[Clinical significance of minimal residual disease in patients with Ph-negative precursor B-acute lymphoblastic leukemia].

Objective: To explore the predictive value of minimal residual disease (MRD) level in Ph-negative precursor B-acute lymphoblastic leukemia (ALL) patients.
Methods: De novo 193 Ph-negative B-ALL patients from Sep 2010 to Nov 2017 were involved in the study. The patients' MRD evaluation which can be performed by multiparametric flow cytometry (MFC) after 1 month, 3-month, 6-month treatment. Relapse free survival (RFS) and overall survival (OS) were compared in patients with different MRD level.
Results: The median follow-up was 22 months. All patients was evaluated at 497 MRD level. Patients who reach the good MRD level at 1 month (<0.1% or ≥0.1%), 3-month (negative or positive), 6-month (negative or positive) had a significantly higher probability of estimated RFS (74.5% vs 29.9%; 75.6% vs 29.7%; 74.6% vs 11.6%) and of estimated OS (67.5% vs 30.3%; 71.6% vs 27.8%; 74.0% vs 15.7%). Patients who reach the MRD negative at all 3 times had a significantly higher probability of estimated RFS (80.5% vs 30.5%) and better estimated OS (77.1% vs 29.4%) compared to patients with at least MRD failure in one time (P<0.001). Multivariable analysis showed MRD level at 3-month was an independent prognostic factor for DFS and OS.
Conclusion: MRD is an important prognosis factor for Ph-negative B- ALL patients.

近年来成人急性淋巴细胞白血病（ALL）患者完全缓解（CR）率达85%以上，长期生存率为40%~50%[1]–[3]。但复发仍是ALL患者死亡的主要原因。患者体内微小残留病（MRD）是导致疾病复发的根源，因此对MRD的监测在患者的治疗过程中尤为重要。研究表明，ALL患者诱导及巩固治疗后的MRD水平成为白血病疗效及预后判断的一个新的指标，并对患者的治疗选择有一定的指导作用[4]–[8]。MRD检测手段主要包括多参数流式细胞术和PCR。技术的便利性和经济性使流式细胞术成为MRD监测的常用手段。目前，国内对于青少年及成人ALL患者MRD水平与预后的关系鲜有报道，本研究我们对我院2010年9月至2017年11月收治入院的193例初诊Ph− B-ALL患者治疗后MRD水平对预后的影响进行分析。

病例与方法

1．病例来源：均为2010年9月至2017年11月我院白血病诊疗中心收治的初诊Ph− B-ALL患者。所有患者均进行形态学、细胞化学、免疫表型、细胞遗传学及分子生物学检查，符合文献[9]诊断标准。纳入本研究的ALL患者及其监护人均签署知情同意书。

2．治疗：患者的整体治疗分为4个阶段：诱导治疗、早期巩固强化治疗、晚期巩固强化治疗、维持治疗。患者明确诊断后开始治疗，若初诊时存在WBC>50×109/L或肝、脾、淋巴结明显肿大等肿瘤负荷过高指征，加用CP方案（泼尼松60 mg/d，−3~−1 d，环磷酰胺200 mg·m−2·d−1，−3~−1 d）预治疗，以预防肿瘤溶解综合征发生，然后再行诱导治疗。诱导治疗第14天行骨髓穿刺，根据骨髓增生情况及幼稚细胞比例决定第15~16天是否加用柔红霉素。达到CR的患者，根据患者配型情况及条件，考虑是否行异基因造血干细胞移植；无移植条件患者，继续原方案治疗，维持治疗持续至缓解后3年。由于ALL治疗方案的改进，2014年2月前收治的患者采用传统化疗方案；之后收治的患者采用新的化疗方案，详见表1。

表1

传统急性淋巴细胞白血病化疗方案（方案1）和新化疗方案（方案2）

阶段	方案1	方案2
诱导治疗	VDCLP	VDCLP
早期巩固强化治疗	CAML	CAMVL×2次
	HD-MTX+L-Asp×3次	HD-MTX+VL×2次
晚期巩固强化治疗	COATD	VDLD
	VDLD	CAMVL
	TA	HD-MTX+VL×2次
		VDLD
		CAMVL
维持治疗	MM+VP	MM+VP
	①VMCLD（每6个月强化1次）；②HD- MTX + L- Asp（每6个月强化1次，与VMCLD间隔3个月）

注：表中化疗方案具体用法参见文献[1]，VMCLD方案中以米托蒽醌替代柔红霉素：米托蒽醌8 mg·m−2·d−1，静脉滴注，第1天，余同VDCLD方案

3．疗效标准：根据2013版ALL NCCN指南标准判定疗效，CR定义为：①骨髓原始幼稚淋巴细胞<0.050，外周血无原始幼稚淋巴细胞；②血常规：中性粒细胞绝对计数>1×109/L，PLT>100×109/L；③无髓外白血病证据。复发定义为骨髓原始幼稚淋巴细胞>0.050，或出现髓外病灶。

4．多色流式细胞术检测MRD：采用多色流式细胞术对患者治疗后不同时间点的骨髓标本进行MRD检测，评价患者MRD水平。时间点分别为诱导治疗结束（治疗后1个月）、巩固强化治疗2个疗程结束后（治疗后3个月）及治疗后6个月。

采集患者骨髓标本4~5 ml（有核细胞总数>5×107），肝素抗凝，在48 h内采用全血/髓溶血法（红细胞裂解液Lysing Solution，货号：349202，BD公司产品）处理标本，采用流式细胞仪（贝克曼库尔特公司Navios流式细胞分析系统）分析。所用单克隆抗体主要包括：CD19、CD34、CD38、CD10、CD33、CD20、CD45。以CD19设门，分析白血病细胞抗原表达。阳性病例判断标准：参照阴性对照及内对照（质控品：Immuno-Trol Cells，货号：6607077，贝克曼库尔特公司产品）。检测敏感度为10−4~10−5。流式细胞术未检测到肿瘤细胞为MRD阴性。

5．随访：随访方式包括查阅患者住院及门诊病历、电话联系等。随访截止时间为2018年5月8日。无复发生存（RFS）期定义为CR至白血病复发或在CR期间死亡或末次随访日期。总生存（OS）期定义为自诊断到死亡或末次随访日期。

6．统计学处理：数据采用SPSS16.0软件进行处理。样本率的比较采用χ2检验。生存分析应用Kaplan-Meier生存曲线，Log-rank检验。所有的统计检验均采用双侧检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1．患者一般资料：2010年9月至2017年11月共收治初诊Ph− B-ALL患者193例。其中男115例（59.6%）、女78例（40.4%）；中位年龄24（13~68）岁；初诊时中位WBC 11.06（0.33~481.20）×109/L、HGB 85（38~159）g/L、PLT 61（2~397）×109/L。193例患者中MLL+ ALL 16例（8.3%），E2A-PBX1+ ALL 13例（6.7%），预后不良核型30例（15.5%）；早前B-ALL 21例（10.9%），前B-ALL 42例（21.8%），普通型B-ALL 130例（67.3%）。

2．治疗及生存情况：193例患者中，总CR率为96.9%（187/193），诱导治疗1个疗程CR率为94.3%（182/193）。行造血干细胞移植66例（34.1%），其中自体造血干细胞移植15例，异基因造血干细胞移植51例。截至2018年5月8日，中位随访时间22（1~92）个月，所有患者3年预期RFS和OS率分别为60.7%和55.3%。

3．不同时间点MRD水平及其与患者预后的关系：入组患者分别在治疗后1个月（诱导治疗结束）、3个月（巩固强化治疗2个疗程后）、6个月行MRD检测，所有患者共行MRD检测497次（3个时间点分别为193、168、136次）。参照国外标准设定患者治疗后1个月MRD水平以0.1%为界（<0.1%或≥0.1%），治疗后3、6个月MRD水平以能否检测到肿瘤细胞（阳性或阴性）为界，比较不同MRD水平患者的RFS及OS。结果显示：治疗后1个月MRD<0.1%和≥0.1%患者的3年预期RFS率分别为74.5%和29.9%，3年预期OS率分别为67.5%和30.3%（图1）；治疗后3个月MRD阴性和阳性患者的3年预期RFS率分别为75.6%和29.7%，3年预期OS率分别为71.6%和27.8%（图2）；治疗后6个月MRD阴性和阳性的患者的3年预期RFS率分别为74.6%和11.6%，3年预期OS率分别为74.0%和15.7%（图3）；3次MRD检测患者均阴性的患者与存在至少1次MRD阳性的患者，3年预期RFS率分别为80.5%和30.5%，3年预期OS率分别为77.1%和29.4%（图4），差异均有统计学意义（P值均<0.001）。多因素分析显示（纳入因素包括年龄、初诊时WBC、根据染色体核型及融合基因预后分组、1个月及3个月时MRD水平），治疗后3个月MRD水平为影响患者OS的独立预后因素之一（表2）。

图1

治疗后1个月微小残留病（MRD）水平对患者无复发生存（A）及总生存（B）的影响

图2

治疗后3个月微小残留病（MRD）水平对患者无复发生存（A）及总生存（B）的影响

图3

治疗后6个月微小残留病（MRD）水平对患者无复发生存（A）及总生存（B）的影响

图4

微小残留病（MRD）检测3次均阴性和至少1次MRD阳性患者无复发生存（A）及总生存（B）的比较

表2

多因素分析对患者总生存预后的影响因素

影响因素	危险度（95% CI）	P值
年龄（>35岁对≤35岁）	3.178（1.817～5.560）	<0.001
WBC（>30×109/L对≤30×109/L）	2.512（1.429～4.416）	0.001
3个月MRD（阳性对阴性）	4.569（2.654～7.868）	<0.001

注：MRD：微小残留病

讨论

近些年来，随着化疗方案的改善及移植技术的应用，成人ALL的疗效显著提高，但复发仍是患者死亡的重要原因。而骨髓中残留的白血病细胞仍是患者复发的主要原因。随着MRD检测方案在临床中的开展及应用，对于ALL患者，MRD水平成为患者重要的预后指标之一，并影响患者进一步的治疗方式的选择。

研究发现，ALL患者治疗后MRD水平是患者重要的预后因素之一[4],[10]–[13]，与传统的治疗前预后因素同等重要。化疗后取得MRD阴性提示大多数患者能够获得长期生存；而MRD的残存则预示患者复发的风险升高[6]。Ribera等[4]研究发现，对于高危组成人ALL患者（采用流式细胞术进行MRD检测），MRD阴性患者5年DFS、OS率分别为55%、59%，远高于MRD阳性患者（32%、37%）。本研究结果显示，1个月时MRD水平<0.1%患者的3年预期RFS率、OS率均明显高于≥0.1%患者（74.5%对29.9%，67.5%对30.3%），3、6个月时MRD水平阴性患者的3年预期RFS率、OS率均明显高于阳性患者（3个月时：75.6%对29.7%，71.6%对27.8%；6个月时：74.6%对11.6%，74.0%对15.7%）。3个监测点全部达到MRD阴性的患者与至少1次未达到MRD阴性的患者比较，3年预期RFS率分别为80.5%和30.5%，3年预期OS率分别为77.1%和29.4%，差异有统计学意义。多因素分析显示：患者3个月时的MRD水平是独立的预后因素之一。与国际报道大致相当。

MRD水平不仅是ALL患者的预后重要因素，而且进一步影响ALL患者的治疗策略。多项研究表明：对于MRD阴性的ALL患者，除极高危组患者（MLL阳性、Ph-like ALL、IKZF1缺失、TP53突变、低亚二倍体等）外，异基因造血干细胞移植对患者的长期生存并无明显改善;而对于MRD阳性的患者，异基因造血干细胞移植可明显提高患者长期生存率[4],[6],[14]–[16]。本组患者中，由于行异基因造血干细胞移植患者例数较少，未进行比较。

综上，MRD水平是ALL重要的预后因素之一。随着MRD检测方法的改进、MRD检测水平的提高，MRD检测将在ALL患者的预后分析上发挥越来越重要的作用，并进一步影响ALL患者的下一步治疗策略。