[Mean corpuscular volume ≤100 fl was an independent prognostic factor in patients with myelodysplastic syndrome and bone marrow blast<5 percent].

Objective: To explore the prognostic effects of mean corpuscular volume (MCV) in patients with myelodysplastic syndromes (MDS) .
Methods: 321 newly diagnosed, untransfused primary MDS patients who administered from December 2009 to December 2017 were enrolled. The association of MCV with prognosis and several clinical features and genetic mutations were analyzed.
Results: Patients were divided into MCV≤100 fl (n=148) and MCV>100 fl (n=173) cohorts. Median overall survival of patients with MCV≤100 fl was shorter than their counterparts (27 months vs 72 months, P<0.001) . In subgroup analysis, MCV≤100 fl patients had worse survivals in bone marrow blast <5% cohort (34 months vs not reached, P=0.002) , but not so in ≥5 % cohort (17 months vs 20 months, P=0.078) . MCV≤100 fl was still an independent adverse variable (HR=1.890, 95%CI 1.007-3.548, P=0.048) after adjusting for clinical and laboratory variables and mutation topography in bone marrow blasts<5% cohort. In bone marrow blasts<5% cohort, patients with MCV≤100 fl had higher hemoglobin levels [90 (42-153) g/L vs 78.5 (28-146) g/L, P=0.015].The proportions of Revised International Prognostic Scoring System (IPSS-R) high/very high risks and poor/very poor IPSS-R karyotypes were higher in MCV≤100 fl cohort (28.8% vs 10.8%, P=0.003; 24.7% vs 12.9%, P=0.049) . MCV≤100 fl cohort had more genetic mutations than those with MCV>100 fl though without significance (0.988 vs 0.769, P=0.064) . Mutated SF3B1 was less frequently in MCV≤100 fl cohort (4.7% vs 15.4%, P=0.018) .
Conclusion: MCV≤100 fl was an independent adverse variable after adjusting for clinical and laboratory variables and mutation topography in MDS patients with bone marrow blasts<5%.

大细胞性贫血是骨髓增生异常综合征（MDS）患者的主要特征[1]。已有研究报道平均红细胞体积（MCV）与MDS患者预后相关[2]–[3]，但其影响预后的可能机制尚不清楚。我们回顾性收集了321例初诊、未接受红细胞输注的MDS患者，探讨MCV水平对预后的影响因素，现报道如下。

病例与方法

1．病例资料：回顾性收集2009年12月至2017年12月于中国医学科学院血液病医院确诊的MDS患者。纳入标准：①叶酸、维生素B12、血清铁及铁蛋白水平均正常；②确诊前未接受过红细胞输注；③保存骨髓细胞标本并完成二代测序检测。共321例患者纳入研究，男206例，女115例，中位年龄55（14~83）岁。按照WHO（2016）MDS诊断和分型标准[4]，MDS伴单系发育异常（MDS-SLD）20例（6.2%），MDS伴多系发育异常（MDS-MLD）148例（46.1%），MDS伴环形铁粒幼红细胞伴单系发育异常（MDS-RS-SLD）6例（1.9%），MDS伴环形铁粒幼红细胞伴多系发育异常（MDS-RS-MLD）3例（0.9%），MDS伴原始细胞增多-1（MDS-EB-1）66例（20.6%），MDS伴原始细胞增多-2（MDS-EB-2）66例（20.6%），MDS伴5q-6例（1.9%），MDS未分类（MDS-U）6例（1.9%）。279例（86.9%）患者具有可分析的染色体核型结果，采用修订的国际预后积分系统（IPSS-R）[5]对患者进行预后分层，其中极低危14例（5.0%），低危81例（29.0%），中危72例（25.8%），高危71例（25.4%），极高危41例（14.7%）。321例患者中，66例（20.6%）接受红细胞生成素（EPO）±粒细胞集落刺激因子（G-CSF）或输血支持治疗，128例（39.9%）接受免疫抑制剂或免疫调节剂治疗，55例（17.1%）接受地西他滨治疗，37例（11.5%）接受造血干细胞移植，16例（5.0%）接受CAG/HAG（阿克拉霉素/高三尖杉酯碱+阿糖胞苷+G-CSF）方案化疗，19例（5.9%）单纯接受中药治疗。

2．全血细胞计数：采用Sysmex XN-9000全自动血细胞分析仪进行外周血细胞计数，MCV正常参考范围为80~100 fl。

3．染色体核型分析：骨髓细胞经过24 h短期培养后收集细胞常规制片，R显带，根据《人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN2013）》描述核型异常。依据IPSS-R染色体核型分组标准[5]进行染色体核型预后分组。

4．靶向测序检测基因突变：所有患者DNA样本来源于骨髓单个核细胞。使用PCR引物扩增目的基因组（112个血液肿瘤相关基因），富集后采用Ion Torrent半导体测序平台进行测序。平均基因覆盖率98.1%，平均测序深度1 310×，95%以上的目标区域测序深度超过20×。测序后原始数据利用COSMIC、CCDS、dbSNP（v138）、1 000 genomes、人基因组数据库（HG19）、PolyPhen-2、SIFT等数据库进行生物信息学分析，确定致病性基因突变位点。具体测序方法参照本研究组此前已发表文献[6]–[7]。

5．随访：随访截止时间为2019年5月10日，共290例（90.3%）患者拥有完整随访资料，存活患者的中位随访时间为22（1~109）个月。随访资料来源于住院病历、门诊病历及电话随访记录。对随访期间死亡的病历，按照病例记录或与患者家属电话联系确认。总生存（OS）期按诊断日期到死亡或末次随访日期计算。

6．统计学处理：采用Graphpad Prism 6.0、R 3.6.1及JMP pro 13.2进行统计分析及图形绘制。非正态分布的连续性变量资料以中位数（范围）表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验；分类变量资料组间比较采用卡方检验或Fisher精确概率法；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线并通过Log-rank检验进行单因素分析，采用COX比例风险回归模型进行多因素分析校正其他因素。

结果

一、MCV分组

参照MCV正常参考范围（80~100 fl）分为MCV≤100 fl（148例）和MCV>100 fl组（173例）。

二、MCV水平的预后意义

1．MCV水平在全部患者中的预后意义：截至末次随访时间，有完整随访资料的290例患者中存活182例（62.8%），死亡108例（37.2%），中位OS时间36（95%CI 20~52）个月。MCV≤100 fl患者中位OS时间为27（95%CI 19~35）个月，MCV>100 fl组患者中位OS时间为72（95%CI 5~139）个月，差异有统计学意义（P<0.001）（图1A）。

图1

平均红细胞体积（MCV）水平对骨髓增生异常综合征患者生存的影响

A：290例患者整体队列比较；B：175例骨髓原始细胞<5%组患者比较；C：115例骨髓原始细胞≥5%组患者比较

对患者年龄、血细胞计数、染色体核型预后分组、骨髓原始细胞计数及等位基因突变频率（VAF）≥2%的基因进行单因素分析，其中年龄≥ 60岁、HGB<80 g/L（以HGB>100 g/L为参照）、IPSS-R染色体核型差/很差（以IPSS-R染色体核型好/很好为参照）、骨髓原始细胞≥5%、ASXL1突变和TP53突变的患者OS时间显著缩短（表1）。COX模型调整基因突变因素后，MCV≤100 fl为独立于基因突变的不良预后因素（HR=1.704，95%CI 1.146~2.534，P=0.008）；同时调整基因突变因素及其余临床指标后，MCV≤100 fl不再为OS的独立不良预后因素（P=0.262）（表1）。

表1

321例骨髓增生异常综合征患者总生存的单因素及多因素分析

参数		单因素分析			多因素模型1			多因素模型2
		HR	95%CI	P值	HR	95%CI	P值	HR	95%CI	P值
年龄≥60岁		1.726	1.228～2.708	0.004				1.616	1.011～2.584	0.045
HGB水平
	>100 g/L	参照						参照
	80～100 g/L	1.624	0.952～2.770	0.075				1.635	0.947～2.824	0.078
	<80 g/L	1.676	1.079～2.606	0.023				1.674	0.930～3.015	0.086
ANC<0.8×109/L		1.473	1.005～2.371	0.051				1.061	0.673～1.672	0.799
MCV≤100 fl		2.021	1.473～3.213	<0.001	1.704	1.146～2.534	0.008	1.302	0.821～2.067	0.262
IPSS-R染色体核型
	好/很好	参照						参照
	中等	1.311	0.803～2.140	0.278				1.340	0.794～2.263	0.273
	差	2.974	1.524～5.805	0.001				3.333	1.682～6.605	0.001
	很差	4.035	2.213～7.357	<0.001				3.651	1.960～6.803	<0.001
骨髓原始细胞≥5%		2.835	2.385～5.550	<0.001				2.547	1.624～3.996	<0.001
ASXL1突变		2.478	1.896～8.292	<0.001	2.062	1.195～3.558	0.009	2.238	1.239～4.042	0.008
TET2突变		1.672	0.944～3.929	0.075	1.709	0.941～3.104	0.078	1.216	0.603～2.454	0.585
TP53突变		1.955	1.069～6.074	0.037	2.127	1.085～4.169	0.028	0.636	0.247～1.639	0.349
SETBP1突变		1.797	0.910～3.296	0.084	2.186	1.086～4.403	0.029	2.929	1.357～6.325	0.006
KRAS突变		2.819	0.953～41.97	0.060	3.198	0.989～10.346	0.052	3.374	0.985～11.555	0.053

注：MCV：平均红细胞体积；IPSS-R：修订的国际预后积分系统；多因素模型1调整基因突变因素，观察MCV≤100 fl对总生存的影响；多因素模型2调整基因突变因素及其他临床指标，观察MCV≤100 fl对总生存的影响

2．MCV水平对不同原始细胞比例亚组的预后意义：根据骨髓原始细胞比例将患者分为原始细胞<5%组（189例）及原始细胞≥5%组（132例）。在原始细胞<5%的患者中，MCV≤100 fl患者的中位OS时间为34（95%CI 24~44）个月，较MCV>100 fl者显著缩短（中位OS时间未达到），差异有统计学意义（P=0.002）（图1B）；而在原始细胞≥5%患者中，MCV≤100 fl患者的中位OS时间为17（95%CI 12~22）个月，MCV>100 fl者为20（95%CI 10~30）个月（P=0.078）（图1C）。对原始细胞<5%组患者的其余临床指标及基因突变进行单因素分析，其中HGB<80 g/L、IPSS-R染色体核型差/很差（以IPSS-R染色体核型好/很好为参照）、ASXL1突变、TET2突变和PTPN11突变患者OS时间显著缩短。多因素分析显示MCV≤100 fl为独立于基因突变的不良预后因素（HR=2.236，95%CI 1.275~3.921，P=0.005）。在纳入其余临床指标及基因突变校正后，MCV≤100 fl依旧为原始细胞<5%组患者OS的独立预后不良因素（HR=1.890，95% CI 1.007~3.548，P=0.048）（表2）。

表2

骨髓原始细胞<5%骨髓增生异常综合征（MDS）患者总生存的单因素及多因素分析

参数		单因素分析			多因素模型1			多因素模型2
		HR	95%CI	P值	HR	95%CI	P值	HR	95%CI	P值
HGB水平
	>100 g/L	参照						参照
	80～100 g/L	1.028	0.433～2.444	0.950				1.581	0.617～4.052	0.341
	<80 g/L	2.016	1.088～5.598	0.025				2.371	1.147～4.901	0.020
ANC<0.8×109/L		1.652	0.934～3.416	0.083				1.163	0.558～2.425	0.687
MCV≤100 fl		2.545	1.606～5.024	<0.001	2.236	1.275～3.921	0.005	1.890	1.007～3.548	0.048
IPSS-R染色体核型
	好/很好	参照						参照
	中等	1.711	0.840～3.812	0.135				2.188	1.035～4.627	0.040
	差	5.516	2.331～13.055	<0.001				4.520	1.784～11.452	0.001
	很差	9.237	4.007～21.294	<0.001				10.537	4.333～25.622	<0.001
ASXL1突变		2.608	1.406～14.870	0.013	2.336	1.021～5.345	0.045	3.940	1.627～9.541	0.002
TET2突变		2.136	1.101～7.411	0.032	2.098	1.010～4.359	0.047	1.820	0.798～4.152	0.155
PTPN11突变		4.361	1.600～491.900	0.024	5.216	1.218～22.332	0.026	15.329	3.066～76.633	0.001

注：MCV：平均红细胞体积；IPSS-R：修订的国际预后积分系统；多因素模型1调整基因突变因素，观察MCV≤100 fl对总生存的影响；多因素模型2调整基因突变因素及其他临床指标，观察MCV≤100 fl对总生存的影响

三、MCV影响骨髓原始细胞<5% MDS患者预后的关联因素分析

1．临床特征及常规实验室参数的比较：在骨髓原始细胞<5%的患者中，MCV≤100 fl组患者外周血HGB[90（42~153）g/L]高于MCV>100 fl组[78.5（28~146）g/L]，差异有统计学意义（P=0.015）。MCV≤100 fl组患者IPSS-R高危/极高危组比例显著高于MCV>100 fl组（28.8%对10.8%，P=0.003）；同时，MCV≤100 fl组患者中IPSS-R染色体核型分组差/很差比例明显高于MCV>100 fl组（24.7%对12.9%，P=0.049）。其余指标如年龄、性别、ANC、PLT差异均无统计学意义（P值均>0.05）（表3）。

表3

189例骨髓原始细胞<5% MDS患者中MCV≤100 fl和>100 fl组临床特征比较

临床特征		MCV≤100 fl组（85例）	MCV>100 fl组（104例）	P值
年龄［岁，M（范围）］		55（20～83）	49（16～83）	0.104
男性［例（%）］		56（65.9）	62（59.6）	0.099
HGB［g/L，M（范围）］		90（42～153）	78.5（28～146）	0.015
ANC［×109/L，M（范围）］		1.45（0.19～11.17）	1.15（0.01～6.67）	0.222
PLT［×109/L，M（范围）］		69（2～1 024）	88（11～1 100）	0.099
IPSS-R染色体核型（分4组）［例（%）］				0.272
	很好/好	36（49.3）	53（57.0）
	中等	19（26.0）	28（30.1）
	差	8（11.0）	6（6.5）
	很差	10（13.7）	6（6.5）
IPSS-R染色体核型（分2组）［例（%）］				0.049
	很好/好/中等	55（75.3）	81（87.1）
	差/很差	18（24.7）	12（12.9）
IPSS-R预后分组（分5组）［例（%）］				0.925
	极低危	10（13.7）	3（3.2）
	低危	31（42.5）	46（49.5）
	中危	11（15.1）	34（36.6）
	高危	16（21.9）	5（5.4）
	极高危	5（6.8）	5（5.4）
IPSS-R预后分组（分2组）［例（%）］				0.003
	极低危/低危/中危	52（71.2）	83（89.2）
	高危/极高危	21（28.8）	10（10.8）

注：MDS：骨髓增生异常综合征；MCV：平均红细胞体积；IPSS-R：修订的国际预后积分系统

2．基因突变特征的比较：189例患者平均基因突变数目为0.868个，MCV≤100 fl组高于MCV>100 fl组（0.988个对0.769个，P=0.064）（图2）。常见的基因突变为U2AF1（18.0%）、SF3B1（10.6%）、TET2（9.0%）、ASXL1（7.9%）、TP53（5.8%）、CEBPA（5.3%）、DNMT3A（4.8%）、SETBP1（4.2%）、RUNX1（2.6%）、SRSF2（2.1%）及CBL（2.1%）。MCV≤100 fl患者的SF3B1突变频率显著低于MCV>100 fl的患者（4.7%对15.4%，P=0.018）（图3）。

图2

平均红细胞体积（MCV）分组（≤100 fl、>100 fl）骨髓增生异常综合征患者基因突变数目比较（z=1.853，P=0.064）

图3

189例骨髓原始细胞比例<5%骨髓增生异常综合征患者平均红细胞体积（MCV）分组基因突变频率比较

讨论

MCV升高是MDS患者常见的外周血细胞计数改变指标，存在于约一半骨髓原始细胞<5%的患者及三分之一骨髓原始细胞≥5%的患者中[3]。已有数项研究探索了MCV水平在MDS患者中的预后价值。Wang等[2]报道了MCV≤100 fl为染色体核型异常的MDS患者独立的不良预后因素，Holtan等[8]在对5q-综合征患者行多因素分析中发现，较低的MCV水平为影响OS的独立危险因素。本研究组既往研究也指出MCV为影响MDS患者预后的独立因素[9]。

但上述研究均未纳入基因突变，近年来，随着二代测序技术在临床中的应用，多项研究探索了基因突变在MDS诊断与预后中的价值[10]–[13]。在290例有完整随访资料的患者中，我们发现ASXL1及TP53突变患者的OS期显著缩短，亚组分析中，ASXL1、TET2和PTPN11突变显著影响骨髓原始细胞<5% MDS患者的OS。既往研究亦有报道ASXL1和TP53突变为MDS患者的不良预后因素[10]–[11]，进一步证实了基因突变对MDS患者预后的影响。

单因素分析显示，290例有完整随访资料的患者中MCV ≤100 fl组OS时间较MCV>100 fl组显著缩短，在纳入基因突变及其他临床指标的多因素分析后MCV ≤100 fl则失去预后意义。亚组分析中，在骨髓原始细胞<5%的患者中，MCV ≤100 fl为独立于基因突变及其他临床指标的不良预后因素。既往关于MCV水平在骨髓原始细胞<5% MDS患者中的预后价值尚存在争议。Tennant等[3]认为MCV水平升高是骨髓原始细胞<5%患者预后良好的指标。Matsuda等[14]则认为，单用MCV难以预测不伴有原始细胞增多的MDS患者的预后。本研究在纳入基因突变后与前者结论一致，进一步证实了MCV水平在骨髓原始细胞<5%患者中的独立预后价值。

MCV≤100 fl与骨髓原始细胞<5% MDS患者不良预后相关的原因目前尚不清楚，我们推测可能有以下几点原因：①MCV≤100 fl者存在基因突变数目更多的趋势，目前已有多项研究证实MDS患者基因突变数目越多预后越差[13],[15]，且MCV≤100 fl者SF3B1突变频率显著低于MCV>100 fl组，而既往报道SF3B1突变与良好预后相关[16]；②MCV≤100 fl者IPSS-R高危/极高危组以及染色体核型分级差/很差组比例明显高于MCV>100 fl者，两者均为已知的MDS患者预后不良因素[5]；③MDS为骨髓衰竭性疾病，MCV水平升高提示患者具有较好的骨髓造血代偿功能，因而预后较好[9]。

本研究尚存在以下不足之处：为单中心回顾性研究，且MCV水平与MDS患者预后关联的原因目前尚缺乏基础性研究，仍需前瞻性多中心临床研究及基础研究进一步证实。

综上所述，我们的研究证实MCV≤100 fl是骨髓原始细胞<5%的MDS患者独立于基因突变及其他临床指标的预后危险因素，其作为一项简便易获得的指标可在指导临床决策时起一定参考作用。