[The role of PDK1 in the transition of endothelial to hematopoietic cells].

Objective: To explore the role of PDK1 in the transition of endothelial to hematopoietic cells and its effect on the generation and normal function of HSC.
Methods: PDK1 was deleted specifically in endothelial cells expressing VEC (Vascular Endothelial Cadherin). CFU-C was performed to detect the effect of PDK1 on the function of hematopoietic progenitor cells using the cells from PDK1(fl/fl), PDK1(fl/+) and Vec-Cre; PDK1(fl/fl) AGM region. Hematopoietic stem cell transplantation assay was conducted to determine the effect of PDK1 on hematopoietic stem cells. Flow cytometry was performed to analyze the influence of PDK1 on percentage, cell cycle and apoptosis of CD31(+)c-Kit(high) cell population. Real-time PCR was conducted to measure the expression of transcription factors involved in process of transition from endothelial to hematopoietic cells.
Results: In contrast to the wild type group, the CFU from PDK1-deficient hematopoietic progenitor cells showed smaller in morphology and fewer in quantity. CFU-GM was (24±5)/ee in knockout group, and the control group was (62±1)/ee (P=0.001). PDK1 deletion severely impaired the ability to repopulate hematopoietic cells and differentiate into committed cells. hematopoietic progenitor cells from knockout group was transplanted into 5 recipients without any recipients reconstructed. However, 5 of 7 recipients were reconstructed in control group (P=0.001). The proportion of intra-vascular clusters in the AGM was decreased (the frequency of CD31(+)c-Kit(high) in the knockout group was (0.145±0.017)%, and the control group ratio was (0.385±0.040)% (P=0.001), but not due to the inhibition of cell proliferation and/or increase of apoptosis. Further study found that the absence of endothelial PDK1 causes a decreased expression of RUNX1, P2-RUNX1, GATA2 and other important hematopoietic-related transcription factors in hemogenic cluster.
Conclusion: PDK1 deletion impairs the transition of endothelial cells to hematopoietic cells as well as the generation and function of HSC.

永久的成体造血系统起始于造血干细胞（HSC）的形成[1]。HSC为整个生命体提供不同阶段、全部类型的血细胞，了解HSC发生阶段的调控基因具有重要意义。在小鼠胚胎中，次级造血可以被分为两波：起始于胚胎期的第8或8.5天最初一代的多能造血祖细胞，及从胚胎第10.5天开始的具有成体重建造血功能的HSC[2]–[4]。来自多个研究策略的证据表明次级造血祖细胞和HSC是直接由生血内皮形成的，这种生血内皮是一种特殊类型的具有瞬时造血潜能的结构内皮。该过程被认为是内皮细胞生成的转变，表现为胚胎内的主动脉、卵黄动脉和脐动脉中出现血管造血簇[5]–[9]。

磷酸肌醇依赖性激酶1（PDK1）首先在成纤维细胞和表皮细胞中由胰岛素和/或其他生长因子刺激的PI3K-PKB信号通路中被发现[10]，为蛋白激酶AGC家族的主要调控者。PDK1作为AGC家族成员上游的蛋白激酶，通过磷酸化AGC激酶成员的一个保守的T-loop残基（处于这些激酶催化区域的中心位置），进而激活这些激酶来发挥功能[11]–[12]，发挥其对细胞生长、增殖、存活及代谢的调控作用[13]。

PDK1对小鼠胚胎的正常发育具有重要作用，并可以调控细胞的大小。Lawlor等[14]通过构建PDK1基因完全缺失的小鼠模型发现，完全缺失PDK1基因的小鼠胚胎在第9.5天死亡，并伴有多个异常表型，包括体节数目减少、由前脑和神经脊发育来的组织缺失。此外，PDK1对HSC、T细胞、B细胞、血小板的发育及功能均有调控作用[15]–[20]。然而，目前还未清楚PDK1是否是内皮细胞向造血细胞转换及正常主动脉-性腺-中肾区（aorta-gonad-mesonephros，AGM区）HSC形成所必须的。因此，本课题组通过构建Vec-Cre；PDK1fl/fl小鼠，在表达VEC的内皮细胞中特异性敲除PDK1基因来研究PDK1在内皮细胞向造血细胞转换中的作用。

材料与方法

1．主要材料、试剂和仪器：Vec-Cre（Vascular endothelial cadherin-Cre）小鼠[8]购自美国Jackson实验室，PDK1fl/fl C57BL/6J小鼠（白细胞抗原表型为CD45.2）[10]由Dario R. Alessi教授惠赠，B6.SJL小鼠（白细胞抗原表型为CD45.1）为我院实验动物中心保存。所有小鼠均饲养于SPF级动物房。所有涉及小鼠的实验均获得我院动物伦理委员会的批准。

MethoCult M3434（CFC培养基）为美国Stem cell公司产品。流式相关抗体[CD31（MEC13.3）PE、c-Kit（2B8）APC、CD45.1（A20）APC、CD45.2（104）PE、CD3（145-2C11）PE-Cy7、B220（RA3-6B2）FITC、Mac-1（M1/70）APC-Cy7]购自美国e-Bioscience或BD公司。周期及凋亡相关试剂：Hoechst33342购自美国Sigma-Aldrich公司；Anti-mouse Ki-67 kit APC、Annexin Ⅴ-7AAD apoptosis Kit FITC、FACS Lysing Solution、IntraSure kit均为美国BD公司产品。逆转录试剂盒购自美国Transgene公司。Fast Start Universal SYBR Green Master购自瑞士Roche公司。配置凝胶用琼脂糖购自西班牙Biowest Agarose公司。

超净台为北京东联哈尔仪器制造有限公司产品；常温台式离心机及CO2细胞培养箱为德国Thermo公司产品；普通倒置显微镜及荧光倒置显微镜TE2000-S为日本Nikon公司产品；Micro one小型离心机为日本Tomy公司产品；VORTEX涡旋振荡器为美国Scientific Industries公司产品；小摇床为深圳市培英电子有限公司产品；超纯水系统为德国Millipore公司产品；普通PCR仪为美国Bio-Rad/ABI公司产品；LSRⅡ/LSR Forteasa/CantoⅡ/AriaⅢ流式细胞仪为美国BD公司产品。

2．PDK1基因敲除小鼠模型的构建及鉴定：利用Vec-Cre；Loxp系统在小鼠内皮细胞中特异性敲除PDK1基因。首先将Vec-Cre雄鼠与PDK1fl/fl雌鼠进行杂交，得到Vec-Cre；PDK1fl/+小鼠；再将Vec-Cre；PDK1fl/+雄鼠与PDK1fl/fl雌鼠杂交，得到Vec-Cre；PDK1fl/fl目的基因型小鼠胚胎（图1A）。采用PCR鉴定小鼠基因型：PCR条件：95 °C预变性4 min；95 °C变性30 s，55 °C退火30 s，72 °C延伸30 s，35个循环；72 °C退火5 min。将PCR产物用20 g/L的琼脂糖凝胶进行电泳，成像。具体引物序列见表1。经验证，成功构建Vec-Cre；PDK1fl/fl小鼠模型（图1B）。

图1

构建在VEC阳性内皮细胞中特异敲除PDK1基因的小鼠模型

A：Vec-Cre;PDK1fl/fl小鼠繁殖路线；B：小鼠基因型鉴定代表图；1、4：PDK1fl/+小鼠；2、6：Vec-Cre; PDK1fl/+小鼠；3、5：Vec-Cre;PDK1fl/fl小鼠；7：PDK1fl/fl小鼠

表1

PCR引物序列

基因	上游引物（5′→3′）	下游引物（5′→3′）
GAPDH	TGTGTCCGTCGTGGATCTGA	TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG
PDK1	CTGGCCCGAGAACTG	GTCGTCCTGAAATGTAAAA
GATA2	GCGAAAACCAAACTGCATAAGC	CTGTCTCCCAGAAACCAAGAGC
RUNX1	ACTCACTGGCGCTGCAACAA	AAGCTCTTGCCTCTACCGCT
P2-RUNX1	AAGATCCGAGCCCCTGTC	TCACAACAAGCCGATTGAGT

3．集落形成实验：取1个胚胎当量（embryo equivalent, ee）第11.5天AGM区细胞，用0.1%胶原酶37 °C消化30 min，1 ml含10% FBS的PBS终止消化，240×g离心5 min后弃上清，100 µl PBS重悬细胞，加入到1 ml M3434中，充分振荡混匀，用克隆针种于3.5 cm培养皿中，置于37 °C、5% CO2恒温细胞培养箱中，培养7 d，于显微镜下观察计数，统计CFU-GEMM、CFU-GM及BFU-E集落数目。

4．AGM区造血细胞比例检测：取1 ee AGM用0.1%胶原酶37 °C消化30 min，1 ml PBE洗1遍，50 µl PBE重悬细胞，标记抗体CD31、c-Kit（4 °C、30 min）。每管加入1 ml PBE洗1遍，4 °C，240×g离心5 min，弃上清，每管加入300 µl PBE重悬细胞，过300目尼龙膜，上流式细胞仪进行检测。

5．AGM区细胞凋亡检测：将裂解好的AGM区细胞中加入表面标记抗体，冰上孵育30 min；每管加入1 ml Binding缓冲液洗1遍，240×g、4 °C离心5 min；弃上清，留约50 µl液体，每管样品管中加入5 µl FTTC Annexin Ⅴ和5 µl 7-AAD，混匀后室温避光孵育15 min；每管加入300 µl Binding缓冲液重悬，过300目尼龙膜，1 h内上机检测。

6．AGM区细胞周期（Ki-67）检测（使用IntraSure kit检测）：将裂解好的AGM区细胞样品管加入表面标记抗体，冰上孵育30 min；每管加入100 µl Reagent A混匀，室温避光放置5 min；每管加入1 ml FACS lysing缓冲液，室温避光孵育10 min，240×g、4 °C离心5 min弃上清，留约50 µl液体；每管加入50 µl Reagent B，样品管中加入APC-Ki67 5 µl，室温避光孵育30 min；每管加入1 ml PBE洗1遍，240×g、4 °C离心5 min，弃上清。300 µl重悬，过300目尼龙膜至流式管中。上机前加Hoechst 33342终浓度至10~20 µg/ml。

7．AGM造血干细胞移植实验：将裂解好的来自供体小鼠对照组PDK1fl/fl或PDK1fl/+及实验组Vec-Cre;PDK1fl/fl（白细胞抗原表型为CD45.2）的AGM区细胞通过尾静脉注射到受致死剂量（9.5 Gy）照射（照射分两次，间隔时间大于2 h，照射后4 h内进行移植）的B6.SJL小鼠（白细胞抗原表型为CD45.1）。每只受体小鼠注射1 ee AGM区细胞及2×104保护细胞（保护细胞为B6.SJL骨髓细胞），细胞重悬于含1%FBS的PBS中，总体积为400 µl。移植后一周内饮用水中加恩诺沙星。在移植后第4、8、12、16周通过尾静脉取受体小鼠外周血检测HSC重建及各系分化情况。外周血供体嵌合率大于10%定义为获得造血重建。

8．Real-time PCR检测相关基因的表达：流式分选AGM区CD31+c-Kithigh细胞群，将分选得到的细胞用Qiagen RNeasy Mini Kit进行RNA提取和纯化，按照手册进行操作。取1 µg RNA，按照逆转录试剂盒操作手册进行逆转录。获得cDNA后，采用SYBR染料法，参考Fast Start Universal SYBR Green Master说明书在QuantStudio5（0.1 ml）仪器上进行Real-time PCR。引物序列见表2。反应条件：95 °C，10 min；95 °C 15 s，60 °C，1 min，重复40个循环；收集信号。反应体系为20 µl，每个反应设置3个复孔，以GAPDH为内参，按照2−ΔΔCt计算基因的相对表达量。

表2

Real-time PCR引物序列

基因	上游引物（5′→3′）	下游引物（5′→3′）
GAPDH	TGTGTCCGTCGTGGATCTGA	TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG
PDK1	CTGGCCCGAGAACTG	GTCGTCCTGAAATGTAAAA
GATA2	GCGAAAACCAAACTGCATAAGC	CTGTCTCCCAGAAACCAAGAGC
RUNX1	ACTCACTGGCGCTGCAACAA	AAGCTCTTGCCTCTACCGCT
P2-RUNX1	AAGATCCGAGCCCCTGTC	TCACAACAAGCCGATTGAGT

9．统计学处理：数据分析使用t检验（移植嵌合率数据除外），使用软件版本为GraphPad Prism 7.0，数据变量使用均值±标准误进行表述，移植嵌合率数据使用重复测量方差分析及多变量方差分析，使用软件版本为IBM SPSS Statistics22。

结果

1．敲除小鼠内皮细胞PDK1基因对造血干/祖细胞（HSPC）功能的影响：为了研究敲除PDK1基因对HSPC功能的影响，本课题组取对照组和敲除组小鼠胚胎的AGM区细胞进行集落形成实验分析。结果显示敲除组Vec-Cre;PDK1fl/fl小鼠相对于对照组PDK1fl/fl、PDK1fl/+小鼠所形成的集落形态小、数目少，其中敲除组CFU-GM的数目[（24±5）个CFU-GM/ee]相对于对照组[（62±1）个CFU-GM/ee]减少了约50%（图2A、B）。同时，为了排除敲除组克隆数目减少是由于AGM整体细胞数减少的可能性，我们进行AGM区细胞计数，结果显示对照组AGM区细胞平均计数为（2.534±0.510）×105/ee，敲除组AGM区细胞平均计数为（2.685±0.560）×105/ee，两组差异无统计学意义（P=0.849）（图2C）。为了检测敲除PDK1基因是否影响HSC的发生，本课题组进行了造血干细胞移植实验，取第11.5天AGM区细胞移植到受致死剂量照射的B6.SJL小鼠（白细胞抗原为CD45.1）体内，并在移植后第4、8、12、16周取外周血检测HSC重建情况。同对照组PDK1fl/fl、PDK1fl/+相比，Vec-Cre;PDK1fl/fl AGM细胞来源的受鼠无法重建造血及向各系分化（图2D~I）。在移植第16周将对照组及敲除组的受鼠处死，取受鼠骨髓、脾脏和胸腺，计算供体嵌合率。流式结果显示，在Vec-Cre;PDK1fl/fl AGM区细胞来源的受鼠中几乎没有检测到来自供体的细胞（图2J~L）。以上结果表明，内皮细胞中PDK1蛋白的缺失阻碍HSPC的发生且损害其正常功能。

图2

PDK1在内皮细胞中敲除后破坏造血细胞的功能（*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001）

对照组：PDK1fl/fl或PDK1fl/+；基因敲除组：Vec-Cre;PDK1fl/fl；A：克隆结晶紫染色扫描图及克隆在显微镜下形态图；B：克隆数目统计结果（n=3，实验重复2次）；C：AGM区计数（n=4，实验重复3次）；D：移植的受体小鼠检测外周血嵌合率流式代表图；E：AGM区移植到受体小鼠，16周后供体嵌合率（对照组共移植7只，5只重建；基因敲除组共移植5只，0只重建）；F~I：对照组和基因敲除组AGM区移植到受体小鼠，分别于第4、8、12、16周取受体小鼠外周血检测供体嵌合率及各系分化；J~L：移植后16周，取受体小鼠骨髓、胸腺、脾脏细胞，流式细胞术检测骨髓、胸腺、脾脏细胞的供体嵌合率

3．PDK1在内皮细胞中敲除后AGM的内皮生血簇比例降低：为了研究PDK1基因敲除后是否影响内皮向生血内皮的转换，我们通过流式细胞术检测了敲除组和对照组AGM区生血簇（CD31+c-Kithigh细胞）比例。结果显示，敲除组和对照组相比，AGM区生血簇比例降低[敲除组为（0.145±0.017）%，对照组为（0.385±0.04）%，P=0.001]（图3A、B）。以上结果表明，PDK1基因敲除后，导致了具有向造血转化的AGM区内皮簇CD31+c-Kithigh细胞比例减少，阻碍了内皮向生血内皮的转换。

图3

PDK1在内皮细胞中敲除后阻碍了内皮向造血细胞的转换（**P<0.01）

对照组：PDK1fl/fl或PDK1fl/+；基因敲除组：Vec-Cre;PDK1fl/fl；A：CD31+c-Kithigh细胞群代表图；B：CD31+c-Kithigh细胞群比例（n=3，实验重复3次）

4．Vec-Cre;PDK1fl/fl AGM区生血簇的减少不是由于异常的细胞周期和凋亡造成：本课题组进一步研究PDK1基因在VEC阳性的内皮细胞敲除后，其AGM区生血簇比例降低是否是由于CD31+c-Kit+细胞群的增殖减少和（或）凋亡增多所导致。为了检测这一可能性，本课题组用Ki-67标记第11.5天AGM区细胞，通过流式细胞术检测了CD31+c-Kit+细胞群的细胞周期状态。结果发现，在VEC阳性的内皮细胞特异性敲除PDK1基因后，和对照组PDK1fl/fl、PDK1fl/+相比并不阻碍CD31+c-Kit+细胞群的细胞增殖（图4A、B），且并不促进CD31+c-Kit+细胞群细胞凋亡（图4C、D）。结果表明，敲除组AGM区生血簇的减少不是由异常的细胞周期和凋亡造成。

图4

Vec-Cre;PDK1fl/fl AGM区生血簇的减少并不是由于异常的细胞周期和凋亡

对照组：PDK1fl/fl或PDK1fl/+；基因敲除组：Vec-Cre;PDK1fl/fl；A、C：CD31+c-Kithigh细胞群周期及凋亡代表图；B、D：CD31+c-Kithigh细胞群周期（n=4，实验重复2次）及凋亡（对照组n=8，基因敲除组n=7，实验重复2次）

5．在内皮细胞中敲除PDK1基因后，RUNX1、P2-RUNX1及GATA2的表达水平降低：本课题组将第11.5天AGM区裂解成单个细胞，流式分选CD31+ c-Kit+细胞群，提取RNA后反转为cDNA，通过实时定量PCR检测RUNX1、P2-RUNX1及GATA2的表达。结果显示，同对照组相比，敲除PDK1基因后，AGM区的RUNX1、P2-RUNX1及GATA2表达均下降，其中RUNX1表达下降约86%，P2-RUNX1表达下降约49%，GATA2表达下降约82%（图5）。这提示在VEC阳性的内皮细胞特异敲除PDK1基因后，通过降低转录因子RUNX1、P2-RUNX1及GATA2的表达，从而可能阻碍了内皮向造血细胞的转换。

图5

PDK1在内皮细胞中敲除后RUNX1、P2-RUNX1及GATA2的表达水平降低（**P<0.01,***P<0.001）

对照组：PDK1fl/fl或PDK1fl/+；基因敲除组：Vec-Cre;PDK1fl/fl

讨论

HSC是一类能够自我更新并分化成所有血液细胞的造血始祖细胞。破译在胚胎发育时期血管内皮细胞向造血细胞发育调控的分子机制，对更好地理解造血细胞是如何发生及再生医学均具有重要的意义。在本研究中，本课题组发现PDK1在内皮细胞向造血细胞转换阶段及HSC发生和功能中均发挥着重要作用。为了检测PDK1在AGM区的内皮生血及HSC发生的作用，本课题组构建了在VEC阳性的内皮细胞中特异性敲除PDK1基因的小鼠，通过流式细胞术及集落形成实验发现敲除PDK1基因后小鼠内皮生血簇比例降低，形成的集落体积减小且数目减少；通过移植AGM区细胞至受致死剂量照射的受体小鼠体内，发现Vec-Cre；PDK1fl/fl AGM区的HSC无法重建造血及多向分化。已有文献报道RUNX1、P2-RUNX1及GATA2等转录因子在内皮向造血转换过程中发挥着重要作用，在内皮细胞中特异性敲除RUNX1或GATA2均会影响内皮向造血的转换[8],[21]。进一步，本课题组通过RT-PCR检测AGM区CD31+c-Kithigh细胞群一些内皮向造血转换重要的转录因子（RUNX1、P2-RUNX1及GATA2）的表达，研究发现同对照组相比，这些转录因子在敲除组表达大幅度降低。而这些转录因子均可以促进内皮细胞向造血细胞转换。

本课题组之前发现通过Vav-Cre特异性敲除小鼠血细胞PDK1基因，可降低HSC的活性氧（ROS）水平，使得静息状态的HSC数目减少，进而HSC失去重建造血及多向分化的能力[15]。这表明PDK1在小鼠不同的发育阶段，调控造血的机制是不同的，这也反映了造血调控的复杂性及精确性。值得注意的是，RICTOR作为AKT另外一个磷酸化位点，和PDK1（可以磷酸化AKT Thr308位点）类似，可以通过磷酸化AKT丝氨酸473位点进而使其活化。已有研究表明，通过Tie2-Cre在内皮中特异性敲除RICTOR基因，AGM区重建造血能力显著降低（对照组19只受体鼠重建13只，敲除组15只受体鼠重建1只），而通过Vav-Cre在造血细胞中特异敲除RICTOR基因，敲除组的AGM区可重建造血及多向分化（嵌合率约为对照组嵌合率的50%），这说明RICTOR在生血内皮中HSC的发生是不可或缺的，但对之后的HSC发育的必要性降低[22]。而PDK1蛋白对HSC及造血祖细胞的发生及功能均是不可或缺。此外，PDK1对造血系统的其他种类血细胞作用及机制也有相关。PDK1对T细胞的活化和功能的发挥具有重要作用。在适应性免疫应答中，T细胞受体（TCR）识别抗原后激活转录因子NF-κB对T细胞的活化与增殖具有重要作用[23]。PDK1对整合TCR和CD28信号来说是必不可少的[16]。同时，PDK1对T细胞的发育及增殖也具有重要作用。当在双阴性（DN）的胸腺细胞中条件性敲除PDK1，则会破坏pre-TCR诱导的增殖，使T细胞发育阻滞在DN4期。降低PDK1的表达量时，虽然不会阻滞T细胞的分化，但会阻碍T细胞的扩增[17]。B细胞在适应性免疫应答和免疫记忆的形成均具有重要作用。Baracho等[19]通过条件性敲除PDK1基因，研究发现B细胞受体和其他细胞因子的受体需要PDK1，以促进骨髓中产生B细胞及成熟B细胞存活和活化。Venigalla等[18]通过Vav-Cre转基因小鼠在造血系统中特异的敲除PDK1基因，观察到敲除PDK1基因后会阻碍骨髓中B细胞从pro-B向pre-B发育的进程。刘俊岭课题组利用在血小板中特异性敲除PDK1基因的Cre小鼠研究发现，缺乏PDK1会引起轻微的血小板减少症。同时，体内实验研究结果显示PDK1在动脉的血栓形成中发挥重要的调控功能[20]。

已有研究发现一些重要的蛋白如FLI1[24]、NOTCH1[25]、LNK[26]、GATA2[27]–[28]、RUNX1[8],[21],[29]、C-MYB等[30]均可以调控AGM区的造血，科学家试图寻找出一个可以调控造血的主导性基因，然而越来越多的实验结果表明造血发生是由多种细胞因子共同调控完成的。HSC能够自我更新及多向分化，来源相对广泛，易于取材和处理，具有广阔和重要的临床应用价值。了解AGM区内皮向生血细胞转换对研究HSC的自然发生和发展及内皮细胞体外重编程均具有重要意义。然而，造血细胞的发生和发展是一个复杂而精细的过程，还存在许多未知的因素，需要继续探索。我们的研究显示，PDK1对造血的发生和功能均有重要作用，敲除PDK1基因内皮细胞向生血细胞转换受阻，并使产生的HSC失去重建正常造血的能力，这将对体外培养及调控HSC具有重要的提示意义。我们今后的研究将着重于PDK1调控内皮向生血细胞转换的具体信号网络的解析。