[The clinical observation of serum specific biomarkers in patients with chronic graft-versus-host disease].

Objective: Chronic graft-versus-host disease (cGVHD) is a major long-term complication after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT) . It is important to study the changes of serum biomarkers expression in patients for early diagnosis and treatment.
Methods: The expression levels of five serum protein markers (IL-1b, IL-16, CXCL9, CCL19, CCL17) in patients with or without cGVHD after allo-HSCT were detected by liquid suspension microarray.
Results: Compared with the control group without cGVHD, the expression levels of CXCL9 and CCL17 in serum of patients with cGVHD were significantly increased (P<0.05) . CCL17 was correlated with the severity of cGVHD (P<0.001) . CXCL9 was significantly increased in the serum of patients with skin lesion (P<0.01) , and CCL17 was significantly expressed in cGVHD patients with liver as the target organ (P<0.01) .
Conclusion: The combination of CXCL9 and CCL17 can be used as serum biomarkers of cGVHD, which has certain reference value in assisting the diagnosis and evaluation of cGVHD severity.

异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）是根治血液系统疾病的最佳手段之一，移植物抗宿主病（GVHD）、重症感染和复发是决定移植成败的主要并发症[1]。慢性移植物抗宿主病（cGVHD）是移植100 d后发生的远期并发症。cGVHD是一种具有类似于自身免疫和其他免疫障碍临床表现的综合征，包括硬皮病、干燥综合征、原发性胆汁性肝硬化、闭塞性细支气管炎、免疫相关细胞减少、慢性免疫缺陷等，是严重影响allo-HSCT患者生存质量和长期生存的关键因素之一[2]–[3]。

cGVHD的病理生理包括炎症、细胞免疫、体液免疫和纤维化，血清生物学标志物筛查是一种简便的早期诊断的重要手段，在炎症、细胞免疫及体液免疫中有重要意义，有利于进一步了解GVHD的发病机制，促进GVHD治疗手段的研发。以往研究显示，基质金属蛋白酶3（MMP3）与闭塞性细支气管炎相关[4]。CCL15（小鼠CCL9的人类同系物）在cGVHD患者的血浆中表达明显增高，与移植后非复发死亡相关[5]，但其特异性和灵敏度尚不能满足临床需求，多为单一的特异性标志物，受干扰影响大，因此寻找新的血清生物学标志物具有重要的临床价值。本研究通过联合检测多个血清蛋白标志物表达，筛选可能对cGVHD辅助诊疗有价值的血清生物学标志物组合。

病例与方法

1．病例：本研究纳入2014年11月至2019年1月在陆军军医大学新桥医院血液科接受allo-HSCT的90例患者，其中30例发生cGVHD（cGVHD组），60例未发生cGVHD（对照组）。cGVHD组纳入标准：临床或活检证实为cGVHD，无慢性/活动性感染，无基础疾病进展复发。对照组纳入标准：移植100 d后基础疾病稳定、无慢性/活动性感染。cGVHD组和对照组患者按基本特征进行分组（表1），并按2014年美国NIH慢性GVHD的全局评分法[6]分为轻、中、重度。

表1

90例接受异基因造血干细胞移植患者的一般资料和移植特征

指标	慢性GVHD组（30例）	对照组（60例）
患者年龄［岁，M（范围）］	31（4～60）	33（15～56）
患者性别［例（%）］
女	10（33.0）	22（36.7）
男	20（67.0）	38（63.3）
供者年龄［岁，M（范围）］	35（14～61）	37（16～58）
原发病［例（%）］
AML	12（40.0）	26（43.3）
ALL	8（27.0）	20（33.3）
SAA	2（7.0）	6（10.0）
MDS	3（10.0）	5（8.3）
地中海贫血	1（3.0）	0（0）
淋巴瘤	1（3.3）	1（1.7）
CML	2（6.7）	2（3.3）
PNH	1（3.3）	0（0）
移植方式
同胞全相合	17（56.7）	38（63.3）
其他	13（43.3）	22（36.7）
造血干细胞来源［例（%）］
外周血	17（56.7）	36（60.0）
外周血+骨髓	13（43.3）	24（40.0）
预处理方案［例（%）］
清髓	20（66.7）	28（46.7）
减低剂量	10（33.3）	32（53.3）
预处理方案含ATG［例（%）］
是	22（73.3）	35（58.3）
否	8（26.7）	25（41.7）
GVHD预防方案［例（%）］
环孢素A +霉酚酸酯+甲氨蝶呤	17（56.7）	38（63.3）
他克莫司+霉酚酸酯+甲氨蝶呤	13（43.3）	22（36.7）
慢性GVHD分度［例（%）］
轻度	8（26.7）	0（0）
中度	8（26.7）	0（0）
重度	14（46.7）	0（0）

注：AML：急性髓系白血病；ALL：急性淋巴细胞白血病；SAA：重型再生障碍性贫血；MDS：骨髓增生异常综合征；CML：慢性髓系白血病；PNH：阵发性睡眠性血红蛋白尿症；ATG：抗胸腺细胞球蛋白

2．cGVHD相关血清蛋白标志物IL-1b、IL-16、CXCL9、CCL19、CCL17检测：cGVHD组患者于cGVHD发生时且未进行干预时、cGVHD发病高峰时（按2014年美国NIH诊断cGVHD全局评分最高时）及治疗后cGVHD下降一个危险程度时采集外周血标本，对照组于+100 d至移植后2年每8周采集1次血清标本。应用德国美天旎公司5种血清蛋白标志物试剂盒，采用美国BIO-RAD公司的Bio-Plex液相悬浮芯片技术进行IL-1b、IL-16、CXCL9、CCL19、CCL17检测。

3．统计学处理：采用SPSS17.0软件进行数据分析，经正态分布检验后，两组之间采用t检验，三组之间采用ANOVA方法进行分析，组间两两比较采用LSD法多重检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1．cGVHD组与对照组血清蛋白标志物表达水平：cGVHD组患者血清CXCL9、CCL17表达水平高于对照组（P<0.05），两组IL-1b、IL-16、CCL19表达差异无统计学意义（表2）。

表2

cGVHD组和对照组患者血清蛋白标志物表达水平（ng/L, ±s）

组别	例数	IL-1b	IL-16	CXCL9	CCL19	CCL17
cGVHD组	30	52.11±14.20	933.3±171.9	12 765±2 026	193.6±28.2	333.2±47.4
对照组	60	31.36±2.94	327.3±41.0	4 769±389	149.6±26.1	159.3±19.0
P值		0.067	0.088	0.003	0.420	0.018

注：cGVHD：慢性移植物抗宿主病

2．不同严重程度cGVHD患者血清蛋白标志物水平：30例cGVHD患者中，轻、中、重度cGVHD分别为8、8、14例。与轻、中度cGVHD比较，CCL17在重度cGVHD患者的血清中表达水平显著增高（P<0.001）（表3），可作为预测cGVHD严重程度的特异性血清标志物。

表3

轻度、中度、重度cGVHD患者血清蛋白标志物表达水平（ng/L，±s）

组别	例数	IL-1b	IL-16	CXCL9	CCL19	CCL17
轻度cGVHD组	8	2.69±0.64	299±144	39 315±938	264.9±49.9	180.7±134.5
中度cGVHD组	8	12.39±9.27	1 257±806	2 986±399	144.7±22.6	207.8±250.3
重度cGVHD组	14	19.83±15.37	1 726±643	10 720±2 367	208.4±55.5	575.2±418.0ab

注：与轻度cGVHD组比较，aP<0.001；与中度cGVHD组比较，bP<0.001

3．不同靶器官cGVHD患者血清蛋白标志物水平：将cGVHD患者的血清样本按2014版NIH共识，将靶器官分为皮肤、口腔、眼睛、胃肠道、肝脏、肺、关节和筋膜、生殖道。其中眼及生殖器官由专科医生评估。仅有皮肤受损的cGVHD患者15例（皮肤cGVHD组）、其他靶器官受损患者15例（非皮肤cGVHD组）、对照组（60例）CXCL9表达水平分别为（11 722±2 688）、（3 550±554）、（4 356±806）ng/L（P<0.01）。肝脏cGVHD组（10例）、非肝脏cGVHD组（20例）、对照组（60例）CCL17水平分别为（361±86）、（166±29）、（156±10）ng/L（P<0.01）。以上结果提示：CXCL9可作为皮肤cGVHD患者的特异性血清生物学标志物，CCL17可作为肝脏cGVHD患者的特异性血清生物学标志物。

讨论

cGVHD是allo-HSCT后的严重并发症，发生率为30%~70%，是allo-HSCT患者远期非复发死亡的重要原因之一[7]。其中重度cGVHD严重影响患者的生存质量，所以早期诊断和治疗对于cGVHD的缓解十分重要。目前临床上尚无统一的预判标准。我们进行该研究的目的是希望找到一项灵敏快速无创，且对临床诊疗cGVHD有价值的血清特异性标志物。液相悬浮芯片技术是一类新型的生物芯片技术平台，其原理是在不同荧光编码的微球上进行抗原-抗体、酶-底物、配体-受体的结合反应及核酸杂交反应，通过红、绿两束激光分别检测微球编码和报告荧光来达到定性及定量的目的。不同反应孔里不同检测可同时混合进行。所以相较于酶联免疫吸附法（Elisa法）、蛋白芯片法等技术，液相悬浮芯片法操作基本达到自动化，具有高通量、高灵敏、速度快、重复性高的优点。

本研究筛选的5种血清蛋白标志物是通过检索国内外新近的文献确定的。白细胞介素家族是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子，在免疫细胞的成熟、活化、增殖和调节等过程中发挥重要作用。趋化因子是一类小分子细胞因子家族蛋白，与细胞表面的相应受体通过G蛋白偶联的方式进行结合而发挥作用[8]。趋化因子可以直接介导细胞的迁移，还可以诱导和趋化T细胞、B细胞分别进入各自的特定微环境内，具有定向趋向作用，是免疫系统的重要信使分子和组织者[9]。目前的报道多是单一的血清蛋白标志物来预测和诊断cGVHD的可能发生，特异性低，重复性差，本研究的目的是想找到临床适用的标志物组合，通过联合检测上述血清蛋白标志物，提高特异性，期望能找到针对cGVHD的特异性生物学标志物，并提示各种血清蛋白标志物在cGVHD发生发展过程中所起的作用。

在本研究中，我们发现cGVHD患者血清CXCL9、CCL17表达水平显著增高，CCL17同时在重度cGVHD的患者血清中表达水平增高。CXCL9在皮肤为靶器官的cGVHD患者中表达水平增高，而CCL17在肝脏为靶器官表现的cGVHD患者中表达水平增高，所以推测CXCL9、CCL17两种血清蛋白标志物联合可以作为诊断cGVHD及预见cGVHD严重程度的特异性血清标志物可能。其中CXCL9的表达水平增高表明皮肤为靶器官的cGVHD的可能性大。CCL17的表达水平增高提示肝脏重度cGVHD发生的可能性较大，可在临床应用中供临床医师鉴别诊断、处置或及时更换二线治疗作为一种参考。

cGVHD的发生机制复杂，目前认为与移植后胸腺损伤、体内细胞因子失调、T细胞比例失衡、B细胞合成针对受者自身抗体损害等可能相关，最终导致靶器官的损害[10]。T细胞导致cGVHD发生的机制中主要是指Th1/Th2、Th1/Th17比例失衡[11]，以及Treg细胞数量减少有关。有实验发现在没有发生和轻度的cGVHD患者中Treg细胞数量增多，相反的中重度cGVHD患者中Treg数量减少[12]。Treg细胞具有直接抑制分泌免疫抑制因子、减少效应T细胞等重要功能，从而可以达到维持免疫稳态的结果，所以Treg细胞的失调被认为与cGVHD发生发展相关[13]。还有研究发现cGVHD患者中能检测到抗自身或异体的抗体，以及在cGVHD患者中发现免疫复合物的存在，都提示B细胞也参与了cGVHD的病理过程[14]。本研究发现的两个比较有临床价值的血清蛋白标志物CXCL9、CCL17都属于趋化因子家族。趋化因子与趋化因子受体结合，在生理、病理条件下都发挥着重要的功能和作用[15]。

CXCR3（趋化因子受体3）是目前已知的CXCL9的唯一受体，有研究发现在人与小鼠的自身免疫性相关疾病中，CXCL9与CXCR3两者相结合后，可促进淋巴细胞向炎症组织迁移[16]，从而导致免疫疾病的发生发展。Croudace等[17]研究发现皮肤cGVHD患者血清CXCL9-CXCR3浓度增高。在小鼠硬皮病GVHD模型中，也发现了CXCL9高表达[18]，与本研究结果一致。有研究发现CXCR3在Th1细胞上高表达，是进入炎症组织的关键因素[19]，所以CXCL9表达增高后，与CXCR3的结合可导致cGVHD的发生。Th1/Th17比例失衡也是目前认为cGVHD发生的机制之一，在小鼠的狼疮性肾炎模型，类似于人类的系统性红斑狼疮模型中发现，CXCR3表达阴性的小鼠，Th1和Th17细胞数量均减少，导致募集的T细胞减少，从而可以改善肾炎的发展，减少肾小球组织的损害。表明我们可以通过阻断CXCR3与CXCL9结合来延缓cGVHD的进展，是一个潜在的治疗靶点。

CCL17又称胸腺活化调节趋化因子（Thymus and activation-regulated chemokine, TARC），也是趋化因子家族成员之一，在胸腺中持续表达，在皮肤、腺体的上皮细胞中表达，可被分泌到细胞外[20]，然后主要通过与趋化因子受体4（CCR4）结合发挥生物学效应。cGVHD的发病机制与胸腺损伤后的T细胞阴性选择有关。cGVHD患者胸腺损伤后，CCL17表达增高，可诱导记忆性T细胞的产生，使淋巴细胞向炎症部位迁移[21]，导致cGVHD的发生。还有研究发现CCL17能特异性趋化Th2细胞向炎症部位迁移，活化的Th2细胞又可以抑制Th1细胞的活化，从而发挥免疫调节作用，加速cGVHD的发展。另外的研究中还发现，在GVHD与没有GVHD的患者中，CCL17的mRNA上调，然后通过间充质干细胞（MSC）治疗GVHD好转后，CCL17的mRNA表达降低[22]，表明CCL17与cGVHD的发生发展相关。Kusumoto等[23]研究发现CCR4及其配体（CCL17）在各种皮肤的免疫疾病中，对记忆T细胞的募集起重要的作用，从而使CCL17在皮肤cGVHD中表达水平有差异。本研究不仅发现CCL17在cGVHD的患者血清中表达显著增高，而且在重度cGVHD患者中表达存在显著差异，进一步证实CCL17可作为cGVHD的特异性生物标志物，有助于判断疾病的严重程度及预后。下一步可通过研究CCL17-CCR4结合的作用机制，为临床上预防及治疗cGVHD提供新的策略。但是目前的研究结果显示，CCL17在皮肤cGVHD的患者中表达水平增高，我们的研究结果是在肝脏cGVHD表达有差异，可能是因为CCL17在腺体中的表达相关，后期可进一步深入研究。

在临床中，单个血清蛋白标志物检测价值有限，用血清蛋白标志物组合进行综合判断可能更有价值。我们发现CXCL9、CCL17在cGVHD发生发展、严重程度和不同靶器官表达相关，有一定的特异性，可以组成一个简易的检测组合用于辅助cGVHD的诊断，以及预测重度GVHD的发生，以便进行早期干预。下一步将开展多中心临床研究，扩大标本量继续进行临床验证。