Effects of Mechanical Vibration in Neuromuscular Junctions and Fiber Type of the Soleus Muscle of Oophorectomized Wistar Rats.

Objective  To evaluate the neuromuscular junctions (NMJs) and the type of muscle fibers of the soleus muscle of oophorectomized Wistar rats submitted to a mechanical vibration protocol. Methods  A total of 36 randomized rats were used in the pseudo-oophorectomy without and with treatment and oophorectomy without and with treatment groups. The treatment was performed with a vibratory platform, frequency of 60 Hz and duration of 10 minutes, 3 times a week, for 4 weeks. At the end of the intervention period, the animals were euthanized and the soleus muscles were collected and processed for analysis of the NMJs and fiber type. The data were analyzed for normality by the Shapiro-Wilk test and analysis of the 3-way variance using the post-hoc Tukey test, when necessary, and a significance level of 5% was adopted. Results  In the analysis of the NMJs, the oophorectomy group presented a smaller area than the pseudo-oophorectomy group, but the oophorectomy with treatment group was equal to the pseudo-oophorectomy with treatment group. For the larger diameter of the joints, the oophorectomy group was also different from the others; however, the oophorectomy and treatment animals were larger than those of the pseudo-oophorectomy and treatment group. There was no distinction of the types of fibers, with the muscle presenting fibers of the oxidative type. Conclusion  Hormonal deprivation reduced the area and diameter of the NMJs, with reversion of this process in the groups that underwent vibratory platform treatment for 4 weeks, and both surgery and treatment did not influence the type of soleus muscle fiber, composed of oxidative fibers.

Introduction

The neuromuscular junction (NMJ) allows communication between the peripheral nervous system and musculoskeletal fibers; it transmits electrical impulses from motor neurons to the connected myofibrils, which are responsible for the development of contractile force. 1 2 The NMJ is composed by the pre- and post-synaptic compartments. Its components include the peripheral axon, its myelin sheath and Schwann cells, acetylcholine receptors and vesicles, acetylcholinesterase and muscle basement membrane. 3

Mammalian muscle fibers may be divided into oxidative (I), oxidative-glycolytic (IIa) and glycolytic (IIb and IIx) types according to their metabolic activity. 4 The NMJs depend on muscle fiber type, and in the soleus muscle, oxidative fibers are innervated by motor neurons with low conduction velocity, being able to sustain tension for longer periods. 1

Since muscle tissue is plastic, its size and characteristics may change in response to stimuli. 5 6 Estrogen is a hormone present in both genders, but it is more characteristic of females. The musculoskeletal system also has estrogen receptors, and abnormal hormonal levels result in cellular effects, including apoptosis and protein and gene transcription, that consequently affect muscle structure, performance and strength. 4

Another stimulus that affects muscle tissues is physical exercise, which promotes changes both in fiber type, leading to fiber type conversion, and in NMJs, increasing the number of pre- and post-synaptic components. 5 6 Briefly, physical exercise is used as a treatment in postmenopausal women to improve functional capacity, coordination, muscle strength and quality of life. 7 8 One treatment modality for muscular system changes uses mechanical vibrations. These are provided by vibratory platforms, which are presented as a method of easy applicability and shorter duration compared to other exercise modalities. 9 In muscle tissues, these vibrations, after changing the muscle-tendon length, lead to maximum muscle strength gaining and hypertrophy because it requires contraction and posture maintenance during exercise; as such, this method can be successful in treating changes caused by hormonal deprivation in muscle tissues. 10 11

However, there are few data in the literature regarding the effects of hormonal deprivation on NMJs and muscle fiber types as well as the possible changes that mechanical vibration may cause in these structures. In addition, this is a search for relevant information about the treatment of disorders arising from hormonal deprivation, a process inherent to women. Thus, the present study aims to histomorphometrically evaluate neuromuscular junctions and the muscle fibers types in the soleus muscles of oophorectomized Wistar rats submitted to a mechanical vibration treatment on a commercial platform for 4 weeks.

Materials and Methods

This is an experimental, cross-sectional and quantitative study performed at the Laboratory of Injury and Physical Therapeutic Resources Study and in the Laboratory of Structural and Functional Biology of our institution. The research project was authorized by the Ethics Committee in Animal Use – CEUA Unioeste.

A completely randomized design, in a 2 × 2 factorial scheme, was carried out using a sample group composed of 36 nulliparous Wistar female rats with an average weight of 177 ± 15.8 grams and initial age of 8 weeks obtained from the Central Animal Facility and kept in the Laboratory of Injury and Physical Therapeutic Resources Study in standard polypropylene boxes, at a 23 ± 1°C temperature, a 12-hour photoperiod, and receiving pelleted food and water ad libitum.

Before the beginning of the experiments, the rats went through an acclimatization period in the animal facility for 1 week. The present study began with oophorectomy and pseudo-oophorectomy surgeries, followed by the treatment in vibratory platform for 4 weeks, ending with euthanasia and collection of biological material for analysis.

Initially, the animals were randomized into two groups: Pseudo-Oophorectomy (GP) and Oophorectomy (GO), which were respectively submitted to a pseudo-surgery or an effective oophorectomy surgery for the removal of the ovaries. The animals were further subdivided into groups submitted or not to mechanical vibration treatment, resulting in the 4 study groups (each with n  = 9): Pseudo-oophorectomy (GP); Pseudo-oophorectomy and Treatment (GPT), Oophorectomy (GO) and Oophorectomy and Treatment (GOT).

Pseudo-oophorectomy and oophorectomy surgeries were performed on all animals at the 8 th week of life, using the protocol from Khajuria et al, 12 which is the most suitable in experimental models because it is fast and easy, allowing a better recovery.

As such, the animals were properly anesthetized with an intraperitoneal injection of Dopalen 80 mg/kg and Anasedan 20 mg/kg (Paulínia, SP, Brazil); after ascertaining the lack of motor responses to tail and interdigital folds clamping, trichotomy and asepsis with iodine alcohol were performed in the lower abdomen. A longitudinal surgical incision, with a number 11 scalpel blade, was performed to access the peritoneal cavity; adipose tissues were removed until the identification of the uterine tubes and ovaries. After organ recognition, a simple catgut 4.0 suture was performed in the uterine horn area, promoting bilateral ovary resection. At the end of the procedure, internal sutures with 4.0 simple, reabsorbable catgut sutures were performed, while external sutures used 4.0 nylon.

The pseudo-oophorectomy consisted of all of the oophorectomy surgical stages, except for the removal of the ovaries; as such, all of the animals underwent the same surgical stress, avoiding a study bias. After surgery, the rats underwent no interventions for 8 weeks, being kept free in the cage during the induction of hormonal deprivation effects. 12

The vibration treatment of animals from the GPT and GOT groups used a professional Arktus triplanar Vibro Oscillatory Platform (Arktus, Santa Tereza do Oeste, PR, Brazil). The protocol, adapted from Butezloff et al, 13 employed a 60 Hz frequency and alternating vibrations at a 2 mm amplitude for 10 minutes, and it was performed 3 times a week. The treatment started from the 8 th postoperative week, when the 60 days of hormonal deprivation were completed, and lasted for 4 weeks.

To perform the treatment on a commercial platform, a support was developed by the researchers according to the dimensions of the device. This support was intended to contain the animals during the vibration treatment; moreover, it enabled training several animals simultaneously for time optimization. 14 This support was made with white medium-density fiberboard (MDF), and it allowed the simultaneous positioning of 8 animals in stalls, which were 13 centimeters wide, 19 centimeters long and 25 centimeters high. In addition, to minimize a possible bias due to different acceleration and amplitude points on the vibration platform, 15 the stalls were rotated, changing the training position of the animals during the course of the treatment.

After the treatment period, the animals were properly anesthetized intraperitoneally and euthanized with an anesthetic overdose at the end of the 12 th postoperative week. The right and left soleus muscles were dissected, cleaned, weighed and sectioned into fragments with a stainless-steel blade for further analysis.

For the study of the NMJs, distal fragments of the right antimeres were removed and immersed in Karnovisky fixative 16 at room temperature. The muscles were sectioned longitudinally into four or five portions with stainless-steel blades, and these sections were submitted to a nonspecific esterase reaction. 17 In the morphometric analysis of the NMJs, the area and largest diameter of 150 NMJs per studied animal, obtained from microscopic images at 200-times magnification, were measured. The distal fragment of the left antimere was collected and kept at room temperature for 40 minutes. 18 Next, for tissue preservation, the material was covered with neutral talc according to the technique by Moline et al, 19 frozen in liquid nitrogen for 2 minutes, stored in cryotubes and kept in Biofreezer (Lupetec, São Carlos São Paulo, Brazil) at - 80°C for histoenzymology analysis. Frozen muscle segments were transferred to a Lupetec CM 2850 Cryostat Microtome cryostat chamber (Lupetec, Vila Monumento, SP, Brazil) at - 30°C for 30 minutes. Then, the segments were glued to a metal support using a Leica EM AFS2 tissue freezing medium (Leica Biosystems, Wetzlar, Germany) and were sectioned transversely in samples with 7 μm in thickness. For analysis of the oxidative and glycolytic metabolism of muscle fibers, sections were submitted to a nicotinamide adenine dinucleotide – tetrazolium reductase (NADH-TR) reaction, according to the Pearse 20 technique modified by Dubowitz et al. 21 This analysis quantifies and measures the percentages of different muscle fibers types (I, IIa and IIb) according to the hue developed by the enzymatic reaction. For each animal, 3 microscopic fields were chosen randomly at 200-fold magnification.

Data analysis was performed using descriptive statistics, residual normality assessment by the Shapiro-Wilk test and subsequent three-way variance analysis. In case of statistical significance ( p  < 0.05), the Tukey-HSD test was performed using the ExpDes.pt package of R software (R Core Team, 2017).

Results

Neuromuscular Junctions

There was a significant interaction between oophorectomy and treatment regarding the NMJs area (F = 4.99; p  = 0.03). There was a difference between the GP and GO groups, demonstrating that oophorectomy surgery exerts the expected effects, decreasing NMJ area values (F = 15.07; p  < 0.001). Platform treatment normalized these values, since the average values for the GOT and GPT groups were similar (F = 0.52; p  = 0.4), which is also confirmed by the difference between the GO and GOT groups (F = 5.44; p  = 0.02).

In addition, there was a significant interaction between oophorectomy and treatment regarding the largest NMJ diameter (F = 27.05; p  < 0.001). The GO group is different from the GP (F = 26.6; p  < 0.001) and GPT (F = 7.06; p  = 0.01) groups, meaning that hormonal deprivation also influenced the junctional diameter. There was also a difference between the GO and GOT groups (F = 22.09; p  < 0.001), since the value of the GOT group was higher than that of the GO group. Moreover, in this variable, the values of the GOT group were higher than those of the GPT group (F = 26.6; p  < 0.001), reinforcing a possible effect of the vibratory platform on the diameter of the NMJs ( Table 1 ). These morphometric changes are also seen in Fig. 1 , which shows the morphology of these NMJs.

Table 1

Area and largest diameter of neuromuscular junction receptors in the soleus muscle of Wistar rats

		Area	Larger diameter
GROUPS	GP	5.80 ± 0.2ª	4.25 ± 0.1 b
	GPT	5.65 ± 0.4 a	4.03 ± 0.17 b
	GO	5.2 ± 0.40 b	3.82 ± 0.25 c
	GOT	5.54 ± 0.2 a	5.54 ± 0.13ª

Abbreviations: GO, oophorectomy group; GOT, oophorectomy and treatment group; GP, pseudo-oophorectomy group; GPT, pseudo-oophorectomy and treatment group.

Values expressed as mean ± standard deviation. Different letters represent a statistically significant difference.

Fig. 1

Photomicrographs of neuromuscular junction (NMJ) receptors of the soleus muscle of Wistar rats after nonspecific esterase reaction. A , pseudo-oophorectomy group (GP); B , pseudo-oophorectomy and treatment group (GPT); C , oophorectomy group (GO) with decreased NMJ area and diameter at the morphological comparison with other groups; D , oophorectomy and treatment group (GOT). Arrowhead represents NMJs receptors labeled by this technique.

Fig. 2 illustrates NMJs from the studied groups, which had elliptical and oval shapes. Morphologically, there was a decrease in area and, consequently, NMJs from the GO group present a smaller diameter ( Fig. 1C ), a finding also confirmed by morphometry ( Table 1 ).

Fig. 2

Photomicrographs of the soleus muscle of Wistar rats, cross-sectioned, nicotinamide adenine dinucleotide – tetrazolium reductase enzyme reaction. A , pseudo-oophorectomy group (GP); B , pseudo-oophorectomy and treatment group (GPT); C , oophorectomy group (GO), and D , oophorectomy and treatment group (GOT). There was no differentiation between muscle fibers staining by this technique, and all fibers are type I.

Type of Muscle Fibers

The analysis of the soleus muscles by the NADH-TR technique ( Fig. 2 ) showed the lack of differentiation between oxidative (I), intermediate (IIa) and glycolytic (IIb) muscle fibers, since there was no alternation in the intensity of the hues.

Discussion

Oophorectomy and the treatment on a vibrating platform were able to influence only the morphometrics and the morphological features of the NMJs, not affecting the muscle fiber type of the soleus muscle of the rats. Hormonal deprivation resulting from oophorectomy influenced the NMJs, decreasing both their area and diameter values. Although no study specifically evaluates NMJs in hormonal deprivation, the presence of estrogen-sensitive receptors in related tissues 4 may justify the changes observed in this experimental model.

There is still no consensus on the pathological effects of estrogen on nervous tissue, and it is postulated that estrogen may exert an influence by acting on sensory processing and nociceptive transmission modulation. 22 However, the changes found in NMJs in the present study cannot be solely attributed to the nervous tissue, because these structures can be pathophysiologically affected by both pre- and post-synaptic input. 23 24 25 Thus, degeneration of the NMJs may be triggered by disturbances in muscle metabolism followed by changes in motor units. 26 27

The estrogen deficit caused experimentally by oophorectomy may be related to some disturbances in muscle metabolism that culminate in an increase of inflammatory markers and mitochondrial metabolism alterations, 28 which may result in sensitization and loss of motor units, mass decrease and muscle atrophy 29 due to degeneration of the NMJ, 26 27 corroborating our findings.

Deschenes et al 2 investigated the effects of gender and decreased weight loading after 2 weeks of hind limb elevation. As a result, they concluded that NMJs did not differ between males and females in control groups under standard physiological conditions, and that the 2-week intervention period did not influence the morphometrics and morphological features of NMJs in the soleus, extensor digitorum longus and plantaris muscles, since the synaptic transmission was equivalent in both genders under normal conditions. Conversely, in our study, NMJs from the hormone deprivation groups were affected. Thus, we may assume that these changes depend on the time of stimulus maintenance, since in a previous study of the same research group, Deschenes et al 30 found that 4 weeks of decreased weight loading could alter the NMJs.

In addition, there are also no data in the literature about the behavior of NMJs against mechanical vibration. However, the present study showed that the treatment with a vibratory platform was successful in reversing the deleterious effects of hormonal deprivation, since area values from the GOT and the GP groups were similar, and the diameter results were even higher in the GOT group compared with the GP groups. Both the decrease and the increase in physical activity can cause changes in NMJs, influencing the area and length of the branches and, consequently, the pre- and post-synaptic relationship, with compensatory NMJ hypertrophy due to exercise. 1 The resistance training performed by Deschenes et al, 25 with 6 weeks of treadmill use, was able to remodel NMJs from the plantaris muscle, but not from the extensor digitorum longus muscle, that is, there were effects on the most recruited muscle during the exercise, suggesting that results are also dependent on the muscle recruitment used.

According to Nishimune et al, 23 the soleus muscle is widely used in studies of the adaptation of NMJs to physical exercise due to its homogeneity in muscle fiber types and antigravity function; as such, results depend on exercise type, intensity and purpose, and muscle type. Seene et al 1 attempted to evaluate the differences in NMJs from oxidative and glycolytic fiber, as well as their behavior during physical exercise. In glycolytic fibers, axon terminals and fibers are elliptical and larger compared with slow fibers, occupying a larger sarcoplasmic area. In oxidative fibers, more common in the soleus muscle, the axon terminals are short, round, and morphologically similar, but present a greater number of mitochondria. Both fiber types are affected by training, but in this 6-week treadmill walk study, there was greater remodeling of NMJs in oxidative fibers, probably because this exercise modality requires more from these fibers. However, these same authors 1 23 also used immunofluorescence and cytofluorescence techniques to find out that physical exercise increased the number of vesicles in axon terminals, which is attributed to a de novo post-synaptic synthesis of acetylcholine that result in remodeling of the NMJs. Although the exercise modality was different, the beneficial effects of the vibratory platform treatment may also be based on this hypothesis from the literature, but more specific methodologies are required for its confirmation.

Haizlip et al 4 report a higher prevalence of oxidative fibers in females compared with males. This feature promotes higher performance, endurance, and better recovery in response to exercise and muscle fatigue. Although only females were evaluated in our study, this information reinforces our results. Even though the present paper was performed with a different exercise modality, the mechanical vibration exercise protocol required postural maintenance during exposure; consequently, this recruitment pattern may explain the positive results found.

As such, physical exercise seems critical to maintain the physical functionality of the NMJ. Another possible explanation for the adaptation of the NMJ to the vibrating platform treatment may be that the exercise-required muscle contraction interferes with the regulation and protein expression of molecules and growth factors such as the glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), insulin-like growth factor 1 (IGF-1) and interleukins such as IL1-Ra, IL-10 and even IL-6, leading to adaptation, improved transmission, and hypertrophy of the NMJs. 3 23 31

The soleus muscles from all groups were mainly composed of type I fibers, which have the highest mitochondrial respiration capacity, 3 and the NADH-TR technique was used to determine the oxidative functioning of the mitochondria by an enzymatic reaction staining. 32 The oophorectomy did not affect the percentages of each fiber type in murine soleus muscles in a study by Moran et al, 33 but the immunohistochemical analysis revealed different types of fibers. Haizlip et al 4 also concluded that, in oophorectomy models, there were no changes in fiber type, only in muscle size and diameter. Although in smaller numbers, this differentiation could have been found using more specific techniques such as immunofluorescence and ATPase activity.

As with oophorectomy, the vibrating platform treatment did not change muscle fiber types, even though the literature indicates that physical exercise can promote changes in fiber type. 1 Camargo Filho et al 34 analyzed the response of the soleus muscle to treadmill exercise and cigarette exposure. Different levels of fiber enzymatic activity were observed; however, as in our study, the NADH-TH reaction mostly identified oxidative fibers. Deschenes et al, 2 also evaluating the soleus muscle, revealed no changes in fiber type, since > 95% of its fibers were type I fibers in both genders. The small percentage of soleus type II fibers had no significant effects on gender and treatment. Deep postural muscles may express a greater number of fibers with oxidative phenotype (fibers I and IIa), unlike more superficial muscles, such as the gastrocnemius (fibers IIx and IIb). 4 Since the present study used the soleus muscle, which is main postural and oxidative muscle in rats, 3 no different fiber types were found.

Conclusion

The results of the present study allow us to conclude that the area and diameter of the NMJs were affected by the oophorectomy surgery and by the vibration platform treatment, which was able to reverse morphometric and morphological changes. Furthermore, we concluded that the soleus muscle of Wistar rats is predominantly composed of oxidative fibers that were not changed by the experimental model of hormonal deprivation and the mechanical vibration treatment.

Introdução

A junção neuromuscular (JNM) permite a comunicação entre o sistema nervoso periférico e as fibras musculoesqueléticas, tendo como função transmitir os impulsos elétricos dos neurônios motores às miofibrilas conectadas, sendo estas responsáveis pelo desenvolvimento da força contrátil. 1 2 A JNM é composta pelos compartimentos pré- e pós-sinápticos, tendo como componentes o axônio periférico, sua bainha de mielina e células de Schwann, vesículas e receptores de acetilcolina, a enzima acetilcolinesterase e a membrana basal muscular. 3

Em mamíferos, as fibras musculares podem ser divididas em oxidativas (ou tipo I), oxidativas-glicolíticas (ou tipo IIa) e glicolíticas (ou tipo IIb e IIx), classificadas de acordo com a atividade metabólica. 4 As JNMs são dependentes do tipo de fibra muscular e, como no caso do músculo sóleo, as fibras oxidativas são inervadas por motoneurônios de velocidade de condução lenta e capazes de sustentar a tensão por maiores períodos. 1

Uma vez que o tecido muscular é plástico, o mesmo pode sofrer modificações de características e tamanho como resposta a estímulos. 5 6 O estrogênio é um hormônio presente em ambos os sexos, porém mais característico no feminino. O sistema musculoesquelético também apresenta receptores de estrogênio, e quando as concentrações do hormônio se encontram fora da homeostase, há efeitos celulares como alteração na transcrição de proteínas, de genes e efeitos apoptóticos que irão afetar consequentemente a estrutura, o desempenho e a força muscular. 4

Outro estímulo que interfere no tecido muscular é o exercício físico, capaz de promover modificações tanto no tipo de fibra quanto nas junções neuromusculares, promovendo a conversão do tipo de fibra e aumentando o número de componentes pré- e pós-sinápticos, respectivamente. 5 6 Em suma, o exercício físico é utilizado como tratamento para mulheres no período pós-menopausa para melhorar a capacidade funcional, a coordenação, a força muscular e, consequentemente, a qualidade de vida. 7 8 Uma modalidade de tratamento de alterações no sistema muscular é a utilização de vibrações mecânicas. Para ofertar essas vibrações, são utilizadas plataformas vibratórias que se apresentam como um método de fácil aplicabilidade e menor tempo de duração quando comparado à outras modalidades de exercício. 9 No tecido muscular, essas vibrações objetivam, após alterações no comprimento músculotendíneo, o ganho de força máxima, potência e hipertrofia muscular ao exigir a contração e a manutenção da postura durante a realização do exercício, sendo um método que pode ser eficaz no tratamento de alterações decorrentes da privação hormonal no tecido muscular. 10 11

No entanto, há uma escassez de dados na literatura referentes aos efeitos da privação hormonal nas junções neuromusculares e nos tipos de fibras musculares, assim como das possíveis alterações que a vibração mecânica pode causar nestas estruturas. Ainda, soma-se a busca por informações relevantes para o tratamento de desordens provenientes da privação hormonal, processo este inerente às mulheres. Desta forma, o presente estudo buscou avaliar histomorfometricamente as junções neuromusculares e o tipo de fibras do músculo sóleo de ratas Wistar ooforectomizadas e submetidas ao tratamento com vibração mecânica em plataforma comercial durante 4 semanas.

Materiais e Método

O presente estudo teve caráter experimental, transversal e quantitativo, desenvolvido no Laboratório de Estudo de Lesões e Recursos Fisioterapêuticos e no Laboratório de Biologia Estrutural e Funcional da nossa instituição, sendo o projeto de pesquisa autorizado pelo Comitê de Ética em Uso Animal – CEUA Unioeste.

Foi realizado um delineamento inteiramente casualizado, em esquema fatorial 2 × 2, com o grupo amostral composto por 36 ratas fêmeas da linhagem Wistar, nulíparas, com peso médio de 177 ± 15.8 gramas e idade inicial de 8 semanas, obtidas do Biotério Central e mantidas no Laboratório de Estudo de Lesões e Recursos Fisioterapêuticos, em caixas-padrão de polipropileno, em ambiente com temperatura de 23 ± 1°C, com fotoperíodo de 12 horas, recebendo água e ração ad libitum .

Prévio ao início dos procedimentos deste trabalho, as ratas passaram pelo período de aclimatação no biotério setorial durante 1 semana. O processo de desenvolvimento deste estudo foi realizado a partir da realização da cirurgia de ooforectomia e pseudo-ooforectomia nos animais, seguindo com o tratamento de plataforma vibratória durante 4 semanas, findando com a eutanásia e coleta do material biológico para análises.

Os animais foram randomizados nos grupos Pseudo-Ooforectomia (GP) e Ooforectomia (GO), submetidos à pseudocirurgia ou cirurgia efetiva de ooforectomia para retirada dos ovários. Os animais foram ainda subdivididos para grupos que passaram ou não pelo tratamento com vibração mecânica, resultando nos 4 grupos ( n  = 9 cada) do estudo: Pseudo-ooforectomia (GP); Pseudo-ooforectomia Tratamento (GPT), Ooforectomia (GO) e Ooforectomia Tratamento (GOT).

As cirurgias de pseudo-ooforectomia e ooforectomia foram realizadas em todos os animais na 8ª semana de vida dos mesmos, utilizando o protocolo de Khajuria et al, 12 o mais indicado para a realização da ooforectomia em modelos experimentais por ser fácil, rápido e possibilitar uma melhor recuperação para os animais.

Para tanto, os animais foram devidamente anestesiados com injeção intraperitoneal de Dopalen 80 mg/kg e de Anasedan 20 mg/kg (Paulínea, SP, Brasil) e posteriormente à verificação do estado de consciência, observado pela ausência de resposta motora ao pinçamento da cauda e das pregas interdigitais, realizou-se a tricotomia e assepsia com álcool iodado na região de baixo ventre. Uma incisão cirúrgica longitudinal, com lâmina de bisturi número 11, foi realizada para acessar a cavidade peritoneal, sendo afastado o tecido adiposo até a identificação das tubas uterinas e ovários. Após este reconhecimento dos órgãos, foi feita uma sutura com fio catgut 4.0 simples na área dos cornos uterinos, promovendo a ressecção dos ovários bilateralmente. Ao final do procedimento, foram realizadas suturas internas com fio reabsorvível catgut 4.0 simples e as externas com fio de nylon 4.0.

A pseudo-ooforectomia consistiu na realização de todas as etapas cirúrgicas semelhantes à ooforectomia, com exceção da remoção dos ovários, para os animais passarem pelo mesmo estresse cirúrgico, evitando um viés no estudo. Subsequente à cirurgia, as ratas permaneceram 8 semanas sem qualquer intervenção, livres na gaiola para o período de indução dos efeitos da privação hormonal. 12

Para o tratamento com vibração dos animais dos grupos GPT e GOT, foi utilizado um modelo de plataforma Vibro Oscilatória triplanar profissional (Arktus, Santa Tereza do Oeste, PR, Brasil). O protocolo utilizado foi adaptado de Butezloff et al, 13 utilizando uma frequência de 60 Hz e vibrações alternadas com uma amplitude de 2 milímetros, durante 10 minutos, 3 vezes por semana. O tratamento foi iniciado a partir da 8ª semana pós-operatória, quando os 60 dias de privação hormonal foram completados, e teve duração de 4 semanas.

Para a realização do tratamento em plataforma comercial, utilizou-se um suporte desenvolvido pelos pesquisadores de acordo com as dimensões do aparelho. O uso de um suporte teve como finalidade conter o animal durante o tratamento com a vibração e possibilitar a realização do treinamento com vários animais de forma simultânea, otimizando-se o tempo. 14 Este suporte confeccionado com madeira MDF, da cor branca, permitiu posicionar 8 animais concomitantemente em baias com 13 centímetros de largura, 19 centímetros de comprimento e altura de 25 centímetros. Ainda, para minimizar um possível viés sobre pontos distintos de aceleração e amplitude sobre a plataforma vibratória, 15 foi elaborado um rodízio entre as baias, fazendo com que os animais alternassem o local em que foram alojados durante o treino ao longo dos dias.

Após o período de tratamento, os animais foram devidamente anestesiados via intraperitoneal e eutanasiados por overdose de anestésico ao final da 12ª semana pós-operatória com ou sem plataforma vibratória. Os músculos sóleos direitos e esquerdos foram dissecados, limpos, pesados e seccionados em fragmentos com uma lâmina de inox para posterior realização das análises.

Para o estudo das JNMs, foram utilizados os fragmentos distais dos antímeros direitos, removidos e imersos no fixador Karnovisky 16 em temperatura ambiente. Os músculos foram cortados longitudinalmente em quatro ou cinco porções com lâminas de inox, e os cortes obtidos foram submetidos à reação de esterase inespecífica. 17 Na análise morfométrica das JNMs, foram mensuradas a área e maior diâmetro de 150 JNMs por animal estudado, obtidas a partir de imagens microscópicas no aumento de 200 vezes. O fragmento distal do antímero esquerdo foi coletado e mantido em temperatura ambiente durante 40 minutos. 18 Após esse período, para a preservação do tecido, o material foi coberto com talco neutro, de acordo com a técnica de Moline et al, 19 congelado em nitrogênio líquido durante dois minutos, acondicionados em criotubos e armazenado em Biofreezer (Lupetec, São Carlos São Paulo, Brasil) a - 80°C para análise histoenzimológica. Os segmentos musculares congelados foram transferidos para uma câmara de criostato Cryostat CM 2850 (Lupetec, Vila Monumento, SP, Brasil) a - 30°C e mantidos durante 30 minutos. Em seguida, os segmentos tiveram a extremidade colada a um suporte metálico utilizando-se um meio de congelamento de células Leica EM AFS2 (Leica Biosystems, Wetzlar, Alemanha) e foram seccionados transversalmente a 7 μm de espessura. Para análise do metabolismo oxidativo e glicolítico das fibras musculares, as secções transversais foram submetidas à reação nicotinamida adenina dinucleotídeo - tetrazolium reductase (NADH-TR), conforme a técnica de Pearse 20 modificada por Dubowitz et al. 21 Essa análise busca quantificar e mensurar em porcentagem os diferentes tipos de fibras musculares (I, IIa e IIb) de acordo com a tonalidade apresentada nas fibras após a reação enzimática. Para cada animal, foram escolhidos aleatoriamente 3 campos microscópicos no aumento de 200 vezes.

A análise dos dados foi realizada por meio da estatística descritiva, avaliação da normalidade dos resíduos pelo teste de Shapiro-Wilk, com posterior análise da variância de três vias. Em caso de significância estatística ( p  < 0,05), foi realizado o teste Tukey-HSD, com auxílio do pacote ExpDes.pt do programa R (R Core Team, 2017).

Junções neuromusculares

Quanto à área das JNMs, houve interação significativa entre ooforectomia e tratamento (F = 4,99; p  = 0,03). Houve diferença entre os grupos GP e GO, demonstrando que a cirurgia de ooforectomia exerce efeitos tal como esperado, com diminuição dos valores da área das JNMs (F = 15,07; p  < 0,001). Já o tratamento com plataforma normalizou esses valores, uma vez que os grupos GOT e GPT possuem médias equivalentes (F = 0,52; p  = 0.4), também comprovado pela diferença entre os grupos GO e GOT (F = 5,44; p  = 0,02).

Para o maior diâmetro das JNMs, também houve interação significativa entre ooforectomia e tratamento (F = 27,05; p  < 0,001). O grupo GO é diferente dos grupos GP (F = 26,6; p  < 0,001) e GPT (F = 7,06; p  = 0,01), significando que a privação hormonal também influencia no diâmetro das junções. Os grupos GO e GOT apresentaram diferença (F = 22,09; p  < 0.001), sendo o GOT maior que o GO. Além disso, nesta variável, os valores do grupo GOT foram maiores do que os do GPT (F = 26,6; p  < 0,001), reforçando um possível efeito da plataforma vibratória no diâmetro ( Tabela 1 ). Essas alterações morfométricas também são visualizadas na Fig. 1 , representando a morfologia dessas JNMs.

Tabela 1

Área e maior diâmetro dos receptores das junções neuromusculares do músculo sóleo de ratas Wistar

		Área	Maior diâmetro
GRUPOS	GP	5,80 ± 0,2ª	4,25 ± 0,1 b
	GPT	5,65 ± 0,4 a	4,03 ± 0,17 b
	GO	5,2 ± 0,40 b	3,82 ± 0,25 c
	GOT	5,54 ± 0,2 a	5,54 ± 0,13ª

Abreviações: GO, grupo ooforectomia; GOT, grupo ooforectomia tratado; GP, grupo pseudo-ooforectomia; GPT, grupo pseudo-ooforectomia tratado.

Valores expressos em média ± desvio padrão. Letras diferentes representaram diferença estatisticamente significativa.

Fig. 1

Fotomicrografias dos receptores de junções neuromusculares do músculo sóleo de ratas Wistar após reação de esterase inespecífica. Em A , grupo pseudo-ooforectomia (GP); B , grupo pseudo-ooforectomia tratado (GPT); C , grupo ooforectomia (GO) com diminuição da área e diâmetro das junções neuromusculares quando comparado morfologicamente aos demais grupos; D , grupo ooforectomia tratado (GOT). Ponta de seta representa os receptores das junções neuromusculares marcados com a técnica.

A Fig. 2 ilustra as JNMs nos grupos utilizados no presente trabalho, com as mesmas possuindo formas elípticas e ovais. Morfologicamente, é possível verificar a diminuição da área e, consequentemente, menor diâmetro das JNMs do grupo GO ( Fig. 1C ), comprovado também pela morfometria ( Tabela 1 ).

Fig. 2

Fotomicrografias do músculo sóleo de ratas Wistar, corte transversal, reação enzimática nicotinamida adenina dinucleotídeo - tetrazolium reductase. Em A , Grupo pseudo-ooforectomia (GP); B Grupo pseudo-ooforectomia tratado (GPT); C grupo ooforectomia (GO) e D , grupo ooforectomia tratado (GOT). Não houve diferenciação entre a coloração das fibras musculares nesta técnica, com as fibras apresentando-se em tua totalidade como fibras do tipo I.

Tipo de fibras musculares

Analisando os músculos sóleos após a técnica NADH-TR ( Fig. 2 ), foi evidenciado que não houve diferenciação das fibras musculares oxidativas (I), intermediárias (IIa) e glicolíticas (IIb), uma vez que não houve alternância entre a intensidade das colorações características da técnica.

Discussão

Como resultados, foi possível observar que a cirurgia de ooforectomia e o tratamento com a plataforma vibratória foram capazes de influenciar apenas a morfometria e morfologia das JNMs, não afetando o tipo de fibra muscular do sóleo das ratas. Em relação à análise das JNMs, foi possível observar que o efeito da privação hormonal obtido pela cirurgia de ooforectomia exerceu influência sobre estas estruturas, com diminuição dos valores tanto de área quanto de diâmetro. Embora não haja estudos que avaliem especificamente as JNMs na privação hormonal, a presença de receptores sensíveis ao estrogênio nos tecidos relacionados 4 pode justificar alterações observadas nesse modelo experimental.

Ainda não há consenso sobre efeitos patológicos do estrogênio no tecido nervoso, e existe uma hipótese de que ele possa exercer influência, atuando no processamento sensorial e na modulação da transmissão nociceptiva. 22 Contudo, não se pode afirmar que as alterações encontradas nas JNMs no presente trabalho sejam decorrentes do tecido nervoso, uma vez que as mesmas podem ser afetadas fisiopatologicamente tanto por entrada pré quanto pós-sináptica. 23 24 25 Desta forma, a própria degeneração da JNM pode ter sido desencadeada pela perturbação no metabolismo muscular seguida de alterações nas unidades motoras. 26 27

O déficit de estrogênio, causado experimentalmente pela cirurgia de ooforectomia, pode estar relacionado com algumas perturbações no metabolismo muscular que culminam no aumento de marcadores inflamatórios e na alteração no metabolismo mitocondrial, 28 podendo levar a uma sensibilização e à perda de unidades motoras, diminuição da massa e atrofia muscular, 29 pela degeneração das JNMs, 26 27 corroborando com os achados desse estudo.

Deschenes et al 2 investigaram os efeitos do gênero e da diminuição da descarga de peso após 2 semanas de elevação do membro posterior. Como resultado, concluíram que as JNMs não diferiram entre os sexos masculino e feminino nos grupos controle, com condições fisiológicas padrão, e o período de 2 semanas de intervenção não influenciou a morfometria e a morfologia das JNMs nos músculos sóleo, extensor longo dos dedos e plantar, sendo a transmissão sináptica equivalente nos dois sexos em condições normais. De forma contrária, em nosso estudo, as JNMs foram afetadas no grupo que sofreu privação hormonal. Assim, é possível assumir que as alterações sejam dependentes do tempo em que o estímulo é mantido, uma vez que em um trabalho anterior do mesmo grupo de pesquisa, Deschenes et al 30 verificaram que 4 semanas de diminuição da descarga foi capaz de ocasionar mudanças nas JNMs.

Também não existem dados na literatura do comportamento das JNMs frente à vibração mecânica. Entretanto, com o presente estudo, foi possível verificar que o tratamento com a plataforma vibratória foi eficaz na reversão dos efeitos deletérios da privação hormonal, uma vez que o grupo GOT se apresentou semelhante aos grupos pseudo-ooforectomia na variável área e até maior que os mesmos em relação ao diâmetro. Tanto a diminuição quanto o aumento da atividade física são capazes de ocasionar mudanças nas JNMs, influenciando a área e o comprimento dos ramos e, consequentemente, a relação pré- e pós-sináptica, havendo uma hipertrofia das JNMs compensatória ao exercício. 1 O treinamento de resistência realizado por Deschenes et al, 25 com 6 semanas de esteira, foi capaz de promover a remodelação das JNMs do músculo plantar, mas não do extensor longo dos dedos, ou seja, houve efeitos no músculo mais recrutado durante o exercício executado, sugerindo que os resultados também são dependentes do recrutamento muscular utilizado.

De acordo com Nishimune et al, 23 o músculo sóleo é muito utilizado em estudos para verificar as adaptações das JNMs perante o exercício físico devido à homogeneidade na composição do tipo de fibra muscular e a função antigravitacionária, com os resultados dependentes do tipo, intensidade e finalidade do exercício com o tipo de músculo. Seene et al 1 buscaram avaliar as diferenças entre as JNMs de fibras oxidativas e glicolíticas, bem como o comportamento das mesmas durante o exercício físico. Nas fibras glicolíticas, os terminais e fibras axônicas são elípticas e maiores que os de fibras lentas, ocupando uma maior área no sarcoplasma. Já nas fibras oxidativas, mais presentes no músculo sóleo, os terminais axônicos são curtos, redondos e morfologicamente semelhantes, com também maior número de mitocôndrias. Os dois tipos de fibras são afetados com o treinamento; porém, neste estudo de seis semanas de caminhada em esteira, houve maior remodelação das JNMs nas fibras oxidativas, provavelmente devido à modalidade do exercício escolhido exigir mais destas fibras. Ainda, esses mesmos autores 1 23 também utilizaram as técnicas de imunofluorescência e citofluorescência e verificaram que o exercício físico proporcionou acréscimo no número de vesículas nos terminais axônicos, isto atribuído à ressíntese de acetilcolina após a sinapse, proporcionando a remodelação das junções. Apesar da modalidade de exercício ter sido outra, os efeitos benéficos do tratamento com a plataforma vibratória também podem se basear nessa hipótese da literatura; entretanto, são necessárias metodologias mais específicas para a confirmação.

De acordo com Haizlip et al, 4 há uma prevalência de fibras oxidativas no sexo feminino quando comparado ao masculino. Esta característica promove maior desempenho, resistência e melhor recuperação em resposta ao exercício e fadiga muscular. Embora apenas fêmeas tenham sido avaliadas em nosso estudo, a informação citada reforça os resultados do tratamento. Ainda que o presente artigo tenha sido realizado com modalidades diferentes de exercício, o protocolo de exercício com a vibração mecânica utilizado exigia a manutenção da postura dos animais durante exposição à vibração mecânica e, consequentemente, este padrão de recrutamento pode explicar os resultados positivos encontrados.

Diante do exposto, é visto que o exercício físico possui demasiada importância na manutenção da funcionalidade física das JNMs. Outra possível explicação da adaptação das JNMs frente ao tratamento com a plataforma vibratória pode ser pelo fato da contração muscular exigida pelo exercício interferir na regulação e expressão proteica de moléculas e fatores de crescimento como o fator neurotrófico derivado de células da glia (GDNF, na sigla em inglês), fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1, na sigla em inglês) e interleucinas como a IL1-Ra, IL-10 e até mesmo a IL-6, levando à adaptação, à melhora da transmissão e à hipertrofia das JNMs. 3 23 31

Em relação ao tipo de fibra, o músculo sóleo é composto principalmente por fibras do tipo I em todos os grupos, tendo esse tipo de fibra maior capacidade de respiração mitocondrial, 3 com a técnica de NADH-TR sendo utilizada para determinar o funcionamento oxidativo das mitocôndrias por meio da coloração após a reação enzimática. 32 A cirurgia de ooforectomia também não afetou a porcentagens de cada tipo de fibra no músculo sóleo de camundongos no trabalho de Moran et al, 33 porém com análise imunohistoquímica foram encontrados os diferentes tipos de fibras. Haizlip et al 4 também concluíram que em modelos de ooforectomia não houve alterações no tipo de fibra e somente mudanças no tamanho e diâmetro muscular. Embora em menor número, esta diferenciação poderia ter sido encontrada utilizando técnicas mais específicas como, por exemplo, imunofluorescência e atividade da ATPase.

Assim como a cirurgia de ooforectomia, o tratamento com a plataforma vibratória não alterou o tipo de fibra muscular com a análise utilizada, embora a literatura aponte que o exercício físico também é capaz de promover alterações no tipo de fibra. 1 Camargo Filho et al 34 analisaram a resposta do músculo sóleo frente ao exercício de esteira e exposição ao cigarro. Foram observados diferentes níveis de atividade enzimática das fibras; entretanto, assim como neste estudo, a reação de NADH-TH identificou em sua maioria fibras oxidativas. No trabalho de Deschenes et al, 2 avaliando também o músculo sóleo, não houve mudanças no tipo de fibra, uma vez que > 95% das fibras musculares deste músculo, para ambos os sexos, era composta por fibras do tipo I. A pequena porcentagem de fibras do tipo II do sóleo não apresentou efeitos significativos para o sexo e tratamento. Músculos posturais profundos podem expressar um maior número de fibras com fenótipo oxidativo (fibras I e IIa), diferentemente de músculos mais superficiais como o gastrocnêmio (fibras IIx e IIb). 4 No presente trabalho, utilizou-se o músculo sóleo, e atribui-se às características dele ser o principal músculo postural e oxidativo no rato 3 o fato de não terem sido encontrados diferentes tipos de fibra.

Conclusão

Com base nos resultados do presente estudo, foi possível concluir que a área e o diâmetro das JNMs foram afetados tanto pela cirurgia de ooforectomia quanto pelo tratamento com a plataforma vibratória, sendo este capaz de reverter alterações morfométricas e morfológicas. Ainda, conclui-se que o músculo sóleo de ratas Wistar é predominantemente composto por fibras oxidativas que não foram alteradas com o modelo experimental de privação hormonal e tratamento com vibração mecânica.