-Murillas et al. 38	55	dPCR, High-depth DNA Sequencing	69% vor NACT19% 2 – 4 Wochen postop.	ctDNA-Persistenz 2 – 4 Wochen postop. mit DFS assoziiert (Hazard Ratio 25,1)
Li et al. 34	52	NGS-Panel von 1021 Genen	48% vor NACT (die meisten Mutationen in den Genen TP53, PIK3CA, GAB2 und IRS2); ctDNA-Persistenz in 70% der initial ctDNA-positiven Pat.	ctDNA nach 2 Zyklen sagte das pathologische Ansprechen voraus (AUC 0.81); höhere Rezidivrate im Falle der ctDNA-Persistenz (50 vs. 33%)
Sharma et al. 39	30	Methylationsanalyse (Gene BRCA1, MGMT, GSTP1, Stratifin, MDR1)	Methylierung vor NACT: 76% mindestens 1 Gen; 53% (BRCA1), 37% (MGMT), 43% (GSTP1), 83% (Stratifin), 60% (MDR1) (76%)	Tumoransprechen mit einer häufigeren Methylierung vor NACT und Abfall der Methylierung nach NACT assoziiert
Moss et al. 40	30	Methylationsanalyse	80% vor NACT	starker Abfall der cfDNA unter NACT; cfDNA im letzten Monat der NACT mit der pCR assoziiert (p = 0,006)

Potenzial der Liquid Biopsy in der Nachsorge

Nach Abschluss der primären Therapie, die meist aus einer Operation und je nach Subtyp Radiatio und Chemotherapie ggf. in Kombination mit zielgerichteter Therapie besteht, kann der behandelnde Arzt heutzutage nur auf die Merkmale der Erkrankung zum Zeitpunkt der Erstdiagnose zurückgreifen, um das verbleibende Rezidivrisiko abschätzen zu können. Weitere Tools, die eine individualisierte Risikoschätzung erlauben würden, stehen nicht zur Verfügung. Demgegenüber steht der ausgeprägte Wunsch der Patientin, im Rahmen der Nachsorge die Heilungschancen zu erfahren. In diesem Kontext fordern manche Frauen die Bestimmung der klassischen Tumormarker (z. B. CEA, CA 15-3), eine Untersuchung, von der die aktuellen Leitlinien ausdrücklich abraten 41 ,  42 . Wie die Liquid Biopsy zur besseren Prognoseschätzung in der Nachsorge der asymptomatischen Patientin beitragen kann, wurde in einigen Studien untersucht.

2018 wurden die Daten aus 2 groß angelegten adjuvanten Therapiestudien veröffentlicht, die im Rahmen von translationalen Subprojekten die Relevanz der CTC-Bestimmung 5 Jahre nach der Diagnose untersucht haben ( Tab. 6 ). In beiden Studien kam das CellSearch-System zum Einsatz. Interessanterweise war die Prognose bei Frauen mit Persistenz der CTCs deutlich schlechter als im CTC-negativen Kollektiv, besonders in der Gruppe der HR-positiven Tumore. So konnte in der US-amerikanischen Studie gezeigt werden, dass das Rezidivrisiko pro Jahr bei Detektion von mind. einer CTC bei 21,4% lag, verglichen mit nur 2% bei CTC-negativem Status.

Tab. 6  Klinische Relevanz der CTC-Persistenz in der Nachsorge.

Studie	Patientenzahl	Zeitpunkt der CTC-Bestimmung	Positivitätsrate (%)	mediane Follow-up-Zeit	Korrelation mit Prognose
ECOG-ACRIN E5103 47 ,  48	547HER2-negativ Stadium II – III	4,5 – 7,5 Jahre nach der Diagnose	4,8%	2,6 Jahre	Rezidivrisiko 12,7 × höher bei Patientinnen mit persistierenden CTCs; Rezidivrisiko pro Patientin/Jahr im HR-positiven Kollektiv: 21,4 vs. 2,0%
SUCCESS-A 49	206Stadium I – III (high risk)	median 62 Monate nach der Diagnose	7,8%	1 Jahr	im HR-positiven Kollektiv: Rezidivrisiko höher bei CTC-Positivität (Hazard Ratio 5,95)

Kleineren Studien zufolge kann auch die zirkulierende DNA zur Risikostratifizierung der asymptomatischen Patientin während der Nachsorge beitragen 43 ,  44 ,  45 ,  46 . So konnten Garcia-Murillas et al. an einem Kollektiv von 101 Frauen zeigen, dass serielle Messungen der ctDNA das Rezidivrisiko voraussagen können 44 . Blutentnahmen erfolgten im 1. Jahr alle 3 Monate und wurden alle 6 Monate für 5 Jahre fortgeführt. Die ctDNA-Detektion basierte auf den im Tumorgewebe nachgewiesenen somatischen Mutationen, die mittels dPCR im Blut untersucht wurden. Patientinnen, bei denen ctDNA im Verlauf detektiert wurde, wiesen ein deutlich kürzeres rezidivfreies Überleben auf (Hazard Ratio 16,7, p < 0,001), wobei die ersten Blutproben bei den meisten Frauen nach Abschluss der Chemotherapie zunächst ctDNA-negativ waren. Im Median trat das klinische Rezidiv bzw. die Fernmetastasierung 10,7 Monate nach der 1. ctDNA-positiven Blutprobe auf. Interessanterweise korrelierte der ctDNA-Verlauf nicht mit dem Auftreten von Hirnmetastasen, sodass diese Lokalisation möglicherweise in der Liquid-Biopsy-basierten Detektion „stumm“ bleiben kann.

Auch in der EBLIS-Studie konnte das Potenzial des ctDNA-basierten Monitoring in der Nachsorge bestätigt werden 45 . Hierbei erfolgten Blutentnahmen alle 6 Monate in den ersten 4 Jahren nach Abschluss der Chemotherapie. Die ctDNA-Detektion basierte auf dem Nachweis von individuellen tumorspezifischen Mutationssignaturen, die anhand der Untersuchung der Primärtumoren erstellt wurden. Die Auswertung der klinischen Verläufe bei den ersten 49 Patientinnen zeigte, dass ctDNA im Median 8,9 Monate vor dem lokalen oder fernen Rezidiv nachgewiesen werden konnte.

Noch ist unklar, wie diese Erkenntnisse in der klinischen Routine implementiert werden können bzw. welche diagnostische oder therapeutische Konsequenz aus einem positiven ctDNA-Blutbefund abgeleitet werden sollte. In der britischen c-TRAK TN-Studie (NCT03145961) erfolgt das Monitoring mittels ctDNA-Testung alle 3 Monate nach Abschluss der Therapie bei triple-negativer Erkrankung. Patientinnen mit ctDNA-Persistenz werden zu Pembrolizumab vs. Observation randomisiert. In Deutschland ist die Untersuchung der Relevanz von Liquid Biopsy in der Nachsorge in der von der Universitäts-Frauenklinik Ulm initiierten SURVIVE-Studie geplant.

Liquid-Biopsy-basierte Therapieinterventionen

Der Etablierung blutbasierter Biomarker in der Praxis beim frühen Mammakarzinom steht bis jetzt die Unsicherheit hinsichtlich der klinischen Konsequenz im Wege. Eine der wenigen Studien, die eine mögliche CTC-basierte Therapieintervention im nicht metastasierten Setting untersucht haben, war die multizentrische Treat CTC-Studie 50 . Hierbei wurden Patientinnen mit HER2-negativem Primärtumor und persistierenden CTCs nach Abschluss der (neo)adjuvanten Chemotherapie zu 6 Zyklen Trastuzumab vs. Beobachtung randomisiert. Insgesamt wurde 1317 Patientinnen gescreent. Bei 95 wurden CTCs detektiert, davon konnten 63 erfolgreich randomisiert werden. Der primäre Endpunkt (erfolgreiche Elimination der CTCs durch Trastuzumab) wurde nicht erreicht, sodass die Studie abgebrochen wurde. Auch das klinische Outcome verbesserte sich durch die HER2-zielgerichtete Therapie nicht: nach einer medianen Follow-up-Zeit von 13 Monaten waren das invasiv-krankheitsfreie sowie das Gesamtüberleben in beiden Armen gleich. Bei der Bewertung dieses Ergebnisses müssen die genauen Einschlusskriterien berücksichtigt werden. Der HER2-Status der CTCs hatte auf eine mögliche Studienteilnahme keinen Einfluss. So konnten auch Patientinnen mit HER2-negativen CTCs randomisiert werden, die erwartungsgemäß von Trastuzumab nicht profitiert haben. Bei der Planung künftiger Studien sollten die phäno- bzw. genotypischen Eigenschaften der detektierten Zellen möglichst berücksichtigt werden.

Auch im metastasierten Setting kann die CTC-Detektion die Prognoseeinschätzung ergänzen. 2019 wurden Krankheitsverläufe von 2436 Patientinnen mit metastasierter Erkrankung aus 18 Zentren in einer retrospektiven gepoolten Analyse ausgewertet 20 ( Tab. 2 ). 54% der Patientinnen erhielten bereits eine systemische Therapie im metastasierten Setting. Der CTC-Nachweis erfolgte in allen berücksichtigten Studien am CellSearch-System. Allerdings hat sich aufgrund der höheren Konzentration der CTCs im metastasierten Setting ein anderer Cutoff bewährt: so wurde in den meisten Studien die Zahl von 5 oder mehr CTCs pro 7,5 ml Blut als erhöht (oder CTC-high) bezeichnet. Patientinnen mit ≥ 5 CTCs pro 7,5 ml Blut wurden in der gepoolten Analyse als CTC aggressive und jene mit < 5 CTCs als CTC indolent klassifiziert. Die Analyse konnte bestätigen, dass die Präsenz von erhöhten CTC-Zahlen im metastasierten Setting mit einem kürzeren Gesamtüberleben signifikant korreliert (medianes OS: 36,3 bei CTC aggressive vs. 16,0 Monate bei CTC indolent , p < 0,0001) und diese Assoziation bei allen Tumorsubtypen beobachtet werden kann 20 . In der multivariaten Analyse waren folgende Faktoren mit dem verkürzten OS assoziiert: Vorbehandlung, schlechte Differenzierung, triple-negativer Phänotyp, viszerale Metastasierung und Präsenz von ≥ 5 CTCs, wobei die CTC-Zahl der stärkste Prädiktor für das OS war (HR 2,71, 95%-KI 2,35 – 3,12, p < 0,0001).

Wenige Studien untersuchten die prognostische Wertigkeit der zirkulierenden DNA in der metastasierten Situation ( Tab. 3 ). Shaw et al. analysierten Blutproben von 112 vorbehandelten Patientinnen 28 . Erhöhte cfDNA-Werte korrelierten mit verkürztem Gesamtüberleben. Zusätzlich wurden die ctDNA durch Nachweis von Mutationen in den Genen PIK3CA, TP53, ESR1 und KRAS sowie CTCs bestimmt. Interessanterweise wurden erhöhte cfDNA-Werte meist gleichzeitig mit hohen ctDNA-Werten nachgewiesen. Hinsichtlich des Mutationsprofils reflektierte die ctDNA die Mutationen, die in den CTCs detektiert werden konnten.

Das klinische Ansprechen wird im metastasierten Setting mehreren Studien zufolge von den Veränderungen der CTC-Zahlen reflektiert 16 . Bereits nach dem 1. Zyklus einer palliativen Chemotherapie zeichnet sich in der Regel ein starker Abfall der CTCs ab. So konnten Smerage et al. sowie Martin et al. zeigen, dass bei 47 – 57% der Patientinnen mit initial ≥ 5 CTCs nach dem 1. Zyklus der Therapie < 5 CTCs detektiert werden konnten 51 ,  52 . Hingegen weisen konstant hohe CTC-Zahlen 3 – 4 Wochen nach Beginn der Behandlung auf ein erhöhtes Progressionsrisiko hin. Auf diese Weise kann das Ansprechen schneller als mit der klassischen radiologischen Diagnostik beurteilt werden. Unklar bleibt jedoch, welche klinische Konsequenz aus den persistent hohen CTC-Zahlen abgeleitet werden soll. Diese Fragestellung wurde in der randomisierten Phase-III-Studie der U. S. amerikanischen SWOG-Studiengruppe untersucht 51 . Insgesamt erhielten 595 Patientinnen mit metastasiertem Mammakarzinom im Rahmen der Studie ihre Erstlinienchemotherapie. Unter den 319 Frauen mit erhöhten CTC-Zahlen vor Beginn der Behandlung wiesen 43% auch nach dem 1. Zyklus ≥ 5 CTCs auf. Diese Patientinnen wurden zur Umstellung der Therapie auf ein anderes Regime vs. Fortführung der Therapie ohne Änderung randomisiert. Das beste Überleben wiesen Patientinnen mit initial niedrigen CTC-Zahlen auf (35 Monate), gefolgt von Frauen, deren initial hohe CTC-Zahlen nach dem 1. Zyklus abfielen (23 Monate), und Patientinnen mit CTC-Persistenz (13 Monate). Interessanterweise führte die Therapieumstellung nicht zur erhofften Verbesserung der Prognose, sodass die CTC-Persistenz eine Resistenz gegenüber konventionellen zytotoxischen Substanzen voraussagt. Möglicherweise könnten Patientinnen mit persistent hohen CTC-Zahlen von immunologischen, zielgerichteten oder experimentellen Ansätzen profitieren.

Der Nachweis von zirkulierender DNA wurde in translationalen Begleitprogrammen mehrerer Studien integriert. Hrebien et al. sind im Rahmen der BEECH-Studie der Frage nachgegangen, wie die seriellen ctDNA-Messungen das Monitoring unter einer Chemotherapie ergänzen können 53 . In dieser randomisierten Phase-II-Studie erhielten Patientinnen mit ER-positiven HER2-negativen Tumoren eine Erstlinientherapie mit Paclitaxel und AKT-Inhibitor Capivasertib vs. Placebo. Zunächst wurden Mutationen in den Baseline-Proben evaluiert, die im Verlauf mittels mutationsspezifischer ddPCR detektiert wurden. Bereits eine Woche nach Beginn der Therapie wurden Veränderungen der ctDNA-Level beobachtet, die das progressionsfreie Überleben voraussagen konnten. Die beste Korrelation mit dem progressionsfreien Überleben (PFS) wurde für die Blutentnahme am Tag 1 des 2. Therapiezyklus (q4w) gezeigt (11,1 vs. 6,4 Monate, Hazard Ratio 0,2). In beiden Armen wurde ein ähnlich starker ctDNA-Abfall verzeichnet, was den mittlerweile gezeigten fehlenden klinischen Benefit von Capivasertib widerspiegelt.

Auch im Rahmen der PALOMA-3-Studie konnte eine hohe Relevanz der frühen ctDNA-Untersuchung bestätigt werden 54 . In der Phase-III-Studie wurden insgesamt 521 Patientinnen nach Progress unter endokriner Therapie zur Behandlung mit Fulvestrant und CDK4/6-Inhibitor Palbociclib vs. Placebo randomisiert. Bei 455 Studienteilnehmerinnen wurde die Blutprobe vor Beginn der Behandlung mittels Multiplex-dPCR auf Hotspot-Mutationen im PIK3CA-Gen hin untersucht. Mindestens eine Mutation wurde bei 100 Frauen detektiert, bei 73 wurde auch am Tag 15 der Behandlung eine Blutprobe analysiert. Bei Patientinnen im Palbociclib-Arm wurde ein deutlich stärkerer Abfall der ctDNA zwischen Baseline und Tag 15 als im Placeboarm beobachtet. Basierend auf diesen Ergebnissen lässt sich vermuten, dass die ctDNA-Dynamik als geeigneter Surrogatparameter für die frühe Beurteilung des Benefits neuer Substanzen dienen kann.

Auf dem ASCO-Symposium 2020 wurden die Ergebnisse von 2 CDK4/6-Studien vorgestellt, die ctDNA-Messungen in ihren translationalen Begleitprogrammen untersucht hatten 55 ,  56 . In der PADA-1-Studie wurde die klinische Bedeutung der in der zellfreien DNA detektierten ESR1-Mutation unter der Therapie mit Aromatasehemmer und Palbociclib bei 1017 Patientinnen evaluiert 56 . Alle Patientinnen hatten eine ER-positive HER2-negative metastasierte Erkrankung und erhielten die Erstlinientherapie im Rahmen der Studie. Die seriellen Blutproben wurden mittels ddPCR untersucht. Vor Beginn der Therapie konnte die ESR1-Mutation bei 3,2% der Patientinnen nachgewiesen werden; meist handelte es sich um Frauen, die bereits in der Adjuvanz mit einem Aromatasehemmer behandelt wurden. Bei 78% der Patientinnen wurde die Mutation aus der cfDNA innerhalb der ersten 5 Monate der Therapie eliminiert. Patientinnen mit Mutation im ESR1-Gen vor Beginn der Behandlung wiesen ein kürzeres PFS auf als Frauen ohne eine Mutation in der cfDNA. Wie sich diese Ergebnisse auf die Therapieentscheidungen bei den ESR1 mut -Patientinnen im klinischen Alltag auswirken könnte, bleibt noch offen. Des Weiteren wurde auf dem ASCO-Symposium 2020 die Analyse von ctDNA im Rahmen der 3 Ribociclib-Studien MONALEESA-2, -3 und -7 vorgestellt 55 . Insgesamt wurden die Blutproben von 1503 Patientinnen vor Beginn der endokrin basierten Therapie auf Alterationen in 557 Genen mittels NGS hin untersucht. Alterationen in den Genen FRS2, PRKCA, MDM1, ERBB2, AKT1 und BRCA1/2 sagten einen stärkeren PFS-Benefit von Ribociclib voraus (statistischer Trend), während Patientinnen mit Alterationen in den Genen CHD4, BCL11B, ATM und CDKN2A/2B/2C von Ribociclib wenig bis gar nicht profitierten. Künftige Studien müssen klären, ob die untersuchten Gene zur frühzeitigen Detektion von Resistenzen im Rahmen des Therapiemonitorings beitragen können.

Die Therapie der metastasierten Patientin orientiert sich heutzutage an den prädiktiven Eigenschaften des Primärtumors bzw. der Metastasen. Dies setzt die Notwendigkeit einer invasiven Gewebeprobe zur Gewinnung des histologischen Materials voraus und kann mit Komplikationen bei erschwerter Lokalisation verbunden sein. Andererseits muss die klonale Heterogenität der Tumorerkrankung berücksichtigt werden. So können sich die einzelnen Metastasen voneinander hinsichtlich des Phäno- und Genotyps unterscheiden, aber auch innerhalb eines metastatischen Herdes können unterschiedliche Populationen nachgewiesen werden. Auch im zeitlichen Verlauf kann es zur Veränderung der untersuchten Marker kommen. Eine Metaanalyse von 39 Studien zeigte, dass 22,5% der Patientinnen mit initial ER-positiven Primärtumoren ER-negative Metastasen entwickeln 57 . Der Verlust des HER2-Status wurde bei 21,3% der Patientinnen beobachtet. Hingegen entwickelten 9,5% der Patientinnen mit HER2-negativen Primärtumoren eine HER2-positive Metastase. Aus diesem Grund empfiehlt die AGO-Kommission Mamma eine Reevaluation des Rezeptorstatus im metastasierten Setting.

Unter der Annahme, dass die blutbasierten Biomarker die Eigenschaften der dominanten Tumorpopulationen widerspiegeln, wird der mögliche Einsatz der Liquid Biopsy als Grundlage der Therapieentscheidung intensiv diskutiert.

Zu den wichtigsten Studien, die eine CTC-basierte Therapiewahl untersuchten, gehört die STIC CTC-Studie 58 . In dieser Phase-III-Studie wurden insgesamt 778 Frauen mit hormonrezeptorpositiver HER2-negativer Erkrankung vor Beginn der Erstlinientherapie randomisiert. Im CTC-Arm basierte die Therapiewahl ausschließlich auf dem Ergebnis der Blutuntersuchung: Patientinnen mit < 5 CTCs erhielten eine endokrine Monotherapie, während bei ≥ 5 CTCs eine Chemotherapie verabreicht wurde. Im Kontrollarm wurde ebenfalls Blut abgenommen und mittels CellSearch untersucht, das Ergebnis blieb jedoch verblindet. In diesem Arm wurde die Therapie vom behandelnden Arzt anhand der üblichen klinischen Kriterien gewählt. Da die Studie 2012 initiiert wurde, wurden die erst später zugelassenen CDK4/6-Inhibitoren im Studiendesign nicht berücksichtigt. Die STIC CTC-Studie erreichte ihren primären Endpunkt: die CTC-basierte Therapiewahl war der ärztlichen Entscheidung, die als „treatment of physicianʼs choice“ bezeichnet wird, nicht unterlegen. Das klinische Outcome (PFS und OS) war in beiden Armen gleich. Interessanterweise profitierten die Patientinnen mit diskordanter Einschätzung des Risikos (klinisch low-risk, aber mit hohen CTC-Zahlen oder klinisch high-risk mit niedrigen CTC-Zahlen) hinsichtlich des Gesamtüberlebens von einer Chemotherapie. Da in der STIC CTC-Studie keine endokrin basierte Kombinationstherapie mit CDK4/6-Inhibitoren, derzeit die am häufigsten gewählte Erstlinientherapie im hormonrezeptorpositiven Kollektiv, möglich war, kann momentan keine aus dieser Studie resultierende Empfehlung für den klinischen Alltag ausgesprochen werden.

Im Gegensatz zur STIC CTC-Studie, welche die CTC-Zahlen als Grundlage der Therapieentscheidung untersucht hatte, ist die CirCe T-DM1-Studie der Frage nachgegangen, wie die Eigenschaften der CTCs die Therapiewahl beeinflussen können 59 . Hierbei wurde untersucht, ob Patientinnen mit histologisch HER2-negativer Erkrankung (bestimmt am Primärtumor und/oder Metastase) deren CTCs einen positiven HER2-Status aufweisen, von einer HER2-zielgerichteten Therapie profitieren können. Insgesamt wurden 154 Frauen mit vorbehandeltem Mammakarzinom auf HER2-amplifizierte CTCs mittels FisH gescreent. In 14 Fällen konnte mindestens eine HER2-positive CTC nachgewiesen werden, von denen 11 mit T-DM1 im Rahmen der Studie zielgerichtet behandelt wurden. Die Ansprechrate war mit 9,1% sehr gering. Es konnte nur eine partielle Remission erreicht werden. Das mediane PFS betrug 4,8 Monate und das OS 9,5 Monate. Möglicherweise kann der fehlende Benefit der HER2-zielgerichteten Therapie durch die Heterogenität der CTCs erklärt werden. So wies die Mehrheit der detektierten CTCs einen negativen HER2-Status auf und nur bei 4,4% der CTCs konnte HER2-Amplifikation nachgewiesen werden.

Weitere CTC-basierte Therapiekonzepte werden derzeit in den DETECT-Studien, das weltweit größte Studienprogramm zu CTC-basierten Therapieinterventionen, untersucht 50 ( Abb. 2 ).

Abb. 2

 Studienalgorithmus im DETECT-Programm.

Im Gegensatz zur CTC-Diagnostik kann die ctDNA bereits heute im klinischen Alltag bei der Therapiewahl berücksichtigt werden. Mehreren Studien zufolge können somatische genetische Alterationen in den Genen PIK3CA, ESR1, HER2 und PTEN nachgewiesen und im Sinne von „targetable mutations“ zielgerichtet angegangen werden ( Tab. 7 ).

Tab. 7  Mögliche in der ctDNA detektierbare Alterationen und deren potenzielle Bedeutung.

Gen/Marker	potenzielle klinische Relevanz
ESR1	Vermittlung endokriner Resistenzen und ungünstige Prognose, je nach Variante Resistenz gegen Everolimus (ESR1 D538G und Y537S ), Exemestan ( D538G , ESR1 mut ), Fulvestrant ( Y537S, Y537C ), relative Fulvestrant-Sensitivität (ESR1 mut )
PIK3CA	Prädiktion des Ansprechens auf Therapie mit PI3K-Inhibitor (Alpelisib-Zulassung in Deutschland 7/2020); potenziell einsetzbar beim Therapiemonitoring
AKT1	Prädiktion des Ansprechens auf AKT-Inhibitoren wie Capivasertib (AKT1 E17K )
HER2	Prädiktion des Ansprechens auf Neratinib bei HER2 mut Therapiemonitoring unter Anti-HER2-Therapie
TP53	Vermittlung der Therapieresistenzen
PTEN	Vermittlung der Therapieresistenzen
BRCA	Prädiktion des Ansprechens auf PARP-Inhibitoren und Platinsalze bei somatischen BRCA-Mutationen in der ctDNA
Mikrosatelliteninstabilität (MSI), Verlust der Heterozygotie (LOH)	Prädiktion des Ansprechens auf zielgerichtete und immunologische Therapieansätze

Die erste Substanz mit der Liquid-Biopsy-basierten Indikation wurde auf Basis der SOLAR 1-Studie zugelassen 30 . Hierbei wurde der PI3K-Inhibitor Alpelisib bei Patientinnen mit hormonrezeptorpositiver HER2-negativer Erkrankung in Kombination mit Fulvestrant untersucht. Alpelisib hemmt das vom PIK3CA-Gen kodierte Enzym PI3-Kinase. Die Mutationen im PIK3CA-Gen werden bei bis zu 40% der Patientinnen im fortgeschrittenen Stadium beobachtet und führen durch Aktivierung der PI3K/Akt/mTOR-Signalkaskade zur gesteigerten Aggressivität der Erkrankung. In der SOLAR 1-Studie wurden insgesamt 572 Patientinnen zur Therapie mit Fulvestrant und Alpelisib vs. Fulvestrant und Placebo randomisiert. Die Patientinnen waren metastasiert und bereits endokrin vorbehandelt. Bei allen Frauen wurde der PIK3CA-Mutationsstatus im Tumorgewebe und bei einem Teil auch in der ctDNA bestimmt. Der Nachweis einer Mutation war mit einem signifikanten PFS-Benefit durch Hinzunahme von Alpelisib assoziiert – unabhängig davon, ob die Mutation im Gewebe oder in der ctDNA detektiert wurde. Alpelisib wurde bereits 2019 in den USA und 2020 in Europa zugelassen. In Europa wurde das Medikament durch das Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP) positiv bewertet, die Zulassung wird im Sommer 2020 erwartet.

Mit modernen Sequenzierungstechniken ist es möglich, mehrere potenziell therapierelevante Mutationen gleichzeitig zu untersuchen. Diesen Ansatz verfolgte die PlasmaMatch-Studie 60 , in welcher Blutproben von insgesamt 1044 Frauen mit metastasiertem Mammakarzinom gescreent wurden. Dabei wurde eine Reihe von genetischen Alterationen in der ctDNA detektiert. Am häufigsten war das TP53-Gen betroffen (44,1%), gefolgt von PIK3CA (34,9%), ESR1 (Estrogen-Rezeptor 1) (33,1%), PTEN (6,9%), HER2 (6,4%) und AKT1 (5,0%). Im Studiendesign war eine Mutations-getriggerte zielgerichtete Behandlung vorgesehen. So wurden beispielsweise Patientinnen mit Mutationen im ESR1-Gen mit Fulvestrant therapiert, und bei einer Mutation im HER2-Gen erhielten die Frauen die Anti-HER2-Therapie mit Neratinib. Im Falle von Mutationen im PTEN- bzw. AKT1-Gen wurde die Behandlung mit Capivasertib initiiert. Nach Analyse des Ansprechens erwies sich insbesondere die Therapie mit Neratinib und Capivasertib als vielversprechend (Ansprechraten: Neratinib 25%, Capivasertib 22 – 33%).

Der aktuelle Wissensstand zur Liquid Biopsy beim frühen und fortgeschrittenen Mammakarzinom wurde in der Tab. 8 zusammengefasst.

Tab. 8  Klinische Relevanz der CTCs und der zirkulierenden DNA bei Mammakarzinom.

		CTCs	zirkulierende DNA
M0	prognostische Relevanz	sehr hoch (in Metaanalysen bestätigt)	vermutlich hoch; Limitation: kleine Fallzahlen, relativ kurzes Follow up, methodische Unterschiede
	Therapiemonitoring	Persistenz nach (neo)adjuvanter Chemotherapie sagt schlechteres Outcome voraus	Persistenz nach (neo)adjuvanter Chemotherapie sagt schlechteres Outcome voraus; Korrelation der ctDNA-Dynamik mit pCR
	Ergänzung der Nachsorge	potenziell relevant, insb. bei HR-positiver Erkrankung: CTC-Detektion 5 Jahre nach Diagnose sagt ein erhöhtes Rezidivrisiko voraus	potenziell relevant: ctDNA-Positivität sagt ein erhöhtes Rezidivrisiko voraus
	Liquid-Biopsy-basierte Therapieinterventionen	bisher keine positiven Studien, Potenzial unklar; kein Benefit von Trastuzumab bei CTC-Persistenz in der TREAT CTC-Studie (HER2-Status der CTCs nicht berücksichtigt)	bisher keine positiven Studien, Potenzial unklar
M1	prognostische Relevanz	sehr hoch (in Metaanalysen bestätigt)	vermutlich hoch; Limitation: wenige Studien, kleine Fallzahlen, methodische Unterschiede
	Therapiemonitoring	hohes Potenzial: Persistenz nach dem 1. Zyklus Chemotherapie korreliert mit dem Ansprechen, klinische Konsequenz unklar	hohes Potenzial: Persistenz nach dem 1. Zyklus der Therapie korreliert mit dem Ansprechen, klinische Konsequenz unklar
	Liquid-Biopsy-basierte Therapieinterventionen	erste positive Studie (STIC CTC): CTC-basierte Wahl der Erstlinientherapie ist der Wahl des Onkologen nicht unterlegen; klinische Konsequenz unklar; weitere Studien ausstehend (z. B. DETECT-Studienprogramm)	Haupteinsatzgebiet: Detektion von somatischen Mutationen in der ctDNA als Indikationsgrundlage für zielgerichtete Therapie: Alpelisib bei Patientinnen mit Mutation im PIK3CA-Gen in den USA und Europa zugelassen.

Unter Liquid Biopsy wird die Untersuchung von zirkulierenden Tumorzellen und Nukleinsäuren (DNA/RNA) im Blut verstanden.

Die prognostische Relevanz der CTC-Detektion bei Patientinnen mit Mammakarzinom ist sowohl im frühen als auch im metastasierten Stadium sehr hoch.

Die Dynamik der CTCs und der ctDNA korreliert mit Ansprechen auf eine palliative Therapie.

Im Fokus der translationalen onkologischen Forschung stehen heutzutage die Liquid-Biopsy-basierten Therapieinterventionen beim metastasierten Mammakarzinom. Der PI3K-Inhibitor Alpelisib ist die erste Substanz, die in diesem Kontext zugelassen wurde.