[Bortezomib interferes with DNA repair and exerts synergistic anti-multiple myeloma activity with doxorubicin].

蛋白酶体抑制剂硼替佐米联合阿霉素广泛应用于多发性骨髓瘤（MM）的一线治疗[1]，但其协同效应机制尚待进一步探讨。阿霉素作为DNA交联剂可诱发DNA双链断裂及DNA损伤反应（DDR），进而发挥抗MM效应[2]–[3]。然而，靶细胞固有的DNA损伤修复机制可部分弱化DDR引发的促死亡信号[4]。因此，靶向核酸修复机制极可能增强阿霉素的细胞毒效应。研究表明，多种DDR相关蛋白［如共济失调毛细血管扩张症突变基因（ATM）蛋白及其下游磷酸化的组蛋白H2A变体（γ-H2AX）、DNA修复蛋白（RAD51蛋白）等］被募集至DNA断裂点是核酸修复的始动环节[2],[5]–[8]。其中RAD51主要募集至泛素化的γ-H2AX[9]–[10]。硼替佐米可阻断胞质多泛素化蛋白降解，滞留消耗大量泛素分子，致使核内泛素耗竭、γ-H2AX泛素化过程受抑、RAD51的募集减少[10]。基于硼替佐米这种独特的DNA修复干扰机制，本研究拟通过探究此药物对DDR蛋白磷酸化表达或亚细胞分布的影响，进一步理解蛋白酶体系统在DNA修复过程中的作用及硼替佐米和阿霉素的协同抗MM机制。

材料与方法

1. 试剂与材料：阿霉素和硼替佐米分别购自意大利Actavis公司和西安杨森制药公司。BCA蛋白定量试剂盒、MTT［3-（4, 5-dimethylthiazol-2-yl）-2, 5-diphenyltetrazolium bromide］购自碧云天生物有限公司。抗γ-H2AX、p-ATM、ATM、RAD51、GAPDH抗体购自英国Abcam公司，辣根过氧化物酶、罗丹明标记的二抗、4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）购自北京中杉金桥生物有限公司，RNA提取试剂Trizol购自北京天根生化科技有限公司，mRNA逆转录试剂盒购自美国Thermo Scientific公司。

2. 细胞培养：人骨髓瘤细胞系RPMI8226、H929来自苏州大学唐仲英血液研究所毛新良教授，常规培养于含10%胎牛血清、1%青霉素、1%链霉素的RPMI 1640培养基，置于37°C含有5%CO2的细胞培养箱中，每2～3 d传代，取对数生长期细胞进行实验。

3. MTT测定与协同效应分析：调整MM细胞浓度为5×104/ml，接种于96孔板中，加入不同浓度的阿霉素和硼替佐米，于CO2细胞培养箱中孵育24 h。DNM-9602型酶标仪测量490 nm处各孔吸光度（A）值。存活率（%）＝A加药组/A对照组×100%。绘制细胞存活曲线，计算两种药物的10%抑制浓度（IC10）、20%抑制浓度（IC20）、40%抑制浓度（IC40）值，两种药物以不同浓度组合作用于MM细胞系。采用MTT法计算抑制率，采用Calcusyn软件分析协同效应，CI值<1表示协同，CI值＝1表示相加，CI值>1表示拮抗。选取协同效应最佳的组合进行后续实验。

4. Western blot：细胞以5×105/ml的密度接种于六孔板，根据相关实验要求加入阿霉素和硼替佐米，于CO2细胞培养箱中孵育24 h后收集细胞。应用细胞核、细胞质蛋白抽提试剂盒分别提取胞核及胞质蛋白，具体步骤为：细胞沉淀中加入细胞质蛋白抽提试剂A后冰浴10 min，加入细胞质蛋白抽提试剂B后冰浴1 min，4°C12 000×g离心5 min，收集上清即为胞质蛋白。在胞核沉淀中加入细胞核蛋白抽提试剂后冰浴，每隔2 min反复抽吸15 s，30 min后4°C12 000×g离心10 min，收集上清即为胞核蛋白。RIPA裂解液冰上裂解提取总蛋白，将蛋白与上样缓冲液按照4∶1比例混匀，煮沸5 min使蛋白变性，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳并转至PVDF膜，在5%的脱脂奶粉中封闭1 h，分别加入一抗、二抗孵育，Bio-Rad自动显影仪检测目标条带，image J软件进行分析。

5. 免疫荧光：细胞以5×105/ml的密度接种于六孔板中，药物处理24 h，将细胞滴加至多聚赖氨酸预包被的盖玻片上黏附1 h，以4%多聚甲醛室温固定20 min，以0.5%Triton X-100室温下打孔15 min，1%BSA室温封闭1 h。加入抗γ-H2AX抗体4°C下孵育过夜，PBS 5 min洗涤3遍，加入罗丹明标记的二抗室温避光孵育1 h，PBS洗涤3遍。室温下0.1 µg/ml DAPI染核5 min，封固。荧光显微镜下观察细胞核内的阳性信号，每个样本随机计数50个细胞核内的阳性点数。

6. 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）：细胞以5×105/ml的密度接种于六孔板中，药物处理24 h，Trizol法提取总RNA，按照试剂盒（RevertAid Kit）说明书方法合成互补脱氧核糖核酸（cDNAs）。引物序列：RAD51：上游：5′-CGAGCGTTCAACACAGACCA-3′，下游：5′-GTGGCACTGTCTACAATAAGCA-3′；GAPDH：上游：5′-AACAGCGACACCCATCCTC-3′，下游：5′-CATACCAGGAAATGAGCTTGACAA-3′[10]。采用UltraSYBR Mixture试剂盒行qRT-PCR得到CT值。以GAPDH为内参，计算各组RAD51 mRNA的相对表达量。

7. 统计学处理：采用Graph Prism 5软件进行统计学分析。实验数据以均数±标准差（±s）表示。组间比较采用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。每组实验至少重复3次。

结果

1. 硼替佐米、阿霉素抑制骨髓瘤细胞增殖：不同浓度的阿霉素（0、0.25、0.5、1、2、4、8、16 µmol/L）及硼替佐米（0、2、4、8、16、32、64、128 nmol/L）分别作用于RPMI8226及H929细胞24 h，MTT法检测。结果显示，两药对于MM细胞的增殖抑制作用均呈现明显的剂量依赖性。阿霉素作用于RPMI 8226细胞的IC10、IC20、IC40值分别为0.4、0.8、1.8 µmol/L，作用于H929细胞的IC10、IC20、IC40值分别为0.2、0.4、1.2 µmol/L。硼替佐米作用于RPMI8226细胞的IC10、IC20、IC40值分别为2、6、30 nmol，作用于H929细胞的IC10、IC20、IC40值分别为2、4、24 nmol/L。

2. 硼替佐米与阿霉素协同抗骨髓瘤作用：将阿霉素及硼替佐米以IC10、IC20、IC40两两组合作用于MM细胞系，根据细胞抑制率行协同效应分析。结果显示，阿霉素和硼替佐米具有明显的协同抗MM效应（表1～2）。采用Calcusyn软件分析协同效应，选取协同效应最佳的浓度（RPMI8226细胞系：0.8 nmol/L阿霉素+2 nmol/L硼替佐米；H929细胞系：0.2 nmol/L阿霉素+2 nmol/L硼替佐米）。

表1

不同浓度硼替佐米和阿霉素联合作用于RPMI8226细胞系的抑制率

阿霉素（µmol/L）	硼替佐米（nmol/L）
	0	2	6	30
0	0	0.10	0.20	0.40
0.4	0.1	0.27	0.20	0.39
0.8	0.2	0.56	0.39	0.45
1.8	0.4	0.68	0.64	0.70

表2

不同浓度硼替佐米和阿霉素联合作用于H929细胞系的抑制率

阿霉素（µmol/L）	硼替佐米（nmol/L）
	0	2	4	24
0	0	0.10	0.20	0.40
0.2	0.10	0.44	0.33	0.53
0.4	0.20	0.35	0.51	0.66
1.2	0.40	0.53	0.66	0.78

3. 硼替佐米协同阿霉素诱导DDR：γ-H2AX上调是DNA损伤的主要生物学标志[11]。Western blot结果显示，阿霉素可诱导剂量依赖的DDR（图1）。与上述协同效应模型一致，阿霉素和硼替佐米联合作用于MM细胞系后，p-ATM和γ-H2AX的表达均明显高于单药组（图2）。

图1

Western blot法检测不同浓度硼替佐米和阿霉素对RPMI8226细胞系（A）和H929细胞系（B）γ-H2AX表达的影响

以GAPDH作为内参，1为对照组。A：2～4分别为0.4、0.8、1.8 µmol/L，5～7分别为2、6、30 nmol/L；B：2～4分别为0.2、0.4、1.2 µmol/L，5～7分别为2、4、24 nmol/L

图2

Western blot法检测不同药物组合对RPMI8226细胞系（A）和H929细胞系（B）p-ATM和γ-H2AX表达的影响

以GAPDH作为内参，1～4分别表示对照组、硼替佐米组、阿霉素组、硼替佐米联合阿霉素组

4. 硼替佐米对DNA损伤修复蛋白亚细胞分布的影响：为进一步研究γ-H2AX的亚细胞分布，我们进行了免疫荧光实验。结果显示，两药联合作用后，γ-H2AX的核内募集较阿霉素单用组明显增强（图3）。qRT-PCR进一步显示，硼替佐米联合阿霉素处理RPMI8226细胞后，其RAD51 mRNA相对表达量（3.10±0.08）高于阿霉素组（2.00±0.21）和硼替佐米组（2.06±0.16）（P<0.05）。硼替佐米联合阿霉素处理H929细胞后，其RAD51 mRNA相对表达量（2.83±0.12）高于阿霉素组（1.83±0.20）和硼替佐米组（1.56±0.16）（P<0.05）。Western blot法显示，两药联合与阿霉素单药相比，RAD51蛋白表达量无明显上调（图4），但RAD51蛋白却明显由胞核转移至胞质（图5）。

图3

免疫荧光法检测不同药物组合对RPMI8226细胞系（A）和H929细胞系（B）γ-H2AX亚细胞定位的影响

红色为罗丹明标记的γ-H2AX焦点，蓝色为4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）衬染的细胞核；Merge：叠加

图4

Western blot法检测不同药物组合对RPMI8226细胞系（A）和H929细胞系（B）RAD51蛋白表达的影响

以GAPDH作为内参，1～4分别表示对照组、硼替佐米组、阿霉素组、硼替佐米联合阿霉素组

图5

Western blot法检测不同药物组合对RPMI8226细胞系（A）和H929细胞系（B）RAD51蛋白亚细胞定位的影响

以LaminB、β-actin作为内参，1～4分别表示对照组、硼替佐米组、阿霉素组、硼替佐米联合阿霉素组

讨论

硼替佐米联合阿霉素、地塞米松的PAD方案已经成为MM治疗的一线诱导方案[12]–[13]。作为PAD方案中的关键药物，硼替佐米和阿霉素的协同作用机制目前尚不清楚。我们的研究结果表明，硼替佐米和阿霉素在多种浓度状态下均呈现出明显的协同抗MM效应。硼替佐米可干扰RAD51蛋白的亚细胞定位，从而增强阿霉素诱导的骨髓瘤细胞DDR。基于以上结果，本研究推断硼替佐米可通过干扰DNA损伤修复过程协同增强阿霉素抗骨髓瘤效应。

我们既往研究表明，阿霉素可诱导ATM依赖的DDR[14]，DNA双链发生断裂时，ATM首先募集至损伤点，自我磷酸化后启动下游一系列蛋白（如γ-H2AX和RAD51蛋白等）募集于损伤点处，产生DNA损伤分泌反应、细胞周期停滞、细胞凋亡、DNA损伤修复等生物学效应[14]–[17]。当DNA损伤和修复的稳态失衡时，细胞活化促凋亡信号，导致程序性细胞死亡。因此，放大阿霉素诱导的DDR信号极可能增强阿霉素的抗MM效应[18]–[21]。我们检测了硼替佐米和阿霉素对MM细胞增殖、DDR相关蛋白表达及核内定位的影响，结果显示，在协同效应模型中，硼替佐米联合阿霉素组p-ATM及γ-H2AX的表达及γ-H2AX的核内募集较阿霉素单药组增强，提示硼替佐米通过增强阿霉素诱导的DDR发挥协同抗MM效应。

阿霉素诱导的DNA双链断裂伴随的DNA修复形式被称为同源重组，后者的关键环节之一是RAD51蛋白等在损伤点募集[22]–[24]，其中包含了多步骤的调控，包括RAD51的表达[25]–[28]、损伤点的募集[29]–[32]、降解[33]–[34]等过程，上述任一环节被阻断均可导致DNA损伤修复缺陷，促进细胞死亡。为探究硼替佐米是否干扰了阿霉素诱导的DDR中的DNA修复，我们检测了RAD51基因表达情况及蛋白产物亚细胞分布。结果显示，硼替佐米可诱导RAD51 mRNA而非蛋白水平升高，提示硼替佐米主要影响RAD51基因的转录，也可能是细胞在应对更大的基因组压力时的反应性改变。泛素化过程参与了RAD51的降解[9]–[10],[33]–[34]，硼替佐米作为蛋白酶体抑制剂是否在此模型中影响了RAD51的降解也是我们后续研究的内容。更重要的是，硼替佐米可将RAD51限制于胞质，减少DNA损伤点RAD51蛋白募集，这也许是硼替佐米加重DNA损伤并与阿霉素协同诱导MM细胞死亡的重要原因。我们的结果也支持Neri等[10]的研究，即蛋白酶体抑制剂可干扰RAD51蛋白的γ-H2AX泛素化依赖性核内募集，导致DNA损伤程度加重，更加深入的机制有待进一步探究。