[Characteristic and prognostic significance of leukemia stem cells associated antigens expressions in t (8;21) acute myeloid leukemia].

Objective: To investigate the characteristic and prognostic significance of leukemia stem cells associated antigens expressions including CD34, CD38, CD123, CD96 and TIM-3 in t (8;21) AML.
Methods: Bone marrow samples of 47 t (8;21) AML patients were collected at diagnosis from October 2015 to April 2018 in Peking University Peoples' Hospital, then flow cytometry method was performed to detect the expression frequencies of CD34, CD38, CD123, CD96 and TIM-3 to analyze the relationship between leukemia stem cells associated antigens expressions and relapse.
Results: Of 47 t (8;21) AML patients tested, the median percentages of CD34(+)CD38(-), CD34(+) CD38(-)CD123(+), CD34(+)CD38(-) CD96(+) and CD34(+) CD38(-) TIM-3(+) cells among nucleated cells were 2.37%, 0.24%, 0.27% and 0.06%, respectively. All the frequencies of CD34(+)CD38(-), CD34(+)CD38(-)CD123(+), CD34(+)CD38(-)CD96(+) and CD34(+) CD38(-)TIM-3(+) cells had no impact on the achievement of CR after the first course of induction. All higher frequencies of CD34(+)CD38(-), CD34(+)CD38(-)CD123(+), CD34(+)CD38(-)CD96(+) cells were related to higher 2-year CIR rate. Whereas, the frequency of CD34(+) CD38(-) TIM-3(+) cells had no impact on CIR rate. Both high frequency of CD34(+) CD38(-) cells and the high level of minimal residual diseases (patients with <3-log reduction in the RUNX1-RUNX1T1 transcript level after the second consolidation therapy) were independent poor prognostic factors of CIR[P=0.025, HR=6.9 (95%CI 1.3-37.4) ; P=0.031, HR=11.1 (95%CI 1.2-99.2) ].
Conclusion: Different leukemia stem cells associated antigens had distinct prognostic significance in t (8;21) AML. High frequencies of CD34(+) CD38(-), CD34(+) CD38(-) CD123(+) and CD34(+)CD38(-)CD96(+) cells at diagnosis predicted relapse in patients with t (8;21) AML.

急性髓系白血病（AML）是常见的造血系统的恶性肿瘤。异种鼠移植模型证实，白血病干细胞（LSC）具有自我更新能力，能成功移植并重建人白血病[1]。LSC还是AML复发的根源[1]–[2]。目前一般认为CD34+CD38−是LSC的免疫表型特征[3]–[5]，此外，CD123、CD96和TIM-3亦被证实是LSC抗原标志[6]–[11]。临床研究显示，CD34+CD38−细胞群高比例与AML预后不良相关[12]–[13]。亦有一些研究结果提示CD123、CD96及TIM-3高表达可能是AML的预后不良因素[14]–[16]。

t（8；21）见于10%~15%的AML患者中，尽管属于低危核型，但仍有约40%的患者复发[17]，因此寻找预后指标对其进行进一步危险分层以指导临床治疗显得尤为重要。目前有关LSC相关抗原预后意义的研究多以AML整体为目标，其在t（8；21）AML中的表达及预后意义尚不清楚。本研究通过流式细胞术（FCM）检测47例初诊t（8；21）AML患者的LSC相关抗原CD34、CD38、CD123、CD96和TIM-3，研究其表达特点及对复发的影响。

病例与方法

1．病例资料：遵照医学伦理学标准，通过北京大学人民医院伦理委员会审查，经患者本人知情同意，收集本院2015年10月至2018年4月的47例初诊t（8；21）AML患者的新鲜骨髓标本，依据细胞形态学、免疫学、遗传学及分子学（MICM）分型确诊。男24例，女23例，中位年龄41（15~69）岁。病例随访截止时间为2018年12月，中位随访13（1~32）个月。

2．治疗方案：47例患者均在本院接受标准剂量IA、DA或HAA方案诱导化疗，44例患者在达到完全缓解（CR）之后接受了2~6个疗程以阿糖胞苷为基础的巩固治疗，其中31例患者仅接受了化疗，13例患者化疗1~5个疗程后在CR状态下接受异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）（单倍型移植7例，全相合移植6例）。

3．试剂与仪器：FACS™裂解液为美国Becton Dickinson公司产品；单克隆抗体CD45-V500、CD34- PerCP-Cy5.5、CD38-V450、CD3、CD14为美国Becton Dickinson公司产品，TIM-3-APC、CD96-PE、CD123-PE-Cy7、CD16、CD20、CD36为美国BioLegend公司产品，Lineage-APC-H7/Cy7由CD3、CD14、CD16、CD20和CD36组成（简称为Lin）；FACS Canto Ⅱ型流式细胞仪为美国Becton Dickinson公司产品；Kaluza流式分析软件为美国Beckman Coulter公司产品。

4．检测方法：采集新鲜骨髓样本后进行细胞计数，每管加入2×106细胞，然后加入7色荧光素标记的单克隆抗体CD45、CD34、CD38、Lin、CD123、CD96和TIM-3充分混匀，室温避光孵育15 min，加入1×FACS™裂解液，室温避光静置15 min，溶血后300×g离心5 min，弃上清，用含有0.1% NaN3和1% BSA的PBS洗液300×g离心洗涤5 min，弃上清，加PBS缓冲液300 µl，上流式细胞仪检测，获取1×106个细胞。设门方式如图1所示，先以FSC-H/FSC-A设门去除双连体，SSC-A/FSC-A设门去除细胞碎片和非特异性细胞，界定有核细胞；再以SSC-A/Lin设门在有核细胞中界定Lin−细胞群（图1A），随后在Lin−细胞群中以CD45/SSC-A设门界定出CD45dim/SSClow细胞群即为Blast细胞群（图1B），在Blast细胞中以CD34/CD38设门界定CD34+CD38−细胞群（图1C），再在CD34+CD38−细胞中分别以SSC-A/CD123、SSC-A/CD96、SSC-A/TIM-3设门，根据同型对照界定出CD34+CD38−CD123+（图1D、图1E）、CD34+ CD38− CD96+（图1F、图1G）和CD34+ CD38− TIM-3+（图1H、图1I）细胞群。

图1

流式细胞术分析界定白血病干细胞各群细胞方式

A：有核细胞中的Lin−细胞群；B：Lin−细胞中的Blast细胞群；C：Blast细胞中的CD34+CD38−细胞群；D、E：CD34+CD38−细胞中CD123+细胞群的同型对照及CD34+CD38−CD123+细胞群；F、G：CD34+CD38−细胞中CD96+细胞群的同型对照及CD34+CD38−CD96+细胞群；H、I：CD34+CD38−细胞中TIM-3+细胞群的同型对照及CD34+CD38− TIM-3+细胞群

5．统计学处理：应用SPSS 19.0和GraphPad Prism 5软件进行数据处理。应用Mann-Whitney U检验比较各组间的差异，用Chi-square检验比较各组百分率的差异。以复发为指标生成ROC曲线，并根据约登指数确定最适cut-off值。总生存（OS）率的计算及累积复发率（CIR）的比较采用Kaplan-Meier生存分析和Log-rank检验。P<0.2的单因素纳入Cox回归模型进行多因素分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。

结果

1．患者初诊生物学特征及疗效：47例t（8；21）AML患者初诊时中位WBC为9.0（1.1~50.6）×109/L，HGB为74（44~151）g/L，PLT为30（9~293）×109/L；中位骨髓原始细胞比例0.430（0.150~0.900）；27例（53.2%）检测到c-KIT突变；可进行染色体核型分析的46例患者中，26例（56.5%）有t（8；21）之外的其他核型异常。

46例（97.9%）患者在1~3个疗程诱导治疗后达到CR，随后接受巩固治疗的44例患者中7例（14.9%）复发（6例为血液学复发，1例为髓外复发），2例（4.3%）死亡。全部患者2年OS率为95.4%（95% CI 82.7%~98.8%）。

基于本所前期研究，t（8；21）AML患者在2个疗程巩固治疗后，RUNX1-RUNX1T1转录本水平与基线相比下降<3个数量级和≥3个数量级（即RUNX1-RUNX1T1转录本水平>0.4%和≤0.4%）分别定义为微小残留病（MRD）高水平（MRD-H）和MRD低水平（MRD-L）。至少随访至巩固治疗2个疗程后的44例患者中，16例（36.4%）为MRD-H，28例（63.6%）为MRD-L。

2．LSC相关抗原的表达情况：47例t（8；21）AML患者中，可进行CD34+CD38−、CD123、CD96及TIM-3分析的分别为47、47、43和44例。有核细胞中的CD34+ CD38−、CD34+ CD38− CD123+、CD34+ CD38−CD96+、CD34+CD38−TIM-3+细胞比例的中位值（范围）分别为2.37%（0.10%~15.89%）、0.24%（0.0013%~7.48%）、0.27%（0.000 2%~5.04%）、0.06%（0~2.09%）。有核细胞中的CD34+ CD38− TIM-3+细胞比例明显低于CD34+CD38−CD123+和CD34+CD38−CD96+细胞比例（P=0.007，P=0.021），而CD34+CD38−CD123+和CD34+CD38−CD96+细胞比例差异无统计学意义（P=0.870）。

在本研究中，利用ROC曲线获得CD34+CD38−、CD34+ CD38− CD123+、CD34+ CD38− CD96+、CD34+ CD38−TIM-3+的cut-off值分别为3.5%、3.4%、1.6%、0.11%。≥各自cut-off值定义为高比例组，<各自cut-off值则定义为低比例组，患者在各组中的分布情况如下：CD34+CD38−细胞高、低比例组分别为14、33例，CD34+CD38−CD123+细胞分别为3、44例，CD34+ CD38− CD96+细胞分别为4、39例，CD34+CD38−TIM-3+细胞分别为18、26例。

3例CD34+CD38−CD123+细胞高比例患者均属于CD34+ CD38−细胞高比例组，4例CD34+ CD38− CD96+细胞高比例患者中有3例属于CD34+CD38−细胞高比例组，18例CD34+CD38−TIM-3+细胞高比例患者中有10例属于CD34+CD38−细胞高比例组。

3．LSC相关抗原的表达对CR获得的影响：40例（85.1%）t（8；21）AML患者在1个疗程诱导化疗后达到CR，CD34+CD38−、CD34+CD38−CD123+、CD34+ CD38−CD96+和CD34+CD38−TIM-3+细胞的比例对CR的获得无明显影响（92.9%对81.8%，P=0.600；100.0%对84.1%，P=1.000；75.0%对84.6%，P=0.520；83.3%对84.6%，P=1.000）。

4．LSC相关抗原的表达对复发的影响：44例CR之后接受巩固治疗的患者中，CD34+ CD38−、CD34+CD38−CD123+及CD34+CD38−CD96+细胞高比例患者具有更高的2年CIR率[39.6%（95% CI 6.6%~72.9%）对9.9%（95%CI 0.1%~47.5%），P=0.049；66.7%（95%CI 17.5%~91.0%）对12.7%（95%CI 0.7%~42.4%），P=0.030；50.0%（95%CI 5.8%~84.5%）对17.1%（95%CI 1.1%~49.9%），P=0.045]（图2A，图2B，图2C）。但是CD34+CD38− TIM-3+细胞比例对2年CIR率无明显影响（P=0.270，图2D）。

图2

CD34+CD38−（A）、CD34+CD38−CD123+（B）、CD34+CDCD38−CD96+（C）和CD34+CD38−TIM-3+细胞的比例（D）对2年累积复发率（CIR）率的影响

L：低比例；H：高比例

如果把接受allo-HSCT的患者截尾至移植前，CD34+CD38−及CD34+CD38−CD123+细胞高比例患者均较CD34+CD38−及CD34+CD38−CD123+细胞低比例患者具有更高的2年CIR率[52.5%（95%CI 11.8%~82.3%）对11.8%（95%CI 0.1%~50.7%），P=0.033；33.3%（95%CI 0.0%~85.8%）对14.8%（95%CI1.0%~45.6%），P=0.032]，CD34+CD38− CD96+细胞高比例患者有较高的2年CIR率的趋势，但差异无统计学意义[50.0%（95%CI 5.8%~84.5%）对23.7%（95%CI 1.8%~59.6%），P=0.100]。CD34+CD38−TIM-3+细胞比例对患者的2年CIR率仍无明显影响（P=0.220）。

5．单因素及多因素分析：随访至巩固治疗2个疗程后的44例t（8；21）AML患者，MRD-H的患者较MRD-L的患者有更高的2年CIR率[39.8%（95% CI 12.1%~66.9%）对4.2%（95% CI 0.0%~63.9%），P=0.005]。47例t（8；21）AML患者中，仅接受化疗的患者有较高的2年CIR率趋势，但差异无统计学意义（P=0.068）。患者初诊时的年龄、性别、WBC、HGB、PLT、骨髓中原始细胞比例、t（8；21）之外的其他异常核型及c-KIT突变与2年CIR率均无明显相关性（P值均>0.05）。

根据单因素分析结果，把患者初诊时血小板计数、2个疗程巩固治疗后MRD水平、治疗方式及CD34+CD38−细胞比例纳入多因素分析，2个疗程巩固治疗后MRD水平及CD34+CD38−细胞比例是t（8；21）AML患者CIR的独立预后不良因素[HR=11.1（95%CI 1.2~99.2），P=0.031；HR=6.9（95% CI 1.3~37.4），P=0.025]。CD34+ CD38−CD123+细胞比例和CD34+CD38−CD96+细胞比例分别替代CD34+ CD38−细胞比例纳入多因素分析，则CD34+CD38−CD123+细胞比例和CD34+CD38−CD96+细胞比例均不再是t（8；21）AML患者CIR的独立预后因素（P=0.240，P=0.240）。

讨论

染色体易位t（8；21）形成融合基因RUNX1-RUNX1T1是t（8；21）AML发病的分子基础。t（8；21）AML是一种高异质性疾病，尽管属于低危核型，仍有约40%的患者复发[17]–[18]。因此，有必要寻找其他预后指标对t（8；21）AML患者进一步危险分层以指导临床治疗。

采用细胞毒药物非特异性地杀伤增殖细胞仍是目前AML患者的基本治疗手段，但由于LSC主要处于静止期，往往对化疗不敏感，LSC是AML复发的根源[19]。LSC群体表型具有异质性，CD34+ CD38+、CD34+CD38−和CD34−CD38−均被证实是LSC的免疫表型特征[20]–[24]。其中，相比CD34+CD38+和CD34−CD38−细胞群，CD34+CD38−细胞群移植至免疫缺陷小鼠体内易于成功复制人AML模型，且对化疗更加不敏感，因此，一般认为CD34+CD38−是LSC的免疫表型特征[2]–[5],[25]–[29]。近年来，相继有寻找AML更多LSC相关抗原的研究，包括IL-3受体α链CD123、免疫球蛋白超家族成员之一CD96、TIM基因家族成员TIM-3等[6]–[11]。由于目前的研究多以AML为整体，尚未见针对特定类型AML的LSC相关抗原的研究。所以，本研究以CD34+CD38−作为LSC的基本抗原标志，并针对LSC相关抗原CD123、CD96、TIM-3在初诊t（8；21）AML的表达特点及预后意义进行分析。

之前一些研究已证明CD34+CD38−细胞高比例与AML预后不良相关[13],[25]，最近，Zeijlemaker等[12]在890例AML患者的大样本研究中发现初诊时CD34+CD38−细胞高比例是AML患者的独立预后不良因素。与这些以AML为整体目标的研究一致，本研究发现，t（8；21）AML患者初诊时CD34+CD38−细胞高比例的患者较低比例的患者具有更高的2年CIR率，提示在t（8；21）AML中，初诊时CD34+ CD38−细胞高比例亦与预后不良相关。

有关其他LSC相关抗原的研究表明，AML患者初诊时CD123高表达与较短的OS及较短的无病生存（DFS）时间相关，是AML预后不良因素[14]–[15]。关于CD96和TIM-3在AML患者中的预后意义研究很少，Jiang等[16]发现在AML患者中，CD96高表达的患者比CD96低表达的患者对化疗更加不敏感，且中位生存时间更短。Dawish等[30]用RT-PCR的方法发现TIM-3过表达与AML患者较短的OS相关。本研究在t（8；21）AML中发现，初诊时CD34+CD38− CD123+细胞高比例的患者和CD34+CD38−CD96+细胞高比例的患者均较相应的低比例的患者有更高的2年CIR。然而，本研究在t（8；21）AML患者中尚未发现CD34+ CD38− TIM-3+细胞比例与t（8；21）AML复发相关。

以RUNX1-RUNX1T1转录本为代表的MRD水平是t（8；21）AML疗效监测的重要指标，其他研究及本所相关研究结果显示MRD水平是t（8；21）AML的独立预后因素[31]–[32]。Zeijlemaker等[12]的研究也证实通过联合CD34+CD38−比例和MRD水平可识别预后极差的AML患者。本研究通过多因素分析发现t（8；21）AML患者初诊时CD34+CD38−细胞群高比例和2个疗程巩固治疗后MRD高水平均是CIR的独立预后不良因素，提示在这些患者的预后评估中，初诊时生物学特征的分析和治疗后的分子学监测均占据重要的地位。

综上所述，不同的LSC相关抗原表达在t（8；21）AML中的预后意义不同，初诊骨髓有核细胞中高比例的CD34+CD38−以及CD34+ CD38− CD123+和CD34+CD38−CD96+细胞与t（8；21）AML患者的复发有关。本研究结果提示在t（8；21）AML患者中，除了对以RUNX1-RUNX1T1转录本为代表的MRD水平进行监测，初诊时通过FCM对CD34+ CD38−以及CD34+ CD38− CD123+和CD34+ CD38− CD96+细胞进行评估也是有必要的。本研究病例数较少，随访时间较短，研究结果有待扩大样本量进一步验证。