Circulating Tumour Cells, Circulating Tumour DNA and Circulating MicroRNA in Metastatic Breast Carcinoma - What is the Role of Liquid Biopsy in Breast Cancer?

Dissemination of tumour cells and the development of solid metastases occurs via blood vessels and lymphatics. Circulating tumour cells (CTCs) and circulating tumour DNA (ctDNA) can be detected in venous blood in patients with early and metastatic breast cancer, and their prognostic relevance has been demonstrated on numerous occasions. Repeated testing for CTCs and ctDNA, or regular so-called "liquid biopsy", can be performed easily at any stage during the course of disease. Additional molecular analysis allows definition of tumour characteristics and heterogeneity that may be associated with treatment resistance. This in turn makes personalised, targeted treatments possible that may achieve both improved overall survival and quality of life.

Introduction

Thanks to numerous new treatment concepts and drugs the management of metastatic breast carcinoma (MBC) is in a state of continuous further development. Nevertheless MBC is still associated with high mortality and significant quality of life restrictions. Choosing between available treatment options is challenging for both doctor and patient alike. Current treatment regimens are tailored to tumour phenotype characteristics such as hormone receptor (HR) or HER2 status, which are usually determined at primary diagnosis. In the past, possible changes to tumour tissue phenotype were not detected and thus not taken into account even in the case of treatment failure. However, since tumour characteristics may change in the course of the disease, current treatment guidelines recommend the additional characterisation of e.g. solid metastases 1 . This recommendation however requires performing further invasive biopsies that are not always technically possible and may encounter limited patient compliance. Sequential HR and HER2 detection is thus generally not performed, meaning that tumour heterogeneity does not play a role in treatment decision-making 2 . As a consequence therapy remains nontargeted and potentially inefficient. The same applies to other tumour biomarkers.

With the aim of improving progression free survival (PFS) and quality of life (QoL) various study concepts are currently evaluating methods that would enable repeated and, most importantly, less invasive tumour characterisation. Constituting a so-called “liquid biopsy”, biomarkers such as circulating tumour cells (CTC) and circulating tumour DNA from peripheral venous blood are a promising alternative to formal biopsy for monitoring tumour characteristics (HR/HER2 status), treatment response and the course of disease.

The establishment of individual, personalised and therefore more effective treatment strategies is the ultimate goal.

Circulating Tumour Cells

Biological and clinical relevance

CTCs were described for the first time by Thomas Ashworth in 1869. Together with disseminated tumour cells (DTC) in bone marrow they are regarded as “minimal residual disease” and appear to be the source of distant solid metastases 3 . The prognostic significance of DTCs has been demonstrated for primary breast carcinoma 4 . A follow-up study has also shown that the demonstration of DTCs in bone marrow after completion of adjuvant systemic treatment is associated with higher recurrence risk 5 . DTCs would thus appear to be fundamentally suited to monitoring breast cancer and its prognosis. Like formal metastasis biopsy bone marrow aspiration, which is required for collecting DTCs, is an invasive diagnostic procedure that should not be performed more often than absolutely necessary. In contrast, analysis of CTCs only requires a few millilitres of venous blood and is thus a far less invasive, repeatable and practical alternative. CTCs can be detected in both primary and metastatic breast cancer. 65 – 85% of all patients with MBC have at least one, and 40 – 50% have at least five CTCs in a 7,5 ml sample of venous blood 6 ,  7 .

Detection of CTCs also has prognostic relevance. As far back as 2004 Cristofallini and his research team showed that the finding of at least five CTCs in 7.5 ml of blood was associated with reduced PFS and overall survival (OS) in patients with MBS 7 . A study by Müller et al. in 2012 using the CELLSEARCH ® -Systems 8 and a pooled analysis of almost 2000 patients by Bidard and colleagues in 2014 9 showed similar results. Moreover, the SUCCESS study group demonstrated that the detection of CTCs both before and after adjuvant chemotherapy was associated with reduced disease-free survival and overall survival 10 . Most recently, in 2016, a pooled analysis of 3173 patients has concluded that the presence of CTCs at initial diagnosis of breast carcinoma is associated with worse prognosis 11 . To date however CTC analysis has not become part of, and these study findings have thus not yet influenced, routine clinical practice.

The role of CTC prevalence, dynamics and phenotype as predictive factors for disease prognosis and the treatment response, and the exact mechanisms of cell dissemination and metastasis formation are subject to current fundamental research and clinical study.

Numerous studies have shown that the HER2 and HR expression phenotype of solid metastases may differ from that of the primary tumour 12 ,  13 . This phenotype discordance is already taken into account in clinical practice 1 . DTCs and CTCs also do not always demonstrate the exact phenotype of their primary tumour. Similar to the discordance of HR and HER2 expression of solid metastases, numerous studies have shown discrepant phenotypes between solid tumour tissue, i.e. primary tumour and/or metastases, and CTCs 14 ,  15 ,  16 ,  17 . A recent study showed that discordance of HER2 expression between primary tumour and CTCs was associated with the histological subtype and HR status of the primary tumour as well as with the absolute number of detected CTCs in 7.5 ml of blood 18 . Treatment decisions are however currently still governed by the phenotype of the primary tumour. At least one additional biopsy of a solid metastasis with immunohistological analysis for HR and HER2 expression is recommended in order to re-evaluate the treatment regimen and if necessary adapt it to a discordant phenotype 19 .

One study that is kinky relevant is the S0500 study of the Southwest Oncology Group (SWOG) that investigated the role of CTCs in MBC. No significant improvement of PFS or OS was achieved in patients with MBC with at least five CTCs at the beginning of treatment whose treatment regimens were changed after one cycle if there was no reduction in CTC count below 5 per 7.5 ml of blood. This very early regimen change did not improve prognosis, however it may have improved therapy guidance, reducing toxicity. In addition, the effectiveness of a new treatment regimen is perhaps questionable in the context of an indeed very early regimen change in the absence of a falling CTC count.

The role of CTCs and their phenotype discordance with respect to the primary tumour therefore continue to be further evaluated, especially since CTCs potentially constitute a simple, repeatable and non-invasive method of tumour characterisation. With this so-called “liquid biopsy” tumour heterogeneity and changes in tumour biology during the course of disease could potentially be analysed repeatedly. Adaption and potential optimisation of treatment strategies could then occur without the need for invasive biopsy (various) of solid metastases.

Current clinical studies

In the COMETI P2 study (Daniel F Hayes, M. D., University of Michigan Cancer Center) a CTC-ETI (endocrine therapy index) is calculated in order to predict response to hormone therapy. If prognosis for treatment response is poor chemotherapy would be favoured over endocrine therapy 20 . The CTC-ETI is calculated using quantitative CTC detection and CTC phenotype. The assumption is that high rates of ER and Bcl2 expression are associated with better response to endocrine therapy, while high rates of HER2 and Ki67 expression are associated with worse response. The results of this “proof of principle” study are intended to generate a further study whose aim would be to establish the CTC-ETI in HR positive, HER2 negative MBC.

Another current study concept is the CirCé01 study (Prof. Jean-Yves Pierga, Institut Curie, Paris) 21 . This study is analysing whether a treatment regime change in the absence of CTC reduction under systemic treatment has a positive effect on treatment response. Patients with MBC and disease progression after second-line chemotherapy and with at least 5 CTCs/7.5 ml blood are randomised 1 : 1 to a CTC or control arm. In the CTC arm CTC analysis is performed after the first cycle of each additional chemotherapy course. If there is inadequate reduction of CTCs the chemotherapy regime is changed. This clinical study is based on the assumption that the absence of CTC reduction after the first cycle of a given chemotherapy regime predicts inadequate treatment response. In the previously mentioned, similarly designed, randomised S0500 study no significant improvement in PFS or OS could be demonstrated for patients with MBC who had a chemotherapy regime change due to persistence of at least 5 CTCs in 7.5 ml of blood 21 days after treatment was commenced 22 . There is therefore a need for further clinical studies to more clearly define the role of CTCs in routine clinical practice.

The French STIC CTC study (Prof. Jean-Yves Pierga, Institut Curie, Paris) is a randomised trial where the choice of first-line treatment of HR positive MBC is made according to the number of detected CTCs. In the CTC arm patients with < 5 CTCs/7.5 ml blood receive endocrine treatment and those with ≥ 5 CTCs/7.5 ml are treated with chemotherapy. In the control arm the treatment regime is chosen by the principal investigator. The aim of this “non-inferiority” study is to prove that CTC-based treatment decision-making is not detrimental to PFS. The study aims to recruit a total of 994 patients in France 23 .

The DETECT study conducted by the DETECT study group is a further important related study concept ( Fig. 1 ). Treatment decisions in this worldwide largest study program on MBC are based on CTC detection and their phenotyping, with CTC HER2 expression having particular importance. Patients with HER2 negative MBC are screened for the presence of circulating tumour cells. Patients with HER2 positive CTCs enter the DETECT III study and are randomised to either standard chemotherapy or endocrine therapy with or without targeted HER2 treatment with lapatinib. Where only HER2 negative CTCs are present postmenopausal patients with HR positive MBC receive combination therapy with the mTOR inhibitor everolimus and endocrine therapy (DETECT IVa). If chemotherapy is indicated these patients and those with triple negative MBC are given monochemotherapy with the halichondrin B analogue eribulin (DETECT IVb). The DETECT III and DETECT IV studies are sponsored by the University Hospital Ulm represented by Prof. Dr. Wolfgang Janni, director of the University Womenʼs Hospital, Ulm. The head of clinical trials for the DETECT III and IV studies is Prof. Dr. Tanja Fehm (University Womenʼs Hospital, Düsseldorf). Both studies are planned to end in 2021.

Fig. 1

 The DETECT study concept. The figure shows the treatment concept for the DETECT III, IV and V studies.

The DETECT V study extends on DETECT III and IV evaluating treatment strategies in HER2 positive and HR positive MBC. Here too the detection of CTCs and evaluation of their potential predictive value play a central role. Patients are randomised 1 : 1 to receive dual targeted HER2 therapy with pertuzumab and trastuzumab in combination with chemotherapy or endocrine therapy. The primary outcome of this phase III study is the safety and tolerability of both treatment arms (evaluated by the presence of and unwanted side-effects). In addition, using an “endocrine responsiveness score” (ERS), the study aims to derive a score based on CTCs and their oestrogen receptor and HER2 expression with which response to endocrine treatment could be predicted. Similar to the above-mentioned COMETI P2 study, this ERS is based on the assumption that strong oestrogen receptor expression is associated with a high response rate to endocrine therapy, and strong HER2 expression with a low response rate. The aim is to avoid chemotherapy – associated with worse effects on quality of life – in patients with potentially good response to an endocrine treatment regime. The DETECT V study is also sponsored by the University Hospital Ulm represented by Prof. Dr. Wolfgang Janni, director of the University Womenʼs Hospital, Ulm; head of clinical trails is Prof. Dr. Jens Huober (University Womenʼs Hospital, Ulm). Planned study end is 2021.

Analysing CTCs at molecular level is an important aspect in establishing them as prognostic and/or predictive markers. In this respect it must be particularly highlighted that DETECT study program is supported by numerous translational research projects. These attempt to identify further markers (or mutations) that may contain additional predictive and prognostic information, thus enabling a more specific tumour characterisation via “liquid biopsy”. One area of interest of the DETECT studyʼs translational research program is the analysis of phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K)-Akt signal transduction pathway. Mutations in this area appear to be responsible for carcinogenesis and resistance to targeted HER2 therapies 24 ,  25 . It has already been demonstrated that these mutations may occur discordantly between primary tumour and solid metastases 26 and, e.g. as gain-of-function mutations, may occur in metastases only later in the course of disease leading to acquired resistance to targeted HER2 treatments. As part of DETECTʼs translational research HER2 positive CTCs from patients with HER2 negative MBC are analysed for the presence of active PI3K-Akt mutations using SNaPshot technology. This may help explain disease progression in patients with HER2 positive CTCs despite the use of targeted HER2 treatment. Other translational research in the context of the DETECT study is investigating the expression of epithelial-mesenchymal transition (EMT) markers and tumour suppressor genes (e.g. LKB1) on CTCs, and the mechanisms of resistance to anoikis commonly found in tumour cells (programmed cell death due to loss of cell-matrix contact).

The DETECT study program also forms the basis of the current collaborative translational research project “DETECT CTC: Detection and molecular characterization of circulating tumor cells and cell-free nucleic acids in advanced breast cancer in the context of tumor heterogeneity”, which is supported by German Cancer Aid. The aim of the DETECT-CTC research projects is to use innovative methods and experimental approaches to isolate CTCs and circulating free nucleic acids in order to determine their suitability as a “liquid biopsy” for ascertaining the biological characteristics of advanced breast cancers and as predictive markers for treatment response and monitoring, with the ultimate aim of further optimising and personalising cancer treatment. Another important aspect is the comparison of mutations found in CTCs with circulating free nucleic acids. A further important aspect of DETECT-CTC is the clinical validation of selected biomarkers and test methods for the various breast cancer subtypes, for which all biomaterial collected during the DETECT studies program is used. Various subprojects of DETECT-CTC deal with the following topics:

Evaluation of DNA damage and repair markers on CTCs for the prediction of treatment response in triple-negative advanced breast cancer

Molecular characterisation (stem cell markers, markers for epithelial-mesenchymal transition) of heterogeneous CTC populations from metastatic breast carcinoma patients treated according to different strategies

Evaluation of the origins and molecular causes of resistance to endocrine therapy at the level of individual CTCs from patients with advanced breast cancer

Comparison of phenotypic expression of markers on CTCs, disseminated tumour cells from bone marrow, primary tumour and metastases in patients with metastatic breast cancer

Molecular characterisation of circulating free DNA and microRNA in blood and microDNA from CTCs in patients with metastatic breast cancer

Studies of the microevolution of resistant subclones in metastatic breast cancer through single cell analysis of CTCs

DETECT-CTC offers the unique possibility to analyse blood samples and genetic material collected repeatedly from patients with MBC in the course of their cancer treatment within the controlled environment of a large clinical study using the latest combined research methods, thus making an important contribution towards the establishment of individualised treatment strategies.

Circulating Tumour DNA

In addition to CTCs circulating tumour DNA (ctDNA) is also the focus of current research. Circulating cell-free DNA (ccfDNA) was first described in healthy people over 70 years ago 27 . Increased amounts of ccfDNA are found in various physiological and pathological states such as inflammatory reactions, tissue trauma and cancers 28 ,  29 . As is the case with CTCs, in 2002 Sozzi and research team demonstrated increased amounts of ccfDNA in patients with bronchial carcinoma compared to healthy controls 30 . As with CTCs, chemotherapy can reduce circulating DNA. This led to the assumption that ccfDNA, which contains tumour-specific changes and therefore constituting so-called ctDNA, could also be used as a biomarker or even for screening 31 .

Significant amounts of ctDNA has been detected in both early and metastatic breast carcinoma 32 . Increased amounts of ctDNA are associated with worse prognosis. Dawson and colleagues even postulated that monitoring ctDNA might be a more sensitive method of tumour load monitoring than CTCs or CA 15-3 33 . In contrast Heidary and colleagues found no correlation between tumour load and ctDNA 34 . Further studies are therefore necessary to define the role of ctDNA more precisely. As demonstrated for CTCs, however, it is not only the absolute amount of detected ctDNA that is relevant. Somatic mutations relevant to treatment response and disease prognosis can also be detected. Mutation rates concordant to those in tumour tissue have been found in the tumour suppressor gene TP53 and in PIK3CA, which plays an important role in the PI3K signal transduction pathway 35 ,  36 . These results support the hypothesis that ctDNA reflects characteristics of the primary tumour on the one hand, and on the other hand can show characteristics of metastases that differ from the primary tumour.

The BELLE 2 and 3 studies are two important trials investigating the clinical relevance of ctDNA. The BELLE 2 study is a randomised trial analysing the efficacy of a combination treatment consisting of fulvestrant ± buparlisib, a PI3K inhibitor, in postmenopausal patients with HER2 negative and HR positive MBC with progression following treatment with an aromatase inhibitor. In a subgroup analysis it was shown that patients with proven PI3K mutation in their ctDNA benefited significantly from the combination therapy (median PFS of 7.0 vs. 3.2 months; p < 0.001). A similar survival advantage was not found in patients without ctDNA PI3K mutation (median PFS in both groups 6.8 months; p = 0.642) 37 . In contrast, in the BELLE 3 study patients were randomised after showing disease progression under endocrine combination therapy with an mTOR inhibitor 38 . Median PFS was 3.9 months in patients who received combination therapy with buparlisib plus fulvestrant, compared to median PFS of 1.8 months in patients who received only fulvestrant. In patients with a PIK3CA mutation PFS was 4.7 months in the buparlisib arm compared to 1.6 months in the placebo arm 39 .

Another important target in HR positive breast carcinoma is the oestrogen receptor α (ESR1) 40 . Increased rates of ESR1 mutations, which are associated with resistance to endocrine therapy, have been found especially in MBC 41 ,  42 . In addition to solid tumour tissue these mutations can also be found in ctDNA 43 . In a secondary analysis of the BOLERO 2 study, baseline sample ctDNA from 541 postmenopausal patients with HR positive, HER2 negative MBC was analysed for two known ESR1 mutations (Y537S and D538G). 156 patients (28.8%) had at least one of the two mutations 44 and these were associated with reduced overall survival (32.1 months with wild type vs. 15.2 months with mutated alleles).

HER2 receptor expression also has prognostic relevance in MBC. In a recent study Ma et al. were able to demonstrate overexpression of HER2 on ctDNA analysis 45 . However ctDNA-based analysis showed HER2 overexpression in only 13 of 18 patients with HER2 positive MBC. Further studies are therefore needed to establish this method for detecting HER2 expression.

In summary, ctDNA analysis appears not only to allow monitoring of malignant disease but also to reflect important tumour characteristics. With this method it is possible to detect mutations that are important for identifying treatment resistance or which may constitute possible therapeutic targets. The PRAEGNANT network (Prospective Academic Translational Research Network for the Optimization of Oncological Health Care Quality in the Advanced Therapeutic Setting) is one of the worldwide largest networks focusing on acquiring ctDNA samples and other relevant biomarkers (CTCs, RNA, proteins etc.) in MBC. The study documents treatment course, treatment response, toxicity, comorbidities and quality of life. Aims include improving treatment of metastatic breast carcinoma, generating appropriate study designs and selecting patients for study participation 46 .

Schematic illustration of the extraction of CTCs and ctDNA and their potential uses.

microRNA

In addition to DTCs, CTCs and ctDNA, microRNAs (miRNAs) are also playing an increasing role in research on minimal residual disease. miRNAs are small, non-coding molecules of approximately 21 – 25 nucleotide length that regulate the transcription of various genes through binding the complementary base sequences of not yet translated messenger RNA molecules 47 . Active miRNAs are those corresponding to whichever genes are being regulated in the cell at a given time.

miRNA is not only detectable in cells but similar to CTCs and ctDNA is found in peripheral blood. There are numerous different miRNAs of which only a few are thought to be associated with breast carcinoma. One of the focuses of research is to measure miRNAs repeatedly in the course of treatment. If an miRNA thought to be associated with breast carcinoma is raised at the start of therapy and subsequently falls, treatment response can be assumed. If the miRNA level rises, however, treatment nonresponse can be suspected. Currently treatment decisions cannot be made on the basis of miRNAs. Current research rather involves establishing which miRNAs can be viewed as “oncogenic” and which as “tumour suppressive”. The following two research projects are illustrative:

Roth et al. studied the potentially breast cancer-associated miRNAs miR10b, miR34a, miR141 and miR155 in the serum of women with breast cancer and in a healthy control group 48 . 89 breast cancer patients (59 = M0; 30 M1) and 29 healthy women were recruited in this pilot study with analysis using the TaqMan MicroRNA assay. The relative serum concentrations of total RNA (p = 0.0001) and miR155 (p = 0.0001) differed significantly between the M0 patients and the healthy control group. Using miR10b, miR34a and miR155 concentrations M1 patients could be differentiated from healthy women ( miR10b : p = 0.005; miR34a : p = 0.001; miR155 : p = 0.008).

In breast cancer patients changes in total amount of RNA and amounts of miR10b, miR34a and mitR155 correlated with the presence of manifest metastases (total RNA: p = 0.0001; miR100b : p = 0.01; miR34a : p = 0.003; miR155: p = 0.002). Also, M0 patients with more advanced stage tumours (pT3-pT4) had significantly higher amounts of total RNA and miR34a than patients with lower stage tumours (total RNA: p = 0.0001; miR34a : p = 0.01). The authors concluded that patients with tumour progression show a rise in tumour-associated RNA.

Madhaven et al. studied the miRNA in plasma of 40 patients with MBC using “TaqMan low density arrays” following previous validation studies on 237 MBC patients 49 . They were able to show that the detection of miR200a, miR200b, miR200c, miR210, miR215 and miR486 -5p was significantly associated with the occurrence of metastasis within two years of breast cancer diagnosis. They also identified 16 miRNAs that were significantly associated with OS and a further 11 associated with PFS.

Further studies are required both to identify MBC-associated miRNAs and to evaluate their role in the clinical course of breast cancer.

Conclusion

The analysis of relevant tumour characteristics and the evaluation of disease course and treatment response are immensely important for the prognosis and further treatment decision-making in MBC. In the context of potentially changing tumour characteristics repeated invasive examination of the primary tumour and/or solid metastases is not always a viable option. In contrast CTCs, ctDNA and miRNA, which contain relevant complimentary information, can be analysed as often as necessary in the form of a so-called “liquid biopsy”. This enables not the only potential monitoring of disease course and treatment response but also repeated tumour characterisation for future treatment decisions.

The long-term goal of CTC/ctDNA/miRNA-based evaluation of metastatic breast carcinoma is the establishment of personalised, targeted and thus efficient tumour therapy that increases PFS and/or OS and improves the quality of life of affected patients.

Einleitung

Die Therapie des metastasierten Mammakarzinoms (MBC) befindet sich dank zahlreicher neuer Behandlungskonzepte und Therapeutika in ständiger Weiterentwicklung. Dennoch ist das MBC weiterhin mit einer hohen Mortalität und Einschränkung der Lebensqualität verbunden. Die Entscheidung, welche Therapie erkrankte Patientinnen erhalten sollen, stellt Arzt und Patientin gleichermaßen vor eine große Herausforderung. Aktuelle Therapieregime orientieren sich am Phänotyp des Tumors, wie dem Hormonrezeptor-(HR-) oder HER2-Rezeptorstatus, der hauptsächlich zum Zeitpunkt der Primärdiagnose erfasst wurde. Mögliche phänotypische Veränderungen des Tumorgewebes wurden in der Vergangenheit oft nicht erfasst und daher auch bei Nichtansprechen auf eine Therapie nicht berücksichtigt. Da sich Tumoreigenschaften jedoch im Laufe der Brustkrebserkrankung verändern können, empfehlen aktuelle Behandlungsleitlinien die zusätzliche Charakterisierung von zum Beispiel soliden Metastasen 1 . Diese Empfehlung ist jedoch mit der Durchführung von weiteren invasiven Biopsien verbunden, die technisch nicht immer möglich sind und bei Patientinnen auf eingeschränkte Compliance stoßen. Somit bleibt die sequenzielle HR- bzw. HER2-Bestimmung aus und die Tumorheterogenität fließt nicht in die Therapieentscheidung ein 2 , sodass die Therapie möglicherweise nicht effizient, da nicht zielgerichtet, ist. Dies gilt auch für andere tumorbiologische Marker.

Mit dem Ziel, das progressionsfreie Überleben (PFS) und die Lebensqualität (LQ) zu verbessern, werden im Rahmen verschiedener Studienkonzepte Methoden evaluiert, die es ermöglichen, repetitive und vor allem weniger invasive Tumorcharakterisierungen durchzuführen. Im Sinne einer sogenannten „liquid biopsy“ bieten Biomarker wie zirkulierende Tumorzellen (CTC) und zirkulierende Tumor-DNA aus dem venösen Blut eine vielversprechende Alternative zur Untersuchung der Tumoreigenschaften (HR-/HER2-Status), des Therapieansprechens und des Erkrankungsverlaufs.

Damit soll die Etablierung von individuellen, personalisierten und dadurch effektiveren Therapiestrategien ermöglicht werden.

Biologische und klinische Relevanz

Im Jahr 1869 wurden CTCs von Thomas Ashworth erstmalig beschrieben. Zusammen mit disseminierten Tumorzellen (DTC) im Knochenmark werden sie als „minimal residual disease“ (minimale Resterkrankung) bezeichnet und scheinen der Ursprung für die Entstehung solider Fernmetastasen zu sein 3 . Beim primären Mammakarzinom konnte die prognostische Bedeutung der DTCs bereits demonstriert werden 4 . Darüber hinaus wurde in einer Follow-up-Studie gezeigt, dass der Nachweis von DTCs im Knochenmark nach Abschluss einer adjuvanten Systemtherapie mit einem höheren Rezidivrisiko verbunden ist 5 . DTCs scheinen daher grundsätzlich geeignet für die Verlaufskontrolle der Brustkrebserkrankung und ihre Prognose zu sein. Wie bei der Biopsie von Metastasen ist die zur Gewinnung der DTCs erforderliche Knochenmarkpunktion jedoch eine invasive Untersuchungsmethode, die nicht beliebig oft durchgeführt werden sollte. Im Gegensatz dazu ist die Analyse von CTCs, die sich durch Abnahme von wenigen Millilitern venösen Bluts gewinnen lassen, eine weniger invasive, wiederholbare und somit praktikablere Alternative. CTCs sind sowohl beim primären als auch beim metastasierten Mammakarzinom nachweisbar. 65 – 85% aller Patientinnen mit MBC haben mindestens eine, und 40 – 50% aller Patientinnen mit MBC haben sogar mindestens 5 CTCs in einer Probe von 7,5 ml venösen Blutes 6 ,  7 .

Der Nachweis von CTCs hat ebenfalls eine prognostische Wertigkeit. So zeigte bereits im Jahre 2004 die Arbeitsgruppe um Cristofallini, dass bei Patientinnen mit MBC der Nachweis von mindestens 5 CTCs in 7,5 ml Blut mit einem verkürzten PFS und Gesamtüberleben (OS) verbunden ist 7 . Ähnliche Ergebnisse wurden 2012 von Müller et al. mithilfe des CELLSEARCH ® -Systems 8 und 2014 in einer gepoolten Analyse von fast 2000 Patientinnen von Bidard und Kollegen beschrieben 9 . Darüber hinaus konnte die SUCCESS-Studiengruppe demonstrieren, dass der Nachweis von CTCs sowohl vor als auch nach adjuvanter Chemotherapie mit einem reduzierten krankheitsfreien Überleben sowie Gesamtüberleben assoziiert ist 10 . Schließlich wurde im Jahr 2016 in einer gepoolten Analyse aus 3173 Patientinnen beschrieben, dass die Präsenz von CTCs bei Erstdiagnose eines Mammakarzinoms mit einer verschlechterten Prognose einhergeht 11 . CTC-Analysen werden jedoch bislang nicht im klinischen Alltag durchgeführt, sodass diese Untersuchungsergebnisse aktuell noch nicht in der klinischen Routine berücksichtigt werden.

Welche Rolle die Prävalenz von CTCs, ihre Dynamik und ihr Phänotyp als prädiktive Faktoren für die Prognose der Erkrankung und ein mögliches Therapieansprechen haben, sowie der genaue Mechanismus der Zelldisseminierung und der Entstehung von Metastasen sind Gegenstand aktueller Grundlagenforschung und klinischer Untersuchungen.

Dass sich der Phänotyp solider Metastasen bezüglich der HER2- und HR-Expression vom Primärtumor unterscheiden kann, wurde bereits mehrfach demonstriert 12 ,  13 . Dieser vom Primärtumor diskordante Phänotyp wird im klinischen Alltag bereits berücksichtigt 1 . Darüber hinaus reflektieren jedoch sowohl DTCs als auch CTCs nicht immer den exakten Phänotyp ihres Primärtumors. In zahlreichen Untersuchungen konnten, analog zur Diskordanz der HR- bzw. HER2-Expression solider Metastasen, ähnliche Ergebnisse für die Diskrepanz des Phänotyps zwischen solidem Tumorgewebe, d. h. Primärtumor und/oder Metastasen, und CTCs demonstriert werden 14 ,  15 ,  16 ,  17 . In einer weiteren aktuellen Untersuchung wurde gezeigt, dass die Diskordanz der HER2-Expression zwischen Primärtumor und CTCs mit dem histologischen Subtyp und dem HR-Status des Primärtumors sowie der absoluten Menge an detektierten CTCs in 7,5 ml Blut assoziiert ist 18 . Aktuelle Therapieentscheidungen richten sich jedoch nach dem Phänotyp des Primärtumors. Mindestens eine weitere Biopsie solider Metastasen mit immunhistologischer Bestimmung der HR- bzw. HER2-Expression wird zumindest empfohlen, um ein Therapieregime reevaluieren und ggfs. an einen möglicherweise abweichenden Phänotyp anpassen zu können 19 .

Eine klinisch relevante Studie ist die S0500-Studie der Southwest Oncology Group (SWOG), welche die Rolle der CTCs beim MBC untersucht hat. Hierbei zeigte sich keine signifikante Verbesserung des PFS bzw. OS bei Patientinnen mit MBC und mindestens 5 CTCs zu Therapiebeginn, bei welchen das Regime nach einem Therapiezyklus geändert wurde, falls es zu keiner CTC-Abnahme unter 5 CTCs pro 7,5 ml Blut kam. Dieser sehr frühe Wechsel führte zwar nicht zu einer Prognoseverbesserung, aber gegebenenfalls zu einer verbesserten Therapieführung mit verminderter Toxizität. Darüber hinaus stellt sich die Frage nach der Effektivität des neuen Therapieregimes im Falle eines doch sehr frühen Wechsels bei Ausbleiben einer CTC-Abnahme.

Die Rolle von CTCs und die Diskordanz ihres Phänotyps vom Primärtumor werden daher weiterhin genauer analysiert, zumal CTCs potenziell die Möglichkeit einer einfachen, wiederholbaren und wenig invasiven Untersuchung zur Tumorcharakterisierung darstellen. Im Sinne einer sogenannten „liquid biopsy“ wäre es möglich, die Tumorheterogenität und die Veränderung der Tumorbiologie im Erkrankungsverlauf wiederholt zu überprüfen. Die Anpassung und potenzielle Optimierung der Therapiestrategie könnte dann ohne invasive Biopsie (verschiedener) solider Metastasen erfolgen.

Aktuelle klinische Studien

Im Rahmen der COMETI P2-Studie (Daniel F. Hayes, M. D., University of Michigan Cancer Center) wird ein CTC-ETI (endocrine therapy index) berechnet, um das Ansprechen auf eine Hormontherapie vorherzusagen. Im Falle eines schlechten prognostizierten Ansprechens würde eine Chemotherapie gegenüber einer endokrinen Therapie bevorzugt werden 20 . Der CTC-ETI wird mithilfe des quantitativen CTC-Nachweises und des Phänotyps der CTCs berechnet. Er basiert auf der Annahme, dass eine hohe ER- und Bcl-2-Expressionsrate mit einer höheren und eine hohe HER2- und Ki67-Expressionsrate mit einem niedrigeren Ansprechen auf eine endokrine Therapie assoziiert ist. Aus den Ergebnissen dieser „proof-of-principle“-Studie soll eine weitere Studie generiert werden, die den CTC-ETI beim HR-positiven, HER2-negativen MBC etabliert.

Ein weiteres aktuelles Studienkonzept ist die CirCé01-Studie (Prof. Jean-Yves Pierga, Institut Curie, Paris) 21 . Hierbei wird untersucht, ob der Wechsel eines Therapieregimes nach ausbleibender CTC-Abnahme unter einer Systemtherapie einen positiven Effekt auf das Therapieansprechen hat. In dieser Studie werden Patientinnen mit MBC und Progress nach der Zweitlinien-Chemotherapie und Nachweis von mindestens 5 CTCs/7,5 ml Blut 1 : 1 zu einem CTC- bzw. Kontrollarm randomisiert. Im CTC-Arm erfolgt nach jedem 1. Zyklus einer folgenden Chemotherapie-Linie eine CTC-Analyse. Bei unzureichender CTC-Abnahme erfolgt ein Wechsel des Chemotherapie-Regimes. Diese klinische Studie basiert auf der Annahme, dass bei fehlender CTC-Abnahme nach dem 1. Zyklus eines Chemotherapie-Regimes mit einem unzureichenden Therapieansprechen zu rechnen ist. Im Rahmen der bereits erwähnten ähnlich konzipierten randomisierten S0500-Studie konnte keine signifikante Verbesserung des PFS oder OS bei Patientinnen mit MBC nach Wechsel des Chemotherapie-Regimes bei persistierender Anzahl von mindestens 5 CTCs in 7,5 ml Blut 21 Tage nach Therapiebeginn nachgewiesen werden 22 . Es bedarf daher weiterer klinischer Untersuchungen, um die Rolle von CTCs für den klinischen Alltag genauer zu definieren.

Die französische STIC CTC-Studie (Prof. Jean-Yves Pierga, Institut Curie, Paris) ist eine randomisierte Studie, bei der sich die Entscheidung über die Erstlinientherapie beim HR-positivem MBC an der Anzahl der nachgewiesenen CTCs orientiert. Im CTC-Arm erhalten die Patientinnen bei Nachweis von < 5 CTCs/7,5 ml Blut eine endokrine Therapie, bei ≥ 5 CTCs/7,5 ml Blut eine Chemotherapie. Im Kontrollarm wird das Therapieregime vom Prüfarzt festgelegt. Ziel dieser „non-inferiority“-Studie ist es, nachzuweisen, dass die CTC-basierte Therapieentscheidung keinen Nachteil in Hinsicht auf das PFS darstellt. Insgesamt sollen 994 Patientinnen in Frankreich rekrutiert werden 23 .

Ein wichtiges Studienkonzept sind in diesem Zusammenhang die DETECT-Studien der DETECT-Studiengruppe ( Abb. 1 ). Als weltweit größtes Studienprogramm für MBC basieren hier Therapieentscheidungen auf der CTC-Detektion und deren Phänotypisierung, wobei insbesondere die HER2-Expression der CTCs berücksichtigt wird. In einem gemeinsamen Screening werden Patientinnen mit HER2-negativem MBC auf die Präsenz zirkulierender Tumorzellen untersucht. Patientinnen mit HER2-positiven CTCs werden im Rahmen der DETECT-III-Studie zu einer Standard-Chemo- oder endokrinen Therapie mit oder ohne einer HER2-zielgerichteten Therapie mit Lapatinib randomisiert. Bei ausschließlich HER2-negativen CTCs erhalten postmenopausale Patientinnen mit HR-positivem MBC eine Kombinationstherapie mit dem mTOR-Inhibitor Everolimus und endokriner Therapie (DETECT IVa). Besteht eine Indikation zur Chemotherapie, erhalten diese Patientinnen, wie auch Patientinnen mit triple-negativem MBC, eine Monochemotherapie mit dem Halichondrin B-Analogon Eribulin (DETECT IVb). Sponsor für die DETECT-III- und DETECT-IV-Studie ist das Universitätsklinikum Ulm, vertreten durch Prof. Dr. Wolfgang Janni, Direktor der Universitätsfrauenklinik Ulm. Leiterin der klinischen Prüfung der DETECT-III- und -IV-Studie ist Frau Prof. Dr. Tanja Fehm (Universitätsfrauenklinik Düsseldorf). Geplantes Studienende für beide Studien ist 2021.

Abb. 1

 Das DETECT-Studienkonzept. Die Abbildung zeigt das Behandlungskonzept der DETECT-III-, -IV- und -V-Studie.

Ergänzend zu DETECT III und IV werden in der DETECT-V-Studie Therapiestrategien beim HER2- und HR-positiven MBC evaluiert. Auch hier spielt die Detektion von CTCs und die Evaluation ihrer potenziellen prädiktiven Wertigkeit eine zentrale Rolle. Patientinnen werden 1 : 1 zu einer dualen HER2-zielgerichteten Therapie aus Pertuzumab und Trastuzumab in Kombination mit einer Chemotherapie oder endokrinen Therapie randomisiert. Im Rahmen dieser Phase-III-Studie wird die Sicherheit und Verträglichkeit beider Therapiearme (erfasst über die Präsenz von unerwünschten Nebenwirkungen) als primärer Endpunkt untersucht. Darüber hinaus soll mittels eines „endocrine responsiveness scores“ (ERS) ein Score auf Basis von CTCs und ihrer Östrogenrezeptor- und HER2-Expression erhoben werden, mithilfe dessen das Ansprechen auf eine endokrine Therapie prognostiziert werden kann. Ähnlich wie bei der bereits erwähnten COMETI P2-Studie basiert dieser ERS auf der Annahme, dass eine starke Östrogenrezeptorexpression mit einer hohen und eine starke HER2-Expression mit einer niedrigen Ansprechrate auf eine endokrine Therapie verbunden sind. Ziel dabei ist, bei Patientinnen mit einem potenziell guten Ansprechen auf ein endokrines Therapieregime eine Chemotherapie, die mit einer stärkeren Beeinträchtigung der Lebensqualität verbunden ist, zu vermeiden. Sponsor für die DETECT-V-Studie ist ebenfalls das Universitätsklinikum Ulm, vertreten durch Prof. Dr. Wolfgang Janni, Direktor der Universitätsfrauenklinik Ulm; Leiter der klinischen Prüfung ist Prof. Dr. Jens Huober (Universitätsfrauenklinik Ulm). Geplantes Studienende ist 2021.

Ein wichtiger Aspekt bei der Etablierung von CTCs als prognostischer und/oder prädiktiver Marker ist die Untersuchung von CTCs auf molekularer Ebene. Hierbei ist besonders hervorzuheben, dass das DETECT-Studienprogramm von zahlreichen translationalen Forschungsprojekten begleitet wird. Dadurch sollen weitere Marker (bzw. Mutationen) identifiziert werden, die zusätzliche prädiktive und prognostische Informationen beinhalten und somit eine spezifischere Tumorcharakterisierung mittels „liquid biopsy“ ermöglichen. Ein Schwerpunkt im Rahmen des translationalen Forschungsprogramms der DETECT-Studien ist die Analyse des Phosphatidylinositol-3-kinase (PI3k)/Akt-Signaltransduktionsweges. Hier auftretende Mutationen scheinen für die Kanzerogenese und die Resistenz gegenüber HER2-zielgerichteten Therapien verantwortlich zu sein 24 ,  25 . Schließlich wurde bereits demonstriert, dass diese Mutationen diskordant zwischen dem Primärtumor und soliden Metastasen auftreten können 26 , beispielsweise als Gain-of-Function-Mutationen erst im Verlauf der Erkrankung in Metastasen auftreten und zu einer erworbenen Resistenz gegenüber einer HER2-gerichteten Therapie führen können. Im Rahmen der translationalen Forschung des DETECT-Konzeptes werden mithilfe der SNaPshot-Technologie HER2-positive CTCs von Patientinnen mit HER2-negativem MBC auf das Vorhandensein aktivierender PI3K/Akt-Mutationen untersucht, um möglicherweise einen Erkrankungsprogress bei Patientinnen mit HER2-positiven CTCs trotz HER2-zielgerichteter Therapie erklären zu können. Weitere translationale Fragestellungen, welche im Rahmen der DETECT-Studien untersucht werden, befassen sich mit der Expression von Epithelial-mesenchymal-Transitions-(EMT-)Markern und Tumorsuppressorgenen (z. B. LKB1) auf CTCs sowie Untersuchungen zu Mechanismen zur in Tumorzellen häufig gefundenen Resistenz gegen Anoikis (programmierter Zelltod aufgrund des Verlusts von Zell-Matrix-Kontakt).

Das DETECT-Studienprogramm stellt auch die Grundlage des aktuell von der Deutschen Krebshilfe geförderten kollaborativen translationalen Forschungsprojekts „DETECT CTC: Detection and molecular characterization of circulating tumor cells and cell-free nucleic acids in advanced breast cancer in the context of tumor heterogeneity“ dar. Ziel der im Rahmen von DETECT-CTC zusammengefassten Forschungsprojekte ist es, durch die Anwendung innovativer Verfahren und Versuchsansätze zur Isolierung und Charakterisierung von CTCs und frei zirkulierender Nukleinsäuren herauszufinden, inwieweit sie sich als „Liquid biopsy“ zur Beurteilung der biologischen Eigenschaften fortgeschrittener Brustkrebstumore bzw. als prädiktive Marker für Therapieansprechen und Monitoring eignen, um die Krebsbehandlung optimieren und weiter personalisieren zu können. Ein wichtiger Aspekt besteht auch darin, CTCs und frei zirkulierende Nukleinsäuren hinsichtlich der vorgefundenen Mutationen zu vergleichen. Ein weiterer wichtiger Aspekt von DETECT-CTC ist die klinische Validierung ausgewählter Biomarker und Testverfahren für die verschiedenen Brustkrebs-Subtypen, für die das im Rahmen des DETECT-Studienprogramms gesammelte umfassende Biomaterial verwendet wird. Folgende Themen werden in den verschiedenen Subprojekten von DETECT-CTC behandelt:

Evaluierung von DNA-Schadens- bzw. -Reparaturmarkern auf CTCs zur Vorhersage des Therapieansprechens bei 3-fach-negativem fortgeschrittenen Brustkrebs

molekulare Charakterisierung (Stammzellmarker, Marker für Epithelial-mesenchymale Transition) heterogener CTC-Populationen von mit unterschiedlichen Therapieansätzen behandelten Patientinnen mit metastasiertem Brustkrebs

Evaluierung von Entstehung und molekularen Ursachen der Resistenz gegenüber endokrinen Therapien auf der Ebene einzelner CTCs von Patientinnen mit fortgeschrittenem Brustkrebs

Vergleich der phänotypischen Markerexpression von CTCs, disseminierenden Tumorzellen aus dem Knochenmark, Primärtumor und Metastasen bei Patientinnen mit metastasiertem Brustkrebs

molekulare Charakterisierung von frei im Blut zirkulierender DNA und microRNAs sowie von microRNAs aus CTCs bei Patientinnen mit metastasiertem Brustkrebs

Untersuchungen zur Mikroevolution resistenter Subklone beim metastasierten Brustkrebs mittels CTC-Einzelzellanalysen

DETECT-CTC bietet die einzigartige Möglichkeit, Blutproben und genetisches Material, welche in der kontrollierten Umgebung einer großen klinischen Studie an Patientinnen mit MBC wiederholt im Verlauf ihrer Krebsbehandlung gesammelt worden sind, mit modernsten kombinierten Forschungsmethoden zu untersuchen und damit einen wichtigen Beitrag für die Etablierung individualisierter Behandlungsansätze zu leisten.

Zirkulierende Tumor-DNA

Neben CTCs steht auch die zirkulierende Tumor-DNA (ctDNA) im Fokus aktueller Forschungsprojekte. Vor mehr als 70 Jahren wurde die zirkulierende zellfreie DNA (ccfDNA) bei gesunden Menschen erstmalig beschrieben 27 . Erhöhte Mengen an ccfDNA sind bei verschiedenen physiologischen und pathologischen Zuständen, wie Entzündungsreaktionen, Gewebetraumata und Krebserkrankungen, nachweisbar 28 ,  29 . Analog zu CTCs konnte im Jahr 2002 die Arbeitsgruppe um Sozzi erhöhte ccfDNA-Mengen bei an einem Bronchialkarzinom erkrankten Patienten im Vergleich zu Gesunden demonstrieren 30 . Der Einsatz einer Chemotherapie kann, wie auch bei CTCs, zu einer Abnahme der zirkulierenden DNA führen. Dies führte zu der Annahme, dass ccfDNA, die tumorspezifische Veränderungen beinhaltet, also eine sogenannte ctDNA ebenfalls als Biomarker oder sogar zum Screening verwendet werden könnte 31 .

Der Nachweis relevanter ctDNA-Mengen gelang auch beim frühen und metastasierten Mammakarzinom 32 . Erhöhte ctDNA-Mengen sind mit einer schlechteren Prognose assoziiert. Die Arbeitsgruppe um Dawson postulierte sogar, dass das Monitoring der ctDNA eine möglicherweise sensitivere Methode zur Überwachung der Tumorlast als CTCs oder das CA 15-3 ist 33 . Im Gegensatz dazu stehen die Ergebnisse von Heidary und Kollegen. Hier konnte keine Korrelation zwischen Tumorlast und ctDNA nachgewiesen werden 34 . Es sind demzufolge weitere Untersuchungen nötig, um die Rolle der ctDNA genauer definieren zu können. Wie schon für die CTCs beschrieben, ist jedoch nicht ausschließlich die absolute Menge an detektierter ctDNA relevant. Somatische Mutationen, die für das Therapieansprechen und die Prognose der Erkrankung von Bedeutung sind, können auch in der ctDNA nachgewiesen werden. So konnten zum Tumorgewebe konkordante Raten von Mutationen des Tumorsuppressorgens TP53 und der PIK3CA, die eine wichtige Rolle im PI3K-Signaltransduktionsweg spielt, nachgewiesen werden 35 ,  36 . Diese Untersuchungsergebnisse unterstreichen die Hypothese, dass die ctDNA einerseits Eigenschaften des Primärtumors reflektiert, andererseits jedoch auch vom Primärtumor abweichende Eigenschaften von Metastasen widerspiegeln kann.

Zwei wichtige Studien zur Untersuchung der klinischen Relevanz der ctDNA sind die BELLE-2- und -3-Studien. Im Rahmen der randomisierten BELLE-2-Studie wurde die Wirksamkeit einer Kombinationstherapie aus Fulvestrant ± Buparlisib, einem PI3K-Inhibitor, bei postmenopausalen Patientinnen mit HER2-negativem und HR-positivem MBC mit Progression nach der Therapie mit einem Aromataseinhibitor analysiert. Im Rahmen einer Subgruppenanalyse konnte gezeigt werden, dass Patientinnen mit nachgewiesener PI3K-Mutation in der ctDNA deutlich von der Kombinationstherapie aus Fulvestrant und Buparlisib profitierten (medianes PFS bei 7,0 vs. 3,2 Monaten; p < 0,001). Ein solcher Überlebensvorteil konnte bei Patientinnen ohne PI3K-Mutation innerhalb der ctDNA nicht nachgewiesen werden (medianes PFS jeweils bei 6,8 Monaten; p = 0,642) 37 . Im Unterschied zur BELLE-2-Studie wurden in der BELLE-3-Studie Patientinnen nach Progress unter endokriner Kombinationstherapie mit einem mTOR-Inhibitor randomisiert 38 . Das mediane PFS betrug 3,9 Monate bei Patientinnen, die eine Kombinationstherapie aus Buparlisib plus Fulvestrant erhielten. Im Vergleich dazu betrug das mediane PFS bei Patientinnen, die nur Fulvestrant erhielten, 1,8 Monate. Unter den Patientinnen mit einer PIK3CA-Mutation betrug das PFS 4,7 Monate im Buparlisib-Arm im Vergleich zu 1,6 Monaten im Placeboarm 39 .

Ein weiterer wichtiger Angriffspunkt beim HR-positiven Mammakarzinom ist der Östrogenrezeptor α (ESR1) 40 . Erhöhte Raten an ESR1-Mutationen, die mit einer Therapieresistenz gegenüber endokrinen Therapien assoziiert sind, konnten insbesondere beim MBC nachgewiesen werden 41 ,  42 . Sie können, neben solidem Tumorgewebe, ebenfalls in der ctDNA nachgewiesen werden 43 . Im Rahmen einer Sekundäranalyse der BOLERO-2-Studie wurde die ctDNA aus Baseline-Proben von insgesamt 541 postmenopausalen Patientinnen mit HR-positivem, HER2-negativem MBC in Bezug auf 2 bekannte ESR1-Mutationen (Y537S und D538G) untersucht. 156 Patientinnen (28,8%) wiesen mindestens eine der beiden ESR1-Mutationen auf 44 . Diese waren mit einem verkürzten Gesamtüberleben assoziiert (32,1 Monate im Wildtyp vs. 15,2 Monate im Falle von beiden mutierten Allelen).

Auch die Expression des HER2-Rezeptors spielt eine prognostisch relevante Rolle beim MBC. In einer aktuellen Untersuchung gelang der Arbeitsgruppe um Ma et al. der Nachweis einer HER2-Überexpression mittels ctDNA-Analyse 45 . Allerdings konnte mittels der ctDNA-basierten Analyse nur bei 13 von 18 Patientinnen mit HER2-positivem MBC eine HER2-Überexpression nachgewiesen werden. Es sind daher weitere Untersuchungen erforderlich, um einen ctDNA-basierten Nachweis einer HER2-Expression zu etablieren.

Zusammenfassend scheinen ctDNA-Analysen nicht nur eine Möglichkeit zur Verlaufskontrolle der Tumorerkrankungen zu sein, sondern reflektieren auch wichtige Tumoreigenschaften. Auf diese Weise ist es möglich, Mutationen, die von Bedeutung für die Identifikation von Therapieresistenzen und möglicher therapeutischer Angriffspunkte sind, zu detektieren. Eines der weltweit größten Netzwerke, welches sich auf Gewinnung von ctDNA-Proben und weiterer relevanter Biomarker (CTCs, RNA, Proteine etc.) beim MBC konzentriert, ist das PRAEGNANT-Netzwerk (Prospective Academic Translational Research Network for the Optimization of Oncological Health Care Quality in the Advanced Therapeutic Setting). Darüber hinaus werden im Rahmen dieser Studie unter anderem Therapieverlauf, Therapieansprechen, Toxizitäten, Komorbiditäten und Lebensqualität erfasst. Ziel dabei ist, die Therapie des metastasierten Mammakarzinoms zu verbessern, geeignete Studiendesigns zu generieren und Patientinnen für diese Studien auszuwählen 46 .

Schematische Darstellung der Entnahme von CTCs und ctDNA und ihre potenzielle Verwendung.

Neben DTCs, CTCs und der ctDNA spielen auch microRNAs (miRNAs) in der Forschung zur Minimal residual Disease eine zunehmende Rolle. miRNAs sind kleine, nicht kodierende Moleküle, die ca. 21 – 25 Nukleotide lang sind und die Transkription verschiedenster Gene regulieren, indem sie die komplementären Basensequenzen der noch nicht translatierten Messenger-RNA-Moleküle binden 47 . Je nachdem, welche Gene gerade in der Zelle reguliert werden, sind die entsprechenden miRNAs aktiv.

Die miRNA ist nicht nur in Zellen nachweisbar, sondern kann ähnlich wie CTCs und die ctDNA auch im Blut durch eine einfache Blutentnahme nachgewiesen werden. Es gibt zahlreiche verschiedene miRNAs, von denen nur bei wenigen vermutet wird, dass sie mit dem Mammakarzinom assoziiert sind. Ansatzpunkt der Forschung ist hierbei unter anderem, dass während einer Therapie wiederholt miRNAs gemessen werden. Wenn eine miRNA, von der man vermutet, dass sie mit dem Mammakarzinom assoziiert ist zu Beginn einer Therapie erhöht ist und diese im Therapieverlauf absinkt, so kann man ein Therapieansprechen vermuten. Steigt die miRNA aber wieder an, so wird vermutet, dass es zu keinem Therapieansprechen kommt. Derzeit können noch keine Therapieentscheidungen auf Basis von miRNAs getroffen werden, vielmehr ist es noch Bestandteil aktueller Forschung, zu etablieren, welche miRNAs als „onkogen“ oder „tumorsuppressiv“ betrachtet werden können. Im Folgenden sollen exemplarisch 2 Forschungsarbeiten genannt werden:

So untersuchten Roth et al. im Serum von an Brustkrebs erkrankten Frauen und einer gesunden Kontrollgruppe die potenziell brustkrebsassoziierten miRNAs miR10b, miR34a, miR141 und miR155 48 . Es wurden 89 Brustkrebspatientinnen (59 = M0; 30 M1) und 29 gesunde Frauen in diese Pilotstudie rekrutiert und die Analysen mittels des TaqMan MicroRNA Assays durchgeführt. Die relative Serumkonzentration der gesamten RNA (p = 0,0001) und der miR155 (p = 0,0001) unterschied sich bei den M0-Patientinnen signifikant von der gesunden Kontrollgruppe. Mittels der Konzentration von miR10b, miR34a und miR155 konnten M1-Patientinnen von den gesunden Frauen unterschieden werden ( miR10b : p = 0,005; miR34a : p = 0,001; miR155 : p = 0,008).

Bei den an Brustkrebs erkrankten Patientinnen korrelierte die Veränderung der gesamten RNA-Menge wie auch der Menge an miR10b -Menge, miR34a und mitR155 mit der Präsenz von manifesten Metastasen (Gesamt-RNA: p = 0,0001; miR100b : p = 0,01; miR34a : p = 0,003; miR155: p = 0,002). Zudem hatten die M0-Patientinnen, sofern sie ein höheres Tumorstadium hatten (pT3-pT4), signifikant höhere Gesamt-RNA- und miR34a -Mengen als Patientinnen mit einem niderigeren Tumorstadium (Gesamt-RNA: p = 0,0001; miR34a : p = 0,01). Die Autoren schlossen daraus, dass sich bei Patientinnen mit einem Tumorprogress ein Anstieg der tumorassoziierten RNA feststellen lässt.

Madhaven et al. untersuchten die miRNA im Plasma von 40 Patientinnen mit MBC mit „TaqMan low density arrays“, nach zuvor erfolgten Validierungsstudien an 237 MBC-Patientinnen 49 .

Sie konnten zeigen, dass der Nachweis von miR200a, miR200b, miR200c, miR210, miR215 und miR486 -5p signifikant mit dem Auftreten von Metastasen innerhalb von 2 Jahren nach Erstdiagnose der Brustkrebserkrankung assoziiert waren. Zudem haben sie 16 miRNAs identifiziert, die signifikant mit dem OS und weitere 11, die mit dem PFS assoziiert waren.

Es bedarf weiterer Untersuchungen, um einerseits MBC-assoziierte miRNAs zu identifizieren und andererseits zu evaluieren, welche Rolle diese jeweils im Verlauf der Bustkrebserkrankung spielen.

Schlussfolgerung

Die Untersuchung relevanter Tumoreigenschaften, die Evaluation des Erkrankungsverlaufs und des bisherigen Therapieansprechens sind von großer Bedeutung für die Prognose und die weiteren Therapieentscheidungen beim MBC. Die invasive Untersuchung des Primärtumors und/oder solider Metastasen stellt bei sich möglicherweise wandelnden Tumorcharakteristika nicht immer eine durchführbare und repetitive Option dar. Demgegenüber stehen CTCs und die ctDNA sowie miRNA, die einerseits relevante komplementäre Informationen beinhalten und andererseits im Sinne einer „liquid biopsy“ beliebig oft untersucht werden können. Dies ermöglicht nicht nur ein potenzielles Monitoring des Erkrankungsverlaufs und des Therapieansprechens, sondern dient auch der repetitiven Tumorcharakterisierung für weitere Therapieentscheidungen.

Langfristiges Ziel der CTC/ctDNA/miRNA-basierten Analyse des metastasierten Mammakarzinoms ist die Etablierung einer personalisierten, zielgerichteten und somit effizienten Tumortherapie, die neben der Verlängerung des PFS und/oder OS auch die Verbesserung der Lebensqualität betroffener Patientinnen erreichen soll.