[Resistance mechanisms and treatment strategies of Venetoclax in chronic lymphocytic leukemia].

近年来，慢性淋巴细胞白血病（CLL）的治疗已经从以免疫化疗为主的治疗进入了靶向治疗时代。Venetoclax是一种新型口服靶向BCL-2的小分子药物，通过诱导内源性凋亡途径杀伤肿瘤细胞[1]，在CLL相关研究中均观察到患者的无进展生存（PFS）及总生存（OS）期明显获益，但如同其他治疗方案，治疗选择压力下导致的耐药问题逐渐增多。因此，明确耐药机制对于减少Venetoclax耐药的发生及选择合适的挽救治疗尤为重要。

一、Venetoclax的作用机制

BCL-2的全称为B细胞肿瘤因子2，BCL-2家族参与调节细胞内源性凋亡途径，结构上大多包含BH1-BH4同源结构域，功能上可分为抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白。抗凋亡蛋白包括BCL-2、BCL-XL、BCL-W、MCL-1、BCL-2A1/BFL-1，促凋亡蛋白可分为凋亡效应蛋白BAX、BAK和仅含BH3结构域（BH3-only）的BIM、BID、PUMA、NOXA等蛋白[2]。生理情况下，抗凋亡蛋白直接或间接（与BH3-only蛋白结合）抑制BAX/BAK激活，但当细胞内压力如DNA损伤等增加时，BH3-only蛋白会结合并激活BAX/BAK，寡聚化后插入线粒体外膜，增加其通透性并释放细胞色素c，从而激活Caspase凋亡途径导致细胞程序性死亡[2]。

BCL-2家族抗凋亡蛋白在多种血液肿瘤中高表达，但其驱动机制不尽相同，在CLL中主要是miR-15a和miR-16-1缺乏或下调，导致BCL-2表达上调[3]。BCL-2对外周血白血病细胞的生存起关键作用，CLL细胞对其依赖程度远超MCL-1，故靶向BCL-2是治疗CLL的理想策略[4]。Venetoclax是一种结构上与BH3-only蛋白相似的小分子化合物，可竞争性结合BCL-2，释放BIM等蛋白，启动上述凋亡途径。与上一代BCL-2抑制剂navitoclax不同的是，Venetoclax与血小板的BCL-XL亲和力较低，故能避免因抑制BCL-XL带来的血小板减少[1]。对化学免疫治疗和BCR抑制剂（BCRi）而言，Venetoclax诱导的细胞凋亡不依赖于TP53信号[5]，所以能较好地克服TP53异常。

二、Venetoclax在CLL治疗中的疾病进展现状

在Venetoclax单药治疗高危复发/难治（R/R）CLL的临床试验中，总体反应率（ORR）接近80％，完全缓解（CR）率达20％[6]–[7]，而Venetoclax联合CD20单抗的ORR高达92％，外周血微小残留病阴性（uMRD）率（< 10−4）约84％[8]–[9]。凭借其良好的临床疗效，Venetoclax已被NCCN指南推荐单药或联合CD20单抗用于初治或R/R CLL的一线治疗。

但随着治疗时间的延长，部分患者不可避免地发生疾病进展（PD）。MURANO研究中194例R/R CLL患者接受了Venetoclax联合利妥昔单抗治疗，随访3年后，PFS率由2年时的83.5％下降到71.4％[10]。一项回顾性分析中，研究者收集了来自3个临床试验67例CLL患者的资料，Venetoclax单药（76％）或联合利妥昔单抗治疗后中位随访23个月，25例患者PD，其中17例确诊为Richter转化（RT），8例为CLL/小淋巴细胞淋巴瘤（SLL）进展[11]。另一项真实世界研究纳入来自多中心的141例CLL患者（98％为R/R），89％既往接受过BCRi治疗，入组后接受Venetoclax单药（82.6％），或联合伊布替尼/CD20单抗治疗，中位随访7个月，41例患者停药，其中21例为CLL/SLL进展，1例发生RT[12]。

在不良预后因素方面，Mato等[12]发现在包括TP53异常、复杂核型和既往接受伊布替尼治疗的多因素分析中，有TP53异常的患者PFS期更短（HR＝2.8，P＝0.03）。Roberts等[13]回顾性分析了436例CLL患者，多因素分析显示，伴淋巴结肿大（≥5 cm）、BCRi难治、del（17p）和（或）TP53突变、NOTCH1突变的患者应答持续时间明显缩短，且淋巴结肿大和BCRi难治还意味着更低的CR率。另外两项关于BCRi治疗后应用Venetoclax治疗的CLL回顾性分析发现，基线数据中因不良事件停用BCRi较因PD停药的患者有更长的PFS期和OS期[14]–[15]；接受≥2种BCRi的患者预后不良[15]；TP53突变在多因素分析中与PFS、OS无明显相关性[14]。

三、Venetoclax耐药机制研究进展

1. 原发耐药机制：尽管Venetoclax治疗CLL应答率高，但CLL患者的预后具有高度异质性，多项临床及真实世界研究显示仍有7％～28％的病例对治疗无应答[6]–[9],[11]–[13]，提示部分患者存在原发耐药。此外，研究者在不同成熟B细胞淋巴瘤中观察到抗凋亡蛋白如BCL-2、MCL-1的表达有明显差异[16]，也可部分解释临床试验中不同肿瘤Venetoclax疗效的差异。

2. 获得性突变相关耐药机制：Blombery等[17]率先报道了BCL-2获得性突变，研究分析了Venetoclax治疗后复发的15例CLL患者，二代测序（NGS）检测BCL-2编码区后，4例患者在PD后检测出Gly101Val突变，进一步用微滴数字PCR技术在另外3例治疗后样本中检测到G101V低频突变。伴G101V突变的CLL细胞系体外实验中，Venetoclax与BCL-2结合的能力较野生型降低了180倍，且对Venetoclax的敏感性下降了30倍。研究者进一步在10例进展期CLL患者中发现了与G101V平行的多个获得性突变，但其作用仍有待进一步验证[18]。Tausch等[19]应用NGS在3例Venetoclax难治的CLL中同样发现了G101V突变，其中1例还伴有BCL-2 Asp103Tyr突变，研究者还证实2例患者的突变较临床进展至少早1年，可能成为预测耐药的标志。最近一项研究通过展示G101V突变的BCL-2蛋白与Venetoclax结合的晶体结构揭示了两者结合障碍的分子基础[20]。

BCL-2以外的突变同样会参与耐药的产生。Herling等[21]分析了8例Venetoclax耐药CLL患者的全基因组测序数据，发现了BTG1错义突变（2例）、CDKN2A/B纯合子缺失（3例）以及癌症相关基因BRAF、CD274、NOTCH1、RB1、SF3B1和TP53的突变或扩增（各1例），研究指出，BRAF过表达可以增加对Venetoclax的耐药且往往伴MCL-1蛋白表达水平升高，BTG1如何影响耐药尚不明确，而单纯CDKN2A/B纯合子缺失不足以诱导耐药。

此外，亚克隆在疾病复发中有非常重要的地位，Tausch等[19]的研究证实1例患者在39和44个月时G101V、Asp103Tyr突变丰度分别为0、7％和14％、18％，表明可能存在两个亚克隆导致耐药增强。另一项研究在6例Venetoclax治疗后复发的CLL患者中也发现了明显的亚克隆转移，不同亚克隆随着突变或扩增的明显累积而逐渐耐药[22]。Herling等[21]通过描述治疗压力下CLL的不同克隆动力学演变模式提出了细胞内耐药机制形成的复杂性。

3. 肿瘤微环境相关耐药机制：既往研究表明，淋巴结、脾、骨髓微环境可以促进CLL细胞生存和增殖[23]。微环境中的骨髓基质细胞（BMSC）、单核细胞来源的NLC及T细胞可通过BCR信号、CD40L、细胞因子如IL-4等与肿瘤细胞相互作用，通过激活下游PI3K/AKT、MAPK/ERK、NF-κB等信号通路调节BCL-2家族的表达水平导致耐药[23]。

Venetoclax对BCL-2具有高度选择性，体外实验表明，Venetoclax对BCL-XL和MCL-1依赖的血液恶性肿瘤细胞杀伤作用很小[1]。故一旦CLL细胞中这些抗凋亡蛋白过表达即可能导致耐药。

基因表达谱数据库分析发现多种成熟B细胞淋巴瘤中BCL-2家族表达失调，主成分分析显示CLL细胞可形成外周血、淋巴结和骨髓三个相对不同的亚群，BCL-2家族基因表达谱在各亚群中也表现出差异[16]。另外一项研究则对比了淋巴结和外周血中CLL细胞BCL-2家族蛋白表达谱，发现淋巴结中MCL-1、BCL-XL表达上调，而NOXA表达减少[24]。为模拟体内淋巴微环境，研究者将CLL外周血细胞和CD40L、IL-4/IL-21共培养，可诱导BCL-XL、BFL-1和MCL-1的表达增加，并下调BIM和NOXA[24]–[27]；与抗IgM抗体共培养时主要通过BCR信号诱导MCL-1上调导致Venetoclax耐药[28]。Jayappa等[29]将CLL细胞与sCD40L、CpG-ODN等微环境信号分子共培养后发现除MCL-1、BCL-XL高表达，survivin的表达也可轻度增加。

4. 线粒体重编程相关耐药：线粒体是细胞的产能场所，其功能直接影响细胞生存。近期有研究表明，调节细胞内能量代谢同样参与Venetoclax耐药的发生，Guièze等[22]在体外实验中观察到线粒体重编程导致耐药细胞内氧化磷酸化（OXPHOS）的能力增强，伴更高的稳态活性氧和线粒体膜电位水平，在OXPHOS及其上游信号腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）的抑制剂作用下可增加细胞对Venetoclax的敏感性。同时在CLL复发患者的样本中发现了基因组水平的amp（1q）（包含编码MCL-1和AMPK的基因座）和蛋白水平的MCL-1、AMPK表达增加。

四、Venetoclax耐药的治疗策略

1. 靶向肿瘤微环境：BTK是BCR信号通路的关键分子，BTK抑制剂（BTKi）伊布替尼可以促进肿瘤细胞由淋巴微环境进入外周血，并减少其归巢及黏附[30]，导致外周血中的CLL细胞更依赖于BCL-2抗凋亡途径，此时协同应用Venetoclax可显著杀伤肿瘤细胞[31]。近期两项关于Venetoclax联合伊布替尼治疗CLL的Ⅱ期临床研究同样展现了令人印象深刻的结果，在初治CLL队列中，ORR、CR率分别达到97％、88％，而R/R队列中的ORR、CR率则为89％、51％，在初治CLL中，骨髓uMRD率达到61％[32]–[33]，与此同时，这两项研究在达到骨髓uMRD的基础上尝试停药，可减少持续用药带来的克隆选择压力。

抑制PI3K-AKT-mTOR信号通路在非霍奇金淋巴瘤（NHL）细胞系中被证实可以通过下调MCL-1和BCL-XL增加Venetoclax的敏感性[34]。虽然机会性感染等不良事件在一定程度上限制了PI3K抑制剂Idelalisib和Duvelisib的应用，但鉴于其良好的应答率，Duvelisib联合Venetoclax治疗R/R CLL的Ⅰ/Ⅱ期临床试验正在进行中（NCT03534323），结果值得期待。mTOR抑制剂CC-115和p-AKT/mTOR抑制剂NVP-BEZ235也已进入临床研究阶段。

SYK抑制剂可阻断BCR信号发挥作用，其单药治疗CLL/NHL的临床试验显示应答率一般，但联合用药仍值得探索。Bojarczuk等[35]在体外实验中证实SYK抑制剂Entospletinib可减少MCL-1蛋白而增加Venetoclax的杀伤力，且作用较伊布替尼及Idelalisib更强[28]。SYK/JAK双靶点抑制剂Cerdulatinib可通过抑制BCR和IL-4信号下调MCL-1和BCL-XL，从而协同诱导CLL细胞凋亡。

在广义的激酶抑制剂方面，Dasatinib已被证实可以抑制BTK和LYN，且Dasatinib和Imatinib可在体外通过抑制CD40L介导的抗凋亡蛋白过表达逆转Venetoclax耐药[26]。Oppermann等[36]利用CLL原代细胞建立体外微环境模型后进行高通量激酶抑制剂筛选，发现多靶点激酶抑制剂Sunitinib可以有效下调MCL-1、BCL-XL、BCL-2A1表达，从而克服Venetoclax耐药。

在靶向肿瘤微环境中，CD20单抗发挥着重要作用，其主要通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用、补体依赖性细胞毒效应等作用杀伤肿瘤细胞，但有研究表明CD20单抗同样可以阻断微环境介导的BCL-XL表达而克服Venetoclax耐药[26]。联合用药在临床试验中也取得了非常好的疗效，Venetoclax联合利妥昔单抗的Ⅲ期临床试验显示外周血uMRD率和2年PFS率分别为83.5％、84.9％，而联合Obinutuzumab则分别为75.5％、88.2％[8]–[9]。

鉴于Venetoclax或伊布替尼联合CD20单抗的临床疗效显著，目前正在探索三药联合固定周期治疗方案，理论上可能达到更高的应答率和更深的缓解，减少耐药的发生。一项Ⅲ期临床试验探索三药联合在初治或R/R CLL患者中的疗效，前期数据显示，初治患者（25例）的ORR、CR率、骨髓uMRD率分别为92％、50％、65％[37]，R/R患者（25例）的ORR、CR率分别为92％、24％，骨髓和外周血同时uMRD率为70％[38]。二代BTKi Acalabrutinib联合Venetoclax、Obinutuzumab的临床试验也在进行中（NCT03580928）。

2. 靶向抗凋亡蛋白：目前AMG-176、AZD-5991等多个特异性MCL-1抑制剂正在进行临床评价，但主要集中在多发性骨髓瘤、急性髓系白血病（AML）和NHL领域[39]，其中AMG-176在CLL原代细胞系中可有效诱导凋亡，和Venetoclax联用具有相加或协同作用[40]。还有研究报道在弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）模型中新型BCL-2抑制剂APG-2575联合BTKi可协同抗肿瘤[41]，而在NHL模型中可观察到BCL-2/BCL-XL双靶点抑制剂BM-1197使肿瘤生长明显受抑[42]，但其靶向BCL-XL对血小板的影响还有待验证。

3. 其他小分子靶向药：Voruciclib是处于临床研究阶段的CDK抑制剂，在DLBCL和AML的临床前研究中均可有效阻断MCL-1的转录调节子CDK9，抑制MCL-1表达，可协同Venetoclax促进细胞凋亡，抑制肿瘤生长[43]–[44]。

BET蛋白家族在调控基因表观遗传学方面有重要作用。JQ1是BET家族BRD4蛋白抑制剂，在多种肿瘤中被证实可抑制BCL-2、c-MYC、AKT等蛋白的表达，在CLL耐药细胞的临床前研究中表现出很强的杀伤作用，联合Venetoclax可显著提高疗效[45]。此外，MEK1/2、XPO-1抑制剂等小分子靶向药也在研发中。

4. 调节细胞内代谢：如前所述，线粒体重编程同样参与耐药，OXPHOS酶复合体抑制剂Antimycin、Oligmycin及AMPK抑制剂Dorsomorphin可使肿瘤细胞对Venetoclax更敏感[22]。谷氨酰胺是肿瘤细胞能量代谢中的重要物质，Al-Zebeeby等[46]靶向谷氨酰胺摄取及其下游信号通路如谷氨酰胺分解、胆固醇生成等，可显著增加CLL细胞对Venetoclax的敏感性。还有研究表明辛伐他汀联合Venetoclax在CLL细胞系中可增强疗效，回顾性分析显示有服用他汀史的患者更容易达到CR，机制可能是他汀抑制羟甲基戊二酰辅酶A还原酶导致PUMA上调[47]。

5. 联合免疫化疗：尽管免疫化疗已逐渐被新药取代，但联合Venetoclax仍是值得探索的方向，CLL2-BAG研究共纳入63例CLL患者，首先予Bendamustine治疗2个周期以降低肿瘤负荷，随后予Venetoclax+Obinutuzumab治疗，结果显示，序贯用药未见明显累积毒性，在初治患者（34例）中，ORR和外周血uMRD率分别高达100％、91％，R/R患者（29例）中则分别为90％、83％，但两组的骨髓uMRD率仅有12％～14％[48]。

6. CAR-T治疗与allo-HSCT：虽然allo-HSCT被认为是CLL的唯一治愈手段，但在新药时代，其适应证较窄，目前仅少数无明显并发症的患者在靶向药物治疗无效时才会考虑[49]。CAR-T治疗在血液肿瘤中获得了巨大成就，尽管在CLL领域的治疗经验有限，但在多项研究中显示了良好的安全性和有效性[50]。一项CD19 CAR-T临床试验纳入24例经伊布替尼治疗的高危CLL患者（6例Venetoclax难治），ORR达到71％[51]。另外一项研究采用CAR-T联合伊布替尼治疗19例R/R CLL患者（11例既往接受Venetoclax治疗），ORR和骨髓uMRD率分别达到83％和72％[52]，显示了良好的前景，有望成为CLL的有效挽救方案。

五、小结与展望

Venetoclax和其他小分子靶向药的发展改变了CLL的传统治疗模式，但Venetoclax在CLL中的应用时间不长，需要更多真实世界的分析明确药物的安全性及耐药等问题。目前针对耐药主要的解决办法是：①尽早联合BTKi或抗CD20单抗治疗，减少耐药及复发；②使用伊布替尼或Acalabrutinib作为挽救治疗，可能取得一定程度缓解；③对于治疗失败的患者可考虑进入CAR-T相关临床试验治疗。总之，随着Venetoclax等靶向药物的应用，CLL患者的OS时间及生存质量将不断提高。