Regulatory T cells isolated from endometriotic peritoneal fluid express a different number of Toll-like receptors.

OBJECTIVE: To analyze and compare the expression of Toll-like receptors by regulatory T cells present in the peritoneal fluid of patients with and without endometriosis.
METHODS: Regulatory T cells were isolated from peritoneal fluid of women with and without endometriosis, collected during surgery, and mRNA was extracted for analysis of Toll-like receptors expression by reverse-transcriptase polymerase chain reaction.
RESULTS: Patients with endometriosis presented regulatory T cells expressing a larger number and variety of Toll-like receptors when compared to regulatory T cells from patients in the Control Group. Toll-like receptor-1 and Toll-like receptor-2 in regulatory T cells were expressed in both groups. All other expressed Toll-like receptors types were only found in regulatory T cells from the Endometriosis Group.
CONCLUSION: Patients with endometriosis had peritoneal regulatory T cells expressing various Toll-like receptors types.

INTRODUCTION

The pathogenesis of endometriosis remains unclear.[1,2] The most accepted theory is the one advanced by Sampson;[3] it proposes that during menses, the endometrial cells are transported through the fallopian tubes by reverse flow to the peritoneal cavity, where they attach to the serosal surfaces. However, although retrograde menstruation occurs in 90% of women, only approximately 10% develop endometriosis.[4,5] In view of this discrepancy, complementary theories suggest that the immune response of endometriosis patients is altered, and it fails to eliminate the ectopic endometrial implants.[6-10]

As an example, regulatory T cells (Treg) are a subpopulation of specialized immune regulation T lymphocytes, which have been already related to the development of endometriosis.[9]

Although Treg are associated with the production of anti-inflammatory cytokines, there is evidence that under inflammatory conditions, they can also express inflammatory cytokines and, when unregulated, may act to maintain the disease.[11]

Recently, a novel theory was put forward, associating the presence of microorganisms to development of endometriosis.[11,12] It originated from studies indicating that there was more bacterial contamination in menstrual blood, mainly by Escherichia coli, and higher endotoxin levels in the peritoneal fluid of women with endometriosis, as compared to patients without the disease.[11,13] Another study showed that, in women with endometriosis, the presence of Mycoplasma genitalium is associated with down-regulation of genes associated with inflammatory response.[14] The idea is that during retrograde menstruation, endometrial tissue and microorganisms are carried to the peritoneal cavity,[12] with subsequent attachment, proliferation, differentiation and invasion by these cells.[2]

Some studies have suggested microorganisms can be directly detected by Treg through Toll-like receptors (TLRs), which can modulate the suppressive functions of Tregs, and the suppressive function of Treg cells could be enhanced or reversed by TLR.[15]

Considering that women with endometriosis would indeed have more microorganisms in the peritoneal cavity that healthy women, and that microorganisms express and secrete TLR agonists, which could affect Treg cells, we raise the hypothesis there is a difference between TLR expression in Treg cells isolated from patients with endometriosis when compared with controls.

OBJECTIVE

To analyze and compare the expression of Toll-like receptors by regulatory T cells isolated from peritoneal fluid obtained from patients with and without endometriosis.

METHODS

Study population

This case-control study was conducted at Hospital Israelita Albert Einstein (HIAE), São Paulo (SP), Brazil, from January 1st to December 1st, 2018. The study was approved by the HIAE Research Ethics Committee, number 563.939, CAAE: 25915014.2.0000.0071, and all patients signed an Informed Consent Form. Patients were divided into two groups based on surgical findings: with and without endometriosis. The diagnosis of endometriosis depended on finding the characteristic lesions during surgery and subsequent confirmation by histological analysis. Control Group consisted of women with no evidence of endometriosis and who had been operated due to benign ovarian cysts, uterine fibroids, diagnostic laparoscopy or tubal ligation.

A total of 29 patients were included in this study: 23 with endometriosis and 6 controls. Inclusion criteria were women aged 18 to 40 years with eumenorrheic cycles, who underwent laparoscopic surgery (to confirm or rule out endometriosis). The exclusion criteria were women with autoimmune, inflammatory, and/or neoplastic disease and/or taking hormone therapy, including gonadotropin-releasing hormone (GnRH) analogues, progestins, or combined contraceptives, for 3 months before surgery.

For sample collection, just after the insertion of the auxiliary trocar in laparoscopic surgery, all peritoneal fluid deposited in the anterior and/or posterior cul-de-sac was collected with a laparoscopic needle.

Patients were clinically characterized by the presence of deep dyspareunia, dysmenorrhea, chronic pelvic pain, abortions, infertility, menstrual cycle phase, age, race and body mass index (BMI). Dysmenorrhea was measured using the Visual Analog Scale (VAS), a validated score in which a 10cm line represents a grade between “no pain” and “worst paint”.

Isolation and characterization of regulatory T cells from peritoneal fluid

Peritoneal fluid was processed to isolate lymphocytes. Erythrocytes were lysed with lysis buffer at room temperature for 15 minutes. Then cells were washed with phosphate buffered saline (PBS), counted and frozen in fetal bovine serum (FBS) (Gibco, USA) with 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) (Sigma-Aldrich, USA) and cryopreserved in liquid nitrogen until use, when they were thawed under agitation, in water bath at 37°C. The cells were washed by centrifugation (250g, 8 minutes, 8°C) initially with 0.01M PBS, pH 7.2, and followed by a second washing in culture medium (R-10) (Invitrogen-Gibco, Gaithersburg, MD, USA). Next, the cells were suspended in R-10 medium for counting and evaluation of cell viability in a Countess™ automated cell counter. The CD4+CD25+CD127dim regulatory T Cell Isolation Kit II (MACS, MiltenyiBiotec, Auburn, CA, USA) was used to separate the cells according to the manufacturer’s instructions. Briefly, non-CD4+ and CD127high cells were labelled with a cocktail of biotin-conjugated antibodies (CD8, CD19, CD123 and CD127) and submitted to magnetic separation. This enriched fraction of CD4+ T cells was then labelled with anti-CD25 antibody and again underwent magnetic separation. Treg cells (CD4+CD25+CD127dim) were eluted as the positively selected cell fraction. The samples were centrifuged, suspended in 200μLTrizol (TRIzol® reagent, Invitrogen), and frozen at -80°C for extraction of total ribonucleic acid (RNA).

RNA extraction and messenger RNA expression assay

Total RNA from isolated Tregs was extracted according to a standard Trizol RNA isolation protocol (Invitrogen) and purified (Rneasy Micro Kit™; Qiagen, Dusseldorf, Germany). Ribonucleic acid concentration was determined using a NanoDrop® ND-1000 spectrophotometer (Nano-Drop Technologies, Wilmington, Australia). All samples were stored at -80°C.

Complementary deoxyribonucleic acid (cDNA) synthesis was performed by reverse transcription using the specific ImProm-II™ Reverse Transcription System kit (Promega, Madison, WI, USA). The samples were incubated with the specified volume of Random Primer at 70°C for 5 minutes, and then placed on ice for 5 minutes. Next, the samples were briefly centrifuged and left on ice until the completion of the next step. A reagent mixture containing deoxynucleotide triphosphate (dNTP), MgCl2, ImProm-II Reverse Transcriptase (Promega), and ImProm-II™ 5x Reaction Buffer (Promega) was prepared, added to the RNA with Random Primer, and incubated at 25°C for 5 minutes, 42°C for 60 minutes, followed by 10 minutes at 70°C. The resulting cDNAs were stored at -20°C. All reactions were performed at an RNA concentration of 20ng/mL.

Complementary deoxyribonucleic acid pre-amplification was performed using a reagent mix consisting of TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) and TE buffer to complete the volume. The tubes with the reagent mix, cDNA samples, and Master Mix Pre-Amp (Applied Biosystems) were incubated at 95°C for 10 minutes, and then for ten cycles of 95°C for 15 minutes, followed by 4 minutes at 60°C. All samples were stored at -20°C.

Messenger RNA expression was determined by reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) on an ABI 7500 sequence detection system (Applied Biosystems). Polymerase chain reaction was performed in separate tubes for each reaction and each sample was run in duplicate. TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems) were used for target genes TLR1 (Hs00413978_m1), TLR2 (Hs00610101_m1), TLR3 (Hs01551078_m1), TLR4 (Hs00152939_m1), TLR5 (Hs00152825_m1), TLR6 (Hs00271977_s1), TLR7 (Hs00152971_m1), TLR8 (Hs00152972_m1) and TLR9 (Hs00152973_m1).

Statistical analysis

Data analyses were performed using the R statistical program. A significance level of 0.05 was adopted for all comparisons.

Data distribution and variations of all continuous variables were assessed by Shapiro-Wilk and F tests, respectively. Bearing in mind these analyses and the small sample size, non-parametric tests were used. In order to evaluate clinical differences between the groups that could influence the results, we compared the presence of deep dyspareunia, dysmenorrhea, chronic pelvic pain, abortions, infertility, menstrual cycle phase, age, race and BMI. Abortions, deep dyspareunia and chronic pelvic pain were compared by Fisher’s exact test, considering the small sample size and the 2x2 table. Race, menstrual phase and infertility were compared by χ2 test. Age, BMI and dysmenorrhea were compared by Wilcoxon rank-sum test. Since there were missing data on race of four patients and BMI of five patients, the analysis was performed with the available data.

The expression of TLR from Treg cells from peritoneal fluid of Endometriosis and Control Groups was qualitatively analyzed considering the cycle threshold (CT) value of 32 for the categorization of receptor expression in an either “expressed” or “non-expressed” binary qualitative variable.

Subsequently, we compared the specific TLR expression in each group. We also evaluated the TLR expression according to the type of endometriosis. In both cases, Fisher’s exact test was used. The number of TLRs expressed in each group was compared by Wilcoxon rank-sum test. Considering the lower efficiency of this method for small samples, we have also included the Student’s t test. The correlation between the number of TLRs expressed and the age of patients with endometriosis was analyzed by Spearman’s test.

RESULTS

Clinical parameters

The clinical characteristics are presented in table 1. Infertility was reported by 14 patients in the Endometriosis Group and 2 in the control subjects (p=0.019). The mean of dysmenorrhea at VAS was 8.37 in Endometriosis Group and 5.83 in the control subjects (p=0.027). The other clinical parameters showed no difference between groups.

Table 1

Baseline characteristics of endometriosis and control patients

Parameters	Control	Endometriosis	p value
Patients	6	23
Age	34.7	34.5	0.765
Menstrual phase			0.200
Menstrual	0	2
Proliferative	4	5
Secretory	1	9
Unknown	1	7
Dysmenorrhea	5.83	8.39	0.027
Chronic pelvic pain	2	15	0.198
Deep dyspareunia	2	14	0.364
Infertility			0.019
Yes	2	14
No	4	3
Unknown	0	6
Abortions	1	4	1

Results expressed as n or mean.

Dysmenorrhea: mean at Visual Analogue Scale. Abortions, deep dyspareunia and chronic pelvic pain were compared by Fisher’s exact test, menstrual phase and infertility by χ2 test, age and dysmenorrhea by Wilcoxon rank-sum test.

Toll-like receptor expression

The expression of TLR in Treg cells obtained from the peritoneal fluid is summarized in table 2. In the Control Group, three out of the six women did not express any TLR in peritoneal Tregs, one expressed only TLR1 and two women expressed only TLR2. Expression of TLR 3 to 9 by peritoneal Tregs was negative in all control subjects.

Table 2

Expression of Toll-like receptors by peritoneal regulatory T-cells from patients with endometriosis and controls

TLR	Endometriosis	Control	p value
TLR	12/23 (52.2)	3/6 (50.0)	1.000
TLR1	8/23 (34.8)	1/6 (16.7)	0.633
TLR2	12/23 (52.2)	2/6 (33.3)	0.651
TLR3	1/23 (4.3)	0/6 (0.0)	1.000
TLR4	5/23 (21.7)	0/6 (0.0)	0.553
TLR5	6/23 (26.1)	0/6 (0.0)	0.295
TLR6	2/23 (8.7)	0/6 (0.0)	1.000
TLR7	5/23 (21.7)	0/6 (0.0)	0.553
TLR8	3/23 (13.0)	0/6 (0.0)	1.000
TLR9	0/23 (0.0)	0/6 (0.0)	-

Results expressed by the % of women within the group with and without endometriosis whose Treg cells showed expression of a certain type of TLR.

Expression of a specific Toll-like receptor in the peritoneal regulatory T cells population was considered positive (+; binary qualitative variable) considering the cycle threshold value of 32. Toll-like receptors compared by Fisher’s exact test. TLR: Toll-like receptors.

In the Endometriosis Group, seven patients had peritoneal Tregs expressing three or more TLR, with TLR5 being the most frequent (in six out of seven patients). Four patients expressed only TLR2 and one patient expressed both TLR1 and TLR2, whereas in 11 patients peritoneal Tregs did not express any TLR.

Except for TLR9, all TLRs were found to be expressed (alone or co-expressed) in Tregs from endometriosis patients.

No association was identified in the evaluation of specific TLR expression in each group, neither as per type of endometriosis.

The comparison of the number of TLRs between Endometriosis and Control Groups should suggest the presence of endometriosis could be related to the expression of a greater number of receptors (Figure 1). Since the amount of TLRs expressed did not show a normal distribution or homogeneous variances, and considering the small sample size, Wilcoxon rank-sum test was used, but no statistically significant results were obseved (p=0.453). In the view of the lower efficiency of this method for small samples, we have also included the Student’s t test, which showed a statistically significant difference (p=0.027). No correlation was identified in the assessment of the number of TLRs expressed according to the age of endometriosis patients.

Figure 1

Number of Toll-like receptors expressed in regulatory T cells isolated from Endometriosis and Control Groups

* Students t-test; † Wilcoxon rank-sum test.

TLR: Toll-like receptors.

DISCUSSION

This is the first study evaluating the expression of different TLRs in Treg cells isolated from peritoneal fluid from patients with and without endometriosis.

The results showed patients with endometriosis presented Treg cells expressing a larger number and variety of TLRs when compared to Tregs from patients in the Control Group. TLR1 and TLR2 in Tregs cells were expressed in both groups. All other expressed TLRs types were only found in Tregs from the Endometriosis Group, although only it was possible to identify the expression in approximately 33% (7 out of 23) of endometriosis patients. Quantitative evaluation of the total number of expressed receptors demonstrated that Endometriosis Group has a greater number of TLRs in relation to the control through parametric analysis used, due to its efficiency for small samples.[16] Therefore, the expression of different receptors suggests a cumulative effect on immune response balance. In addition, TLR5 was found only in patients who expressed three or more distinct TLRs, corresponding to 6 out of 7 patients.

For more conclusive responses, more patients should be analyzed in this study, the small sample size is the main limitation of this study.

Treg cells are a subpopulation of T cells that maintain immunological self-tolerance and homeostasis, control the suppression of excessive immune response to the host[16] and have been suggested to play a role in immune impairment observed in endometriosis disease.[7-10] Toll-like receptors are transmembrane proteins located on the cell surface or on the endosome wall, responsible for inducing the expression of various host defense mechanisms.[15,17]Some studies suggested that microorganisms can be directly detected by Tregs through TLR[18,19] that can modulate the suppressive function of Tregs,[19-24] which could supposedly be enhanced or reversed by TLR agonists.[19]

The larger variety of TLRs types expressed by Tregs present in the peritoneal cavity of some patients with endometriosis could suggest the putative stimulation of the target cells by microorganisms. These could theoretically reach the peritoneal cavity by retrograde menstruation.[12]

Toll-like receptors agonists present in microorganisms can influence Treg functions.[19,24] TLR2 and TLR8 agonists can inhibit the suppressive function of Tregs, whereas TLR4 and TLR5 agonists can have the opposite effect.[19] Since microorganisms were not isolated, it was not possible to evaluate its direct association with Treg phenotype, but one can presume that at least for part of the women affected by endometriosis, the presence of microorganisms in the peritoneal cavity could modify, via Tregs, the balance of immune or inflammatory cell populations. The imbalance towards a more tolerogenic microenvironment would impair the normal elimination of endometrial cells carried to the peritoneal cavity.

CONCLUSION

Although a group of endometriosis patients had peritoneal regulatory T cells expressing a larger number and variety of toll-like receptors compared to the corresponding type of the Control Group, statistical analysis was unable to achieve statistical significance. For these reasons, a study with larger cohort of patients is needed to prove our hypothesis and investigate phenotypic and functional changes in peritoneal cells in endometriosis.

INTRODUÇÃO

A patogênese da endometriose permanece incerta.[1,2] A teoria mais aceita é a de Sampson;[3] a qual propõe que, durante a menstruação, as células endometriais são transportadas pelas tubas uterinas por fluxo reverso até a cavidade peritoneal, onde aderem às superfícies da serosa. No entanto, embora a menstruação retrógrada ocorra em 90% das mulheres, apenas cerca de 10% são acometidas pela endometriose.[4,5] Devido a essa discrepância, teorias complementares sugerem que a resposta imunológica de pacientes com endometriose fica alterada e não consegue eliminar os implantes endometriais ectópicos.[6-10]

Por exemplo, os linfócitos T reguladores (Treg) são uma subpopulação de linfócitos T especializados na regulação da resposta imune, que já foram implicados no surgimento da endometriose.[9]

Embora as células Treg estejam associados à produção de citocinas anti-inflamatórias, há evidências de que, sob condições inflamatórias, eles também expressam citocinas inflamatórias e, quando desregulados, contribuem para a manutenção da doença.[11]

Recentemente, uma nova teoria foi proposta, associando a presença de microrganismos ao desenvolvimento da endometriose.[11,12] Essa teoria parte de estudos que indicam uma maior contaminação bacteriana no sangue menstrual, principalmente por Escherichia coli, e maiores níveis de endotoxina no fluido peritoneal de mulheres com endometriose, em comparação a pacientes sem a doença.[11,13] Outro estudo mostrou que, em mulheres com endometriose, a presença de Mycoplasma genitalium é associada com a regulação negativa de genes relacionados à resposta inflamatória.[14] A ideia é que, durante a menstruação retrógrada, tecido endometrial e microrganismos são carregados para a cavidade peritoneal,[12] com posterior adesão, proliferação, diferenciação e invasão por essas células.[2]

Estudos sugerem que microrganismos podem ser diretamente detectados pelos linfócitos Treg por meio dos receptores do tipo Toll (TLRs), capazes de modular as funções supressoras dos Tregs, e essa função supressora dos linfócitos Treg pode ser potencializada ou revertida pelos TLRs.[15]

Considerando-se que mulheres com endometriose, de fato, apresentam mais microrganismos na cavidade peritoneal que mulheres saudáveis, e os microrganismos expressam e secretam agonistas de TLR, que poderiam afetar os linfócitos Treg, nossa hipótese é a de que há uma diferença entre a expressão de TLR em linfócitos Treg isolados de pacientes com endometriose em comparação aos controles.

OBJETIVO

Analisar e comparar a expressão de receptores do tipo Toll por células T reguladoras isoladas de fluido peritoneal obtidos de pacientes com endometriose e de mulheres sem endometriose.

MÉTODOS

População do estudo

Este estudo de caso-controle foi realizado no Hospital Israelita Albert Einstein (HIAE), em São Paulo (SP), de 1º de janeiro a 1º de dezembro de 2018. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do HIAE, número 563.939, CAAE: 25915014.2.0000.0071, e todas as pacientes assinaram um Termo de Consentimento Livre e Informado. As pacientes foram divididas em dois grupos com base nos achados cirúrgicos: com e sem endometriose. O diagnóstico de endometriose dependia da observação de lesões características durante a cirurgia e posterior confirmação por histologia. O Grupo Controle foi composto por mulheres sem qualquer evidência de endometriose, que tinham sido operadas por cistos benignos de ovário, miomas uterinos, laparoscopia diagnóstica ou laqueadura.

Foram incluídas 29 pacientes neste estudo: 23 com endometriose e 6 controles. Os critérios de inclusão foram mulheres com idade entre 18 e 40 anos com ciclos eumenorreicos, submetidas à cirurgia laparoscópica (para confirmar ou excluir endometriose). Os critérios de exclusão foram mulheres com doença autoimune, inflamatória e/ou neoplásica e/ou em terapia hormonal, incluindo análogos do hormônio de liberação de gonadotrofinas (GnRH), progestinas ou anticoncepcionais combinados, por 3 meses antes da cirurgia.

Para coleta de amostras, logo após a passagem do trocarte auxiliar na cirurgia laparoscópica, todo o fluido peritoneal depositado na escavação retouterina anterior e/ou posterior foi coletado com uma agulha laparoscópica.

As pacientes foram caracterizadas clinicamente pela presença de dispareunia profunda, dismenorreia, dor pélvica crônica, abortos, infertilidade, fase do ciclo menstrual, idade, etnia e índice de massa corporal (IMC). A dismenorreia foi medida por meio da Escala Visual Analógica (VAS), uma escala validada na qual uma linha de 10cm representa uma graduação entre “nenhuma dor” e “pior dor”.

Isolamento e caracterização de linfócitos T reguladores provenientes do fluido peritoneal

O fluido peritoneal foi processado para que os linfócitos fossem isolados. Os eritrócitos foram lisados com tampão de lise em temperatura ambiente por 15 minutos. Em seguida, os linfócitos foram lavados com tampão fosfato-salino (PBS), contados e congelados em soro fetal bovino (SFB) (Gibco, USA) com dimetilsulfóxido (DMSO) a 10% (Sigma-Aldrich, USA) e criopreservados em nitrogênio líquido até o uso, quando foram descongelados sob agitação em banho-maria a 37°C. Os linfócitos foram lavados por centrifugação (250g, 8 minutos, 8°C) inicialmente com 0,01M PBS, pH 7,2, seguido por uma segunda lavagem em meio de cultura (R-10) (Invitrogen-Gibco, Gaithersburg, MD, USA). Depois, as células foram suspensas em meio R-10 para contagem e avaliação da viabilidade celular em um contador de células automático Countess™. O CD4+CD25+CD127dim regulatory T Cell Isolation Kit II (MACS, MiltenyiBiotec, Auburn, CA, USA) foi usado para separar as células de acordo com as instruções do fabricante. Rapidamente, os linfócitos não CD4+ e CD127high foram marcados com um coquetel de anticorpos conjugados com biotina (CD8, CD19, CD123 e CD127) e submetidos à separação magnética. Esta fração enriquecida de linfócitos T CD4+ foi marcada com anticorpos anti-CD25 e depois, novamente, submetida à separação magnética. Os Treg (CD4+CD25+CD127dim) foram eluídos como a fração de células selecionadas positivamente. As amostras foram centrifugadas, suspensas em 200μL de Trizol (reagente TRIzol®, Invitrogen) e congeladas a -80°C para extração total do ácido ribonucleico (RNA).

Extração de RNA e teste de expressão do RNA mensageiro

O RNA total dos Tregs isolados foi extraído de acordo com um protocolo padrão de isolamento com Trizol e purificado (Rneasy Micro Kit™, Qiagen, Dusseldorf, Germany). A concentração de RNA foi determinada usando-se um espectrofotômetro NanoDrop® ND-1000 (Nano-Drop Technologies, Wilmington, Australia). Todas as amostras foram armazenadas a -80°C.

Foi realizada síntese de ácido desoxirribonucleico complementar (cDNA) por transcrição reversa usando-se o kit específico ImProm-II™ Reverse Transcription System (Promega, Madison, WI, USA). As amostras foram incubadas com o volume específico de Random Primer a 70°C por 5 minutos e, depois, colocadas em gelo por 5 minutos. Depois, as amostras foram centrifugadas brevemente e deixadas em gelo até a conclusão do próximo passo. Uma mistura de reagentes contendo desoxinucleotídeo trifosfato (dNTP), MgCl2, transcriptase reversa ImProm-II (Promega) e tampão de reação ImProm-II™ 5x (Promega) foi preparada, adicionada ao RNA com Random Primer e incubada a 25°C por 5 minutos, 42°C por 60 minutos, seguida por 10 minutos a 70°C. Os cDNAs resultantes foram armazenados a -20°C. Todas as reações foram realizadas a uma concentração de RNA de 20ng/mL.

Uma pré-amplificação complementar de ácido desoxirribonucleico foi realizada utilizando-se uma mistura de reagentes composta pelos testes Taqman de expressão gênica (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) e tampão TE para completar o volume. Tubos com a mistura de reagentes, amostras de cDNA e o Master Mix Pre-Amp (Applied Biosystems) foram incubados a 95°C por 10 minutos e, depois, por dez ciclos de 95°C por 15 minutos, seguidos por 4 minutos a 60°C. Todas as amostras foram armazenadas a -20°C.

A expressão de RNA mensageiro foi determinada por reação em cadeia da polimerase com transcriptase reversa (RT-PCR) em um sistema de detecção de sequências ABI 7500 (Applied Biosystems). A reação em cadeia da polimerase foi realizada em tubos separados para cada reação, e cada amostra foi processada em duplicata. Foram usados testes TaqMan de expressão gênica (Applied Biosystems) para os genes-alvo TLR1 (Hs00413978_m1), TLR2 (Hs00610101_m1), TLR3 (Hs01551078_m1), TLR4 (Hs00152939_m1), TLR5 (Hs00152825_m1), TLR6 (Hs00271977_s1), TLR7 (Hs00152971_m1), TLR8 (Hs00152972_m1) e TLR9 (Hs00152973_m1).

Análise estatística

As análises de dados foram realizadas no programa estatístico R. O nível de significância de 0,05 foi adotado para todas as comparações.

A distribuição de dados e variações de todas as variáveis contínuas foram analisadas pelos testes de Shapiro-Wilk e F, respectivamente. Considerando-se essas análises e o tamanho pequeno da amostra, foram usados testes não paramétricos. Para avaliar diferenças clínicas entre os grupos que poderiam influenciar nos resultados, comparou-se a presença de dispareunia profunda, dismenorreia, dor pélvica crônica, abortos, infertilidade, fase do ciclo menstrual, idade, etnia e IMC. Abortos, dispareunia profunda e dor pélvica crônica foram comparadas pelo teste exato de Fisher, considerando-se o pequeno tamanho da amostra e a tabela 2x2. Etnia, fase menstrual e infertilidade foram comparados pelo teste χ2. Idade, IMC e dismenorreia foram comparados pelo teste de soma de postos de Wilcoxon. Como não havia dados sobre etnia de quatro pacientes e sobre IMC de cinco pacientes, a análise foi realizada com os dados disponíveis.

A expressão de TLR em células Treg do fluido peritoneal dos Grupos de Endometriose e Controle foi analisada qualitativamente considerando-se o valor de limiar do ciclo (em inglês, cycle threshold, ou CT) de 32 para categorização da expressão dos receptores em uma variável binária qualitativa, “expresso” ou “não expresso”.

Em seguida, comparamos a expressão de TLRs específicos em cada grupo. Também avaliamos a expressão de TLR de acordo com o tipo de endometriose. Em ambos os casos, foi usado o teste exato de Fisher. O número de TLRs expressos em cada grupo foi comparado pelo teste de soma de postos de Wilcoxon. Considerando-se a menor eficiência deste método para amostras pequenas, incluímos também o teste t de Student. A correlação entre o número de TLRs expressos e a idade das pacientes com endometriose foi analisada pelo teste de Spearman.

RESULTADOS

Parâmetros clínicos

As características clínicas são apresentadas na tabela 1. Infertilidade foi reportada por 14 pacientes no Grupo de Endometriose e duas nos controles (p=0,019). A média para dismenorreia na EVA foi 8,37 no Grupo de Endometriose e 5,83 nos controles (p=0,027). Não houve diferença entre os grupos para os outros parâmetros clínicos.

Tabela 1

Características iniciais de pacientes com endometriose e controles

Parâmetros	Controle	Endometriose	Valor de p
Pacientes	6	23
Idade	34,7	34,5	0,765
Fase mentrual			0,200
Menstrual	0	2
Proliferativa	4	5
Secretória	1	9
Desconhecida	1	7
Dismenorreia	5,83	8,39	0,027
Dor pélvica crônica	2	15	0,198
Dispareunia profunda	2	14	0,364
Infertilidade			0,019
Sim	2	14
Não	4	3
Desconhecida	0	6
Abortos	1	4	1

Resultados expressos por n ou média.

Dismenorreia: média na Escala Visual Analógica. Abortos, dispareunia profunda e dor pélvica crônica foram comparados pelo teste exato de Fisher; fase menstrual e infertilidade, pelo teste χ2; idade e dismenorreia, pelo teste de soma dos postos de Wilcoxon.

Expressão de receptores do tipo Toll

A expressão de TLRs nos linfócitos Treg obtidos do fluido peritoneal foi resumida na tabela 2. No Grupo Controle, três das seis mulheres não expressaram nenhum TLR em Tregs peritoneais, uma expressou apenas TLR1, e duas expressaram apenas TLR2. A expressão de TLR 3 a 9 por linfócitos Treg peritoneais foi negativa em todos os indivíduos do Grupo Controle.

Tabela 2

Expressão de receptores do tipo Toll por linfócitos T reguladores peritoneais de pacientes com endometriose e controles

TLR	Endometriose	Controle	Valor de p
TLR	12/23 (52,2)	3/6 (50,0)	1,000
TLR1	8/23 (34,8)	1/6 (16.7)	0,633
TLR2	12/23 (52,2)	2/6 (33.3)	0,651
TLR3	1/23 (4,3)	0/6 (0.0)	1,000
TLR4	5/23 (21,7)	0/6 (0.0)	0,553
TLR5	6/23 (26,1)	0/6 (0.0)	0,295
TLR6	2/23 (8,7)	0/6 (0.0)	1,000
TLR7	5/23 (21,7)	0/6 (0.0)	0,553
TLR8	3/23 (13,0)	0/6 (0.0)	1,000
TLR9	0/23 (0,0)	0/6 (0.0)	-

Resultados expressos pela (%) de mulheres dentro do grupo com e sem endometriose cujas células Treg apresentaram expressão de determinado tipo de TLR.

A expressão de um receptor Toll específico na população de linfócitos T reguladores peritoneais foi considerada positiva (+; variável binária, qualitativa), considerando-se o valor limiar do ciclo de 32. Receptores do tipo Toll comparados pelo teste exato de Fisher. TLR: receptores do tipo Toll.

No Grupo de Endometriose, sete pacientes apresentaram Tregs peritoneais com expressão de três ou mais TLRs, sendo TLR5 o mais frequente (em seis de sete pacientes). Quatro pacientes expressaram apenas TLR2, uma paciente expressou tanto TLR1 quanto TLR2, e em 11 pacientes, os Tregs peritoneais não expressaram TLR.

Exceto pelo TLR9, foi observada expressão de todos os TLRs (sozinhos ou coexpressos) em Tregs de pacientes com endometriose.

Não foi identificada associação na avaliação da expressão de TLR específicos em cada grupo, nem de acordo com o tipo de endometriose.

A comparação do número de TLR entre os Grupos de Endometriose e Controle deveria sugerir que a presença da endometriose pode estar relacionada à expressão de um maior número de receptores (Figura 1). Como o número de TLR expressos não mostrou distribuição normal nem variâncias homogêneas e considerando-se o tamanho pequeno da amostra, o teste de soma de pontos de Wilcoxon foi usado, mas não foram observados resultados estatisticamente significativos (p=0,453). Tendo em vista a eficiência mais baixa desse método com amostras menores, incluímos também o teste t de Student, que mostrou diferença estatisticamente significante (p=0,027). Nenhuma correlação foi identificada (dados não mostrados) na avaliação do número de TLRs expressos, de acordo com a idade das pacientes com endometriose.

Figura 1

Número de receptores do tipo Toll expressos em células T reguladoras isoladas dos Grupos Endometriose e Controle

* Teste t de Student; † teste de soma de postos de Wilcoxon. TLR: receptores do tipo Toll.

DISCUSSÃO

Este é o primeiro estudo que avaliou a expressão de diferentes TLRs em células Treg isoladas do fluido peritoneal de pacientes com e sem endometriose.

Os resultados mostram que pacientes com endometriose apresentaram células Treg com expressão de maior número e variedade de TLRs em comparação aos linfócitos Treg de pacientes do Grupo Controle. TLR1 e TLR2 foram expressos pelos linfócitos Treg em ambos os grupos. Todos os outros tipos de TLRs foram encontrados somente em Tregs do Grupo de Endometriose, embora só tenha sido possível identificar essa expressão em cerca de 33% (7 de 23) das pacientes com endometriose. A avaliação quantitativa do número total de receptores expressos demonstrou que o Grupo de Endometriose apresenta um número maior de TLRs em relação aos controles, usando-se análise paramétrica, devido à eficiência desta para amostras pequenas.[16] Assim, a expressão de diferentes receptores sugere um efeito cumulativo sobre o balanço da resposta imune. Além disso, o TLR5 foi encontrado apenas em pacientes que expressavam três ou mais TLRs diferentes, correspondendo a seis de sete pacientes.

Para respostas mais conclusivas, este estudo deveria ter analisado mais pacientes, e o tamanho pequeno da amostra é sua principal limitação.

As células Treg são uma subpopulação de células T que mantêm a autotolerância imunológica e a homeostase, controlam a supressão da resposta imune excessiva ao hospedeiro,[16] e supostamente influenciam no comprometimento imunológico observado na endometriose.[7-10] Os TLRs são proteínas transmembrana localizadas na superfície das células ou na parede do endossomo, responsáveis por induzir a expressão de vários mecanismos de defesa do hospedeiro.[15,17] Alguns estudos sugeriram que microrganismos podem ser diretamente detectados por linfócitos Treg por meio dos TLRs,[18,19] receptores capazes de modular a função supressora dos Tregs,[19-24] e que essa função supressora das células Treg pode, supostamente, ser potencializada ou revertida pelos agonistas de TLR.[19]

A maior variedade de tipos de TLRs expressos por Tregs presentes na cavidade peritoneal de pacientes com endometriose poderia sugerir uma suposta estimulação das células-alvo por microrganismos. Estes, teoricamente, chegariam à cavidade peritoneal pela menstruação retrógrada.[12]

Os agonistas de receptores Toll presentes nos microrganismos podem influenciar nas funções dos linfócitos Treg.[19,24] Os agonistas de TLR2 e TLR8 podem inibir a função supressora dos linfócitos Treg, enquanto os agonistas de TLR4 e TLR5 podem ter o efeito oposto.[19] Como os microrganismos não foram isolados, não foi possível avaliar sua associação direta com o fenótipo dos Treg, mas pode-se supor que, pelo menos para algumas das mulheres acometidas pela endometriose, a presença de microrganismos na cavidade peritoneal poderia modificar, por meio dos Tregs, o balanço entre as populações de células imunes ou inflamatórias. O desequilíbrio em direção a um microambiente mais tolerogênico prejudicaria a eliminação normal das células endometriais carregadas para a cavidade peritoneal.

CONCLUSÃO

Embora um grupo de pacientes com endometriose tenha apresentado células T reguladoras peritoneais com expressão de receptores do tipo Toll em maior número e variedade em comparação ao tipo correspondente no Grupo Controle, a análise não foi capaz de alcançar significância estatística. Assim, é necessário um estudo com coortes maiores de pacientes para comprovar nossa hipótese e investigar alterações fenotípicas e funcionais em células peritoneais na endometriose.