Myelodysplastic syndrome: validation of flow cytometry multilineage score system.

OBJECTIVE: To validate multilineage score system correlating results of flow cytometry, cytogenetics, cytomorphology and histology from samples of patients with suspected myelodysplastic syndrome or cytopenia of unknown origin.
METHODS: A retrospective study analyzing laboratory data of 49 patients with suspected myelodysplastic syndrome or cytopenia of unknown origin, carried out between May and September 2017. The inclusion criteria were availability of flow cytometry results, and at least one more method, such as morphology, histology or cytogenetics. Thirty-eight patients were classified as diagnosis of myelodysplastic syndromes, whereas 11 were classified as normal. Patients were evaluated based on score systems, Ogata score and flow cytometry multilineage score.
RESULTS: Comparing the scores obtained in the Ogata score and the multilineage score, it was observed that in four cases the Ogata score was zero or 1 point, while the multilineage score was higher than 3 points. In addition, in 12 cases with Ogata score of 2, the multilineage score was greater than 3.
CONCLUSION: The flow cytometry multilineage score system demonstrated to be more effective in dysplasia analysis, by assessing the erythroid, monocytic, granulocytic and precursor cell lineages, apart from the parameters evaluated by the Ogata score.

INTRODUCTION

Myelodysplastic syndromes (MDS) are hematological neoplasms with clonal alterations of the hematopoietic stem cells of the bone marrow, and mostly diagnosed in elderly patients aged between 70 and 75 years.[1,2]They are characterized by single lineage or multilineage dysplasia, increased risk of evolution into acute leukemia, peripheral blood cytopenia, and hypercellular bone marrow.[1,3-5] The annual incidence of MDS is 2 to 12 cases per 100 thousand individuals, but it increases to 50 in every 100 thousand for those aged 70 years.

Myelodysplastic syndromes progression varies much - sometimes they may present with an indolent course, and in some cases with rapid progression and change into acute leukemia. This varied progression is due to genetic complexity of MDS.[4] There is evidence of mutations in over 50 genes in MDS. Approximately 90% of patients diagnosed with MDS have a mutated gene, with an average of two to three mutations per patient. In MDS, the most commonly found mutations affect ribonucleic acid (RNA) splicing (SF3B1, SRSF2, ZRSR2, U2AF1/2), deoxyribonucleic acid (DNA) methylation (TET2, DNMT3A, IDH1/2), chromatin modification (ASXL1, EZH2)[1,2,7] and the p53 gene.[8,9]

Distinguishing cytopenia related to MDS or non-clonal disease is a complex challenge. Myelodysplastic syndromes diagnosis requires a combination of several methods. The diagnosis is primarily based on cytomorphology and cytogenetics, according to the World Health Organization (WHO) classification of 2017.[7,10,11] According the WHO, the minimum morphological criterion for diagnostic evidence of MDS is the presence of at least 10% of myeloid, erythroid or megakaryoblastic precursor cells, with morphological abnormalities, in combination with chronic peripheral blood cytopenia, when other possible causes have been ruled out.[12] Dysplasia may be accompanied by an increased percentage of myeloblasts in the peripheral blood and/or bone marrow, but the percentage of blasts is always <20%.[7] The karyotype has its own diagnostic, prognostic and therapeutic implication, and it is one of the components of the prognostic scoring systems, including the International Prognostic Scoring System (IPSS) and the Revised International Prognostic Scoring System (R-IPSS). However, a considerable number of patients (40 to 50%) presents with normal or inconclusive karyotype.[6,9] That is why, flow cytometry has recently been aiding in MDS diagnosis, by identifying the expression of aberrant antigens in different hematopoietic lineages, an increase of more immature cells, and alterations in neutrophil granularity.[11,13]

Several phenotypic abnormalities may be found in patients with dysplasia; that is why it is very important to use flow cytometry and scoring systems.[14] The first scoring system with international impact, developed as a triage test, was described in a multicenter study, in 2012, and called the Ogata score. It evaluates bone marrow cells by using four parameters: percentage of precursor myeloid cells; frequency of B lymphoid precursors in CD34+ cells; antigen expression of CD45 in myeloid precursors in relation to the antigen expression of CD45 in lymphocytes; and neutrophil granularity, evaluated by side scatter (SSC), in comparison to the same parameter in the lymphocytes.[14,15]

After this scoring system was published, it was followed by other studies that suggested other markers for dysplasia analysis, but they analyzed a single lineage separately; for instance, the red score, which evaluated the erythroid lineage. The flow cytometry laboratory at Hospital Israelita Albert Einstein developed a multilineage system with 23 parameters to analyze dysplasia in the granulocytic, monocytic, and erythroid lineages.

OBJECTIVE

To evaluate the multilineage scoring system, by comparing its results to the Ogata score, and to correlate the flow cytometry data to cytomorphology, histology, and cytogenetics, demonstrating the agreement percentage of the results.

METHODS

Study design and patient enrolment

This is a retrospective study in which we analyzed the laboratory data of 49 patients with clinical suspicion of MDS or cytopenia of unknown origin, between May and September 2017. The inclusion criteria were suspected MDS or cytopenia of unknown origin, and availability of results from immunophenotyping by flow cytometry and from, at least, another method, including cytomorphology and/or histology and/or cytogenetics. Of the total cohort, 38 patients were diagnosed as MDS based on clinical and laboratorial data and the other 11 were classified as normal.

The total cohort was evaluated by flow cytometry immunophenotyping. We used the Ogata score and the multilineage scoring system, which is being validated in this study.

According to the Research Ethics Committee of Hospital Israelita Albert Einstein, this study was exempt from an ethics evaluation.

Cytomorphology and histology

The BM of patients was evaluated through myelogram and/or biopsy. For the myelogram, we used Leishman stain. Cell count and classification followed the WHO standard. For the bone marrow biopsy, we used hematoxylin and eosin staining, Giemsa stain, silver staining and Masson’s trichrome.

Cytogenetics

We analyzed the karyotypes following the standard procedure of G-banding. Complex karyotypes were defined as those having three or more clonal chromosomal aberrations, and altered karyotypes are those with one to two clonal alterations. The patients were then classified as normal, altered or complex karyotypes.

Flow cytometry

In the 49 cases evaluated, the following markers and fluorescence were used: FITC (CD4, CD16, Kappa), PE (CD8, CD13, CD14, CD105, Lambda), ECD (CD3, CD14, CD38, CD64), PC5.5 (CD33), PC7 (CD20, CD56, CD117), APC (CD34), APC-AF700 (CD10, CD19, CD71), APC-AF750 (CD10, CD11b), PB (CD5, HLA-DR) and KO (CD45). The data were analyzed by the Navios Flow Cytometer and the software Kaluza Ⓡ (Beckman Coulter Ⓡ ). We applied the Ogata score and the multilineage system, which contemplated 23 parameters to analyze dysplasia in the erythroid, monocytic and granulocytic lineages, and precursor cells.

Multilineage system

To evaluate phenotypic dysplasia, a scoring system was developed to assess the erythroid, granulocytic and monocytic lineages and the precursor cells. The parameters analyzed were decrease in the SSC of granulocytes, granulocytic maturation curves (CD13/CD16, CD11b/CD16, CD13/CD11b, CD33/CD10) (Figure 1.1); anomalous expressions of CD7, CD19 or CD56 in the granulocytes; percentage of monocytes; monocytic maturation curve (Figure 1.1); anomalous expression of CD56 or CD19 in the monocytes; erythroid dysplasia evaluated by the coefficient of variation of the antigen expression of CD71 and CD36 (Figure 1.2); increased number of CD34 progenitor cells; decreased B-cell progenitors; increased percentage of myeloblasts; expression of aberrant antigens in CD34 cells, such as CD56, CD7 and CD5 (Figure 1.3); and asynchronous maturation.

Figure 1

Examples of parameters evaluated by the multiline sheet. (1) Maturation curves of granulocytes and monocytes. (A) Normal maturation curve CD11b/CD16. (B) Maturation curve with an increase in myeloid precursors and decrease of the more mature forms. (C) Normal maturation curve of monocytes. (D) Maturation curve with increased number of monoblasts and promonocytes. (2) Evaluation of the erythroid series. (A) Normality standard for the coefficient of variation of CD36. (B) Normality standard for the coefficient of variation of CD71. (C) Coefficient of variation of CD36 above the normalcy values. (3) Parameters for the evaluation of progenitor cells. (A) Normal distribution of the progenitor cells among the myeloblasts and B-cell progenitors. (B) Increase in myeloblasts and decrease in B-cell progenitors. (C) Normalcy with negative expression of CD56 in CD34 cells. (D) Anomalous expression of CD56 in CD34+ cells

RESULTS

Cohort characteristics

We evaluated 49 patients, 32 of whom were female, with a median age of 67.5 years (0.8 to 86 years). Of those patients, 38 were classified as diagnosed as MDS and the other 11, as normal.

Scoring systems: Ogata versus the multilineage system

Table 1 compares the values obtained through the Ogata score and the multilineage system in patients with an MDS diagnosis. Table 2 shows the evaluation of the patients classified as normal.

Table 1

Comparison of the values from the Ogata score and the multilineage scoring system in 38 patients diagnosed as myelodysplastic syndrome

Multilineage system	Ogata score
	0-1	2	3-4
0-1	2 (5.26)	0 (0.00)	0 (0.00)
2	0 (0.00)	0 (0.00)	0 (0.00)
3-5	3 (7.89)	8 (21.05)	6 (15.79)
6-9	1 (2.63)	2 (5.26)	10 (26.32)
≥10	0 (0.00)	1 (2.63)	5 (13.16)
Total	6 (15.79)	11 (28.95)	21 (55.26)

Results expressed as n (%).

Table 2

Comparison between the values from the Ogata score and the multilineage scoring system in 11 patients classified as normal

Multilineage system	Ogata score
	0-1	2	3-4
0-1	6 (54.55)	0 (0.00)	0 (0.00)
2	3 (27.27)	0 (0.00)	0 (0.00)
3-5	0 (0.00)	0 (0.00)	0 (0.00)
6-9	1 (9.09)	0 (0.00)	0 (0.00)
≥10	0 (0.00)	0 (0.00)	0 (0.00)
Total	11 (100.00)	0 (0.00)	0 (0.00)

Results expressed as n (%).

DISCUSSION

Cytomorphology, the gold standard for diagnosis of MDS, showed a good result correlation to flow cytometry as did the histologic analysis through biopsy. This method evaluates bone marrow cellularity and observes morphological alterations suggestive of MDS. The morphology also plays a crucial role in the analysis of megakaryocytes, because flow cytometry cannot assess them satisfactorily in routine diagnostic laboratories. The myelogram is requested in most cases of suspected MDS. Even though the morphological analysis is indispensable for MDS diagnosis, some studies[17,18] showed significant interobserver differences.

The bone marrow analysis through biopsy shows higher sensitivity than the myelogram alone, and it generates additional information about the percentage of blasts and their distribution in the intramedullary space. Bone marrow cellularity, megakaryocytic morphology and fibrosis are important elements revealed by biopsy in MDS. In most cases, an MDS patient’s bone marrow is hypercellular, less frequently normocellular or hypocellular for age.

Histologically, the most aggressive MDS subtypes can be characterized by the presence of aggregates (three to five cells) or clusters (more than five cells) of immature myeloid cells in the bone marrow biopsy, often located in the central part of the bone marrow. In cases with bone marrow hypocellularity, immunohistochemistry is pivotal in the evaluation of dysplasia, since it analyses atypical localization of immature precursors (ALIP), megakaryocytic clustering and dysplasia, and fibrosis.

Alterations in the karyotype are described in the literature as having a 50% frequency. Currently, with the advances of molecular genetics, it is known that somatic mutations in more than 50 genes are identified in 80 to 90% of MDS cases. More often, mutations are observed in genes that encode proteins involved in RNA splicing (SF3B1, SRSF2, U2AF1 and ZRSR2). The implementation of molecular genetics analysis in the routine of laboratories will increase the sensitivity of genetic analysis in MDS.

The analysis of dysplasia through flow cytometry has become a complementary exam in MDS diagnosis. The presence of three or more phenotypic abnormalities distributed in the different lineages increases the evidence of MDS. This method is also able to analyze hypocellular material by capturing a significant number of events and generating valuable diagnostic information. The progressive increase of the scores in scoring systems that evaluate the several lineages allows the suggestion of primary dysplasia. The Ogata score is the most widely used, evaluates four parameters, and its results are determined as follows: a score of 0 or 1 rules out MDS; a score of 2 is inconclusive; and a score of 3 or 4 suggests MDS.

Because the Ogata score analyzes only the precursor cells and the granulocytic lineage, it does not detect erythroid or monocytic dysplasia, as well as other important factors, such as maturation curve of granulocytes. That is why the flow cytometry laboratory at Hospital Israelita Albert Einstein developed a multilineage system, with 23 parameters of dysplasia analysis, including those observed in the Ogata score, the monocytic and erythroid lineages, and other parameters related to the granulocytic lineage and precursor cells.

In the analysis of the 49 patients evaluated through flow cytometry, we observed a higher incidence of alterations in the parameter of the percentage of B-cell progenitors in the Ogata score. However, this parameter is affected by the quality of the sample and its collection, and the quality of its hemodilution.

In the analysis through the multilineage system, the parameters with the highest incidence of alterations were precursor cells (decrease in the percentage of B-cell progenitors – same criterion evaluated by the Ogata score); granulocytic lineage (decrease in SSC); erythroid lineage (alterations in the coefficient of variation of the CD17 expression); and monocytic lineage (percentage of monocytes increased or decreased). The greater number of alterations in the erythroid lineage in the CD71 occurs due to the more intense platelet interference in the coefficient of variation of CD36, often hindering its analysis, depending on the quantity of platelets.

Comparing the scores obtained with the Ogata score and the multilineage system, it was found that, in four cases, the Ogata score was of 0 or 1 point, while the multilineage system indicated a score of >3 points. Moreover, in 12 cases with an Ogata score of 2, the multilineage system showed a score >3.

CONCLUSION

Flow cytometry is a methodology that is available in most laboratories, and it is an important complementary tool for diagnosis of Myelodysplastic syndromes, for presenting high sensitivity in detection of multilineage dysplasia. The integrated analysis of the results between clinical and other laboratory methods provides a precise diagnosis, evaluates prognosis, and enables offering the most adequate treatment. The scoring systems are crucial to guide the analysis of data obtained by cytometry. The Ogata score uses a reduced panel of markers, which makes it easily reproducible in flow cytometry services in routine laboratories. In our study, the multilineage system proved more efficient in the analysis of dysplasia, because it evaluates the erythroid, monocytic and granulocytic lineages and the precursor cells in addition to the parameters assessed by the Ogata score.

INTRODUÇÃO

As síndromes mielodisplásicas (SMD) são neoplasias hematológicas com alterações clonais das células tronco hematopoiéticas da medula óssea, em sua maioria diagnosticada em pacientes idosos entre 70 e 75 anos.[1,2] São caracterizadas por displasia uni ou multilinhagem, risco aumentado de transformação em leucemia aguda, citopenias em sangue periférico e medula óssea hipercelular.[1,3-5]A incidência anual de SMD é de 2 a 12 casos a cada 100 mil pessoas, mas há aumento para 50 a cada 100 mil no grupo de pessoas acima de 70 anos.

Tendo progressão bastante variável, a SMD pode apresentar-se, em alguns pacientes, de forma indolente, enquanto em outros casos há progressão rápida e transformação para leucemia aguda. Tal variância de progressão é reflexo da complexidade genética das SMD. Existem evidências de mutações em mais de 50 genes na SMD. Aproximadamente 90% dos pacientes diagnosticados com SMD têm um gene mutado, com média de duas ou três mutações por paciente. Na SMD, as mutações mais comumente encontradas afetam o splicing de ácido ribonucleico (RNA) (SF3B1, SRSF2, ZRSR2, U2AF1/2), a metilação de ácido desoxirribonucleico (DNA) (TET2, DNMT3A, IDH1/2), a modificação de cromatina (ASXL1, EZH2)[1,2,7] e o gene p53.[8,9]

A diferenciação entre citopenias por SMD e citopenia por doença não clonal é um desafio complexo. O diagnóstico da SMD necessita da integração entre diversas metodologias. A citomorfologia e a citogenética são, de acordo com a classificação da Organização Mundial da Saúde (OMS), de 2017, a base do diagnóstico.[7,10,11] De acordo com a OMS, o critério morfológico mínimo para evidência diagnóstica de SMD é a presença de, pelo menos, 10% de células precursoras mieloides, eritroides ou megacarioblásticas, com anormalidades morfológicas, aliadas à citopenia crônica em sangue periférico e descartadas outras causas. A displasia pode ser acompanhada de aumento da percentagem de mieloblastos no sangue periférico e/ou medula óssea, porém a percentagem de blastos é sempre <20%. O cariótipo, por sua vez, tem implicação diagnóstica, prognóstica e terapêutica, e é um dos constituintes dos sistemas de escore prognóstico, sendo eles o International Prognostic Scoring System (IPSS) e o Revised International Prognostic Scoring System (R-IPSS). Por outro lado, um número considerável de pacientes (40 a 50%) tem cariótipo normal ou inconclusivo.[6,9]Por isso, mais recentemente, a citometria de fluxo vem auxiliando no diagnóstico da SMD, identificando a expressão de antígenos aberrantes em diferentes linhagens hematopoéticas e o aumento da quantidade de células mais imaturas, além de alterações de granulosidade neutrofílica.[11,13]

Diversas anormalidades fenotípicas podem ser encontradas em pacientes com displasia – por isso, é de grande importância a utilização da citometria de fluxo e dos sistemas de escore.[14] O primeiro escore com impacto internacional, que foi desenvolvido como teste de triagem, foi descrito em 2012, em estudo multicêntrico, ficando conhecido como escore de Ogata. Este avalia as células da medula óssea utilizando quatro parâmetros: percentagem de precursores mieloides; frequência de precursores linfoides B nas células CD34+; expressão antigênica de CD45 em precursores mieloides em relação à expressão antigênica de CD45 em linfócitos; e granularidade de neutrófilos, avaliada pelo parâmetro de side scatter (SSC), em comparação ao mesmo parâmetro nos linfócitos.[14,15]

Após a publicação desse sistema de escore, foram publicados outros trabalhos, sugerindo outros marcadores para análise de displasia, porém analisando uma linhagem única separadamente, como, por exemplo o red score que avalia a linhagem eritroide.[16]O laboratório de citometria de fluxo do Hospital Israelita Albert Einstein, por sua vez, desenvolveu uma ficha multilinhagem, com 23 parâmetros para análise de displasia na linhagem granulocítica, monocítica e eritroide.

OBJETIVO

Avaliar a ficha de escore multilinhagem, comparando seus resultados com o escore de Ogata, além de correlacionar os dados de citometria de fluxo com os de citomorfologia, histologia e citogenética, demonstrando seus percentuais de concordância de resultados.

MÉTODOS

Desenho do estudo e inclusão de pacientes

Estudo retrospectivo de análise de dados laboratoriais de 49 pacientes com suspeita clínica de SMD ou citopenias a esclarecer, entre maio e setembro de 2017. Os critérios de inclusão foram suspeita de SMD ou com citopenias a esclarecer, e disponibilidade de resultados de imunofenotipagem por citometria de fluxo e de, pelo menos, outra metodologia, sendo citomorfologia, e/ou histologia e/ou citogenética. Da coorte total, 38 pacientes foram diagnosticamos com SMD por dados clínicos e laboratoriais, sendo os outros 11 classificados como normais.

A coorte total foi avaliada por imunofenotipagem por citometria de fluxo. Foram aplicados o escore de Ogata e a ficha de escore multilinhagem, a ser validada no presente estudo.

De acordo com parecer do Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Israelita Albert Einstein, o presente estudo foi isento de avaliação ética.

Citomorfologia e histologia

A medula óssea dos pacientes foi avaliada por mielograma e/ou biópsia. No mielograma, utilizou-se coloração de Leishman. A contagem e a classificação das células seguiram o padrão da OMS. Na biópsia de medula óssea, utilizou-se a coloração hematoxilina-eosina, Giemsa, impregnação pela prata e tricômico de Masson.

Citogenética

Foram analisados os cariótipos seguindo procedimento padrão de bandamento G. Cariótipos complexos foram definidos como tendo três ou mais aberrações cromossômicas clonais, enquanto os cariótipos alterados têm uma a duas alterações clonais. Dessa forma, os pacientes foram classificados como cariótipo normal, alterado ou complexo.

Citometria de fluxo

Nos 49 casos avaliados, foram utilizados os seguintes marcadores e fluorescências: FITC (CD4, CD16, Kappa), PE (CD8, CD13, CD14, CD105, Lambda), ECD (CD3, CD14, CD38, CD64), PC5.5 (CD33), PC7 (CD20, CD56, CD117), APC (CD34), APC-AF700 (CD10, CD19, CD71), APC-AF750 (CD10, CD11b), PB (CD5, HLA-DR) e KO (CD45). Os dados foram analisados em o citômetro de fluxo Navios Flow Cytometer e software KaluzaⓇ (Beckman CoulterⓇ). Foram aplicados o escore de Ogata e a ficha multilinhagem, que contemplou 23 parâmetros para análise de displasia nas linhagens eritroide, monocítica e granulocítica, e células precursoras.

Ficha multilinhagem

Para avaliação de displasia fenotípica, foi desenvolvida uma ficha de escore que avalia as linhagens eritroide, granulocítica e monocítica, além das células precursoras. Os parâmetros analisados foram diminuição do SSC dos granulócitos, curvas de maturação granulocíticas (CD13/CD16, CD11b/CD16, CD13/CD11b, CD33/CD10) (Figura 1.1), expressões anômalas de CD7, CD19 ou CD56 nos granulócitos, percentagem de monócitos, curva de maturação monocítica (Figura 1.1), expressões anômalas de CD56, ou CD19 nos monócitos, displasia eritroide avaliada pelo coeficiente de variação da expressão antigênica de CD71 e CD36 (Figura 1.2), aumento de células progenitoras CD34, diminuição dos progenitores B, aumento da percentagem de mieloblastos, antígenos aberrantes expressos nas células CD34, como CD56, CD7 e CD5 (Figura 1.3), e assincronismo maturativo.

Figura 1

Exemplos de parâmetros avaliados pela ficha multilinhagem. (1) Curvas de maturação granulocítica e monocítica. (A) Curva de maturação normal CD11b/CD16. (B) Curva de maturação com aumento de precursores mieloides e diminuição das formas mais maduras. (C) Curva de maturação monocítica normal. (D) Curva de maturação com aumento de monoblastos e promonócito. (2) Avaliação da série eritróide. (A) Padrão de normalidade para o coeficiente de variação do CD36. (B) Padrão de normalidade para o coeficiente de variação do CD71. (C) Coeficiente de variação do CD36 acima dos valores de normalidade. (D) Coeficiente de variação do CD71 acima dos valores de normalidade. (3) Parâmetros de avaliação das células progenitoras. (A) Distribuição normal das células progenitoras entre mieloblastos e células progenitoras B. (B) Aumento de mieloblastos e diminuição de células progenitoras B. (C) Normalidade com negatividade de expressão do CD56 nas células CD34. (D) Expressão anômala de CD56 em células CD34+

RESULTADOS

Caracterização da coortes

Foram avaliados 49 pacientes, sendo 32 do sexo feminino, com mediana de idade de 67,5 anos (0,8 a 86 anos). Destes, 38 pacientes foram classificados como diagnosticados com SMD, e os outros 11 classificados como normais.

Sistemas de escore: Ogata versus ficha multilinhagem

Na tabela 1, foram comparados os valores obtidos no escore de Ogata e na ficha de escore multilinhagem nos pacientes com diagnóstico de SMD, enquanto, na tabela 2, foram avaliados os pacientes classificados como normais.

Tabela 1

Comparação das pontuações do escore de Ogata e da ficha de escore multilinhagem em 38 pacientes com diagnóstico de síndrome mielodisplásica

Ficha multilinhagem	Escore de Ogata
	0-1	2	3-4
0-1	2 (5,26)	0 (0,00)	0 (0,00)
2	0 (0,00)	0 (0,00)	0 (0,00)
3-5	3 (7,89)	8 (21,05)	6 (15,79)
6-9	1 (2,63)	2 (5,26)	10 (26,32)
≥10	0 (0,00)	1 (2,63)	5 (13,16)
Total	6 (15,79)	11 (28,95)	21 (55,26)

Resultados expressos em n (%).

Tabela 2

Comparação das pontuações do escore de Ogata e da ficha de escore multilinhagem em 11 pacientes classificados como normais

Ficha multilinhagem	Escore de Ogata
	0-1	2	3-4
0-1	6 (54,55)	0 (0,00)	0 (0,00)
2	3 (27,27)	0 (0,00)	0 (0,00)
3-5	0 (0,00)	0 (0,00)	0 (0,00)
6-9	1 (9,09)	0 (0,00)	0 (0,00)
≥10	0 (0,00)	0 (0,00)	0 (0,00)
Total	11 (100,00)	0 (0,00)	0 (0,00)

Resultados expressos em n (%).

DISCUSSÃO

A citomorfologia, padrão-ouro no diagnóstico da SMD, mostrou ter boa correlação de resultados com a citometria de fluxo, assim como a análise histológica por biópsia. Essa metodologia avalia a celularidade medular, além de observar alterações morfológicas sugestivas de SMD. Ainda, a morfologia tem papel fundamental na análise dos megacariócitos, uma vez que a citometria de fluxo não consegue avalia-los de forma satisfatória em laboratórios de rotina de diagnóstico. O mielograma é requisitado na maioria dos casos com suspeita de SMD. Mesmo que a análise morfológica seja indispensável para o diagnóstico de SMD, alguns trabalhos,[17,18] mostram as diferenças significativas interobservador.

A análise medular por biópsia aumenta a sensibilidade quando comparada à análise somente do mielograma, além de gerar informações adicionais sobre a percentagem de blastos e sua distribuição do espaço intramedular. A celularidade medular, a morfologia megacariocítica e a fibrose são elementos importantes revelados pela biópsia em SMD. Na maioria dos casos, a medula óssea do paciente com SMD é hipercelular, menos frequentemente normocelular ou hipocelular para a idade.

Histologicamente, subtipos mais agressivos de SMD podem ser caracterizados pela presença de agregados (três a cinco células) ou clusters (mais de cinco células) de células imaturas mieloides em biópsia medular, frequentemente localizados na parte central da medula óssea. Em casos nos quais há hipocelularidade medular, a imuno-histoquímica tem papel importante na avaliação de displasia, analisando células precursoras em localização atípica (ALIP - atypical localization of immature precursors), agrupamento e displasia megacariocítica, e fibrose.

Alterações no cariótipo são descritas na literatura com frequência de 50%. Atualmente, com os avanços da genética molecular, já se sabe que mutações somáticas em mais de 50 genes são identificadas em 80 a 90% dos casos de SMD. Mais frequentemente, observam-se mutações em genes que codificam proteínas envolvidas no splicing de RNA (SF3B1, SRSF2, U2AF1 e ZRSR2). A futura implementação da análise da genética molecular em laboratórios de rotina aumentará a sensibilidade da análise genética em SMD.

A análise de displasia por citometria de fluxo vem se tornando exame complementar no diagnóstico da SMD. A presença de três ou mais anormalidades fenotípicas distribuídas nas diferentes linhagens aumenta a evidência de SMD. Essa metodologia é ainda capaz de analisar material hipocelular, com captação de um número de eventos significativo, gerando informações de valor diagnóstico. O aumento progressivo da pontuação dos sistemas de escore, avaliando as diversas linhagens, permite sugerir displasia primária. O escore de Ogata é o mais utilizado deles, com avaliação de quatro parâmetros, no qual pontuação zero ou 1 descartam SMD, 2 é indeterminado, e 3 ou 4 sugerem a doença.

Por analisar apenas as células precursoras e a linhagem granulocítica, o escore de Ogata não detecta displasia eritroide e monocítica, além de outros parâmetros importantes, como a curva de maturação dos granulócitos. Por esse fato, o laboratório de Citometria de Fluxo do Hospital Israelita Albert Einstein desenvolveu uma ficha multilinhagem, com 23 parâmetros de análise de displasia, incluindo os observados no escore de Ogata, a análise da linhagem monocítica e eritroide, e outros parâmetros relacionados à linhagem granulocítica e às células precursoras.

Na análise dos 49 pacientes avaliados por citometria de fluxo, observou-se maior incidência de alterações no parâmetro de percentagem de progenitores B no escore de Ogata. Esse parâmetro, por sua vez, é afetado pela qualidade da amostra e da coleta, bem como de sua hemodiluição.

Na análise pela ficha multilinhagem, os parâmetros com maior incidência de alterações foram células precursoras (diminuição da percentagem de progenitores B – mesmo critério avaliado pelo escore de Ogata); linhagem granulocítica (diminuição do SSC); linhagem eritroide (alteração do coeficiente de variação da expressão de CD71); e linhagem monocítica (percentagem de monócitos aumentada ou diminuída). A superioridade de alterações na linhagem eritroide no CD71 é dada pela interferência plaquetária mais intensa no coeficiente de variação do CD36, prejudicando, por vezes, sua análise, a depender da quantidade de plaquetas.

Comparando as pontuações obtidas no escore de Ogata e na ficha multilinhagem, observou-se que, em quatro casos, o escore de Ogata foi zero ou 1 ponto, enquanto pela ficha multilinhagem a pontuação foi superior a 3 pontos. Além disso, em 12 casos com escore de Ogata 2, a pontuação pela ficha multilinhagem foi superior a 3.

CONCLUSÃO

A citometria de fluxo é uma metodologia disponível na maioria dos laboratórios, com importância complementar no diagnóstico da síndrome mielodisplásica, apresentando alta sensibilidade na detecção de displasia multilinhagem. A análise integrada dos resultados entre a clínica e outras metodologias laboratoriais fornece um preciso diagnóstico, avalia o prognóstico e permite o tratamento mais adequado. Os sistemas de escore, por sua vez, são importantes, para direcionar a análise dos dados obtidos por citometria. O escore de Ogata utiliza um painel de marcadores reduzido, sendo possível ser reproduzido e aplicado em serviços de citometria de fluxo em laboratórios na rotina. Em nosso estudo, a ficha multilinhagem demonstrou ser mais eficaz na análise de displasia, por avaliar as linhagens eritroide, monocítica, granulocítica e células precursoras, além dos parâmetros avaliados no Ogata.