[The function of NLRP1 in noninfectious pulmonary injury following allogeneic hematopoietic stem cell transplantation].

Objective: To explore the function of NLRP1 in noninfectious pulmonary injury (nonIPI) after allogeneic stem cell transplantation (allo-HSCT) .
Methods: In this study, we established the model of allo-HSCT with C57BL/6 and NLRP(-/-) mouse as recipients. Chimera rate was measured by flow cytometry. The HE staining was used to observe the pathology changes in the lungs. NLRP1 and relevant inflammatory proteins were measured by Western Blot.
Results: On the day 14 after allo-HSCT, the chimera rate was more than 96%, HSCs of donors had been successfully transplanted into recipients. HE staining showed that nonIPI occurred after allo-HSCT. The degrees of injuries reached the peak on day 21. In addition, the expressions of MPO, NLRP1, p20, Mature-IL-1β and Mature-IL-18 had same tends with the degrees of nonIPI. When we knocked out NLRP1 gene of recipients, the degrees of nonIPI reduced and the expressions of MPO, p20, Mature-IL-1β and Mature-IL-18 were less than in non-knockout group.
Conclusion: allo-HSCT could cause nonIPI and high expressions of MPO, p20, IL-1β, IL-18, NLRP1. Knocking out NLRP1 gene could alleviate the degrees of nonIPI and reduce the expressions of relevant inflammatory proteins, indicating that NLRP1 might be one of factors contributed to nonIPI after allo-HSCT.

异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）是治疗恶性血液病的有效手段，但研究显示有40%~60%的患者在接受移植后可以出现感染或非感染性肺损伤，并有50%的患者因此而死亡，因此移植后肺损伤成为影响患者预后的重要因素[1]–[4]。目前认为，移植后非感染性肺损伤发生的主要原因是放化疗预处理对肺组织的炎性损伤作用[5]–[6]，而核苷酸结合寡聚化结构域样受体1（nucleotide-binding, leucine-rich repeat pyrin domain containing protein 1，NLRP1）作为炎性复合体，在炎性相关性疾病的发生、发展过程中发挥重要作用。我们采用C57BL/6小鼠及NLRP1−/−小鼠建立allo-HSCT肺损伤模型，观察NLRP1及相关因子在移植后的表达，以阐明移植后非感染性肺损伤的发生机制。

材料与方法

1．主要试剂和仪器：抗Caspase-1抗体为美国BioVision公司产品，抗IL-1β抗体NLRP1抗体和抗为美国CST公司产品，抗IL-18抗体为美国Santa Cruz公司产品，山羊抗兔IgG二抗为北京中杉金桥生物技术有限公司产品，抗鼠H2Kb-PE、抗鼠H2Kd-FITC、抗鼠CD45-PerCP/Cy5.5抗体为美国BioLegend公司产品，蛋白显影仪为上海天能科技有限公司产品，60Co辐照仪为山东新华医疗器械股份有限公司产品，FACSCalibur流式细胞仪为BD公司产品。

2．实验动物：C57BL/6小鼠（H2Kb）、BABL/c小鼠（H2Kd）均购于南京大学模式动物研究所；NLRP1−/−小鼠（H2Kb）购于美国杰克逊实验室。小鼠均为8至10周龄的SPF级雄性小鼠，饲养于徐州医科大学血液科实验室IVC系统。

3．实验分组：①正常C57BL/6组（BN组）：5只C57BL/6小鼠不给予任何处理；②正常NLRP1−/−组（NN组）：5只NLRP1−/−小鼠不给予任何处理；③C57BL/6 allo-HSCT组（BT组）：20只C57BL/6小鼠预先8 h给予60Co γ照射，总剂量8.5 Gy，然后经鼠尾静脉输注BABL/c小鼠骨髓单个核细胞；④NLRP1−/−allo-HSCT组（NT组）：20只NLRP1−/−小鼠预先8 h给予60Co γ照射，总剂量8.5 Gy，然后经鼠尾静脉输注BABL/c小鼠骨髓单个核细胞。正常小鼠及allo-HSCT小鼠分别于移植当天和移植后第7、14、21、28天脱颈处死，取肺组织及骨髓细胞进行后续检测。

4．移植后受鼠骨髓细胞表型检测：用抗鼠H2Kb-PE、抗鼠H2Kd-FITC、抗鼠CD45-PerCP/Cy5.5抗体标记骨髓单个核细胞，避光常温孵育20 min，PBS洗涤1次后上流式细胞仪检测骨髓细胞表面表型，判断嵌合率。

5．肺组织形态学观察：取小鼠肺组织，一部分放于冻存管中，−80 °C保存，其余PBS冲洗后，固定、脱水、石蜡包埋、切片。用HE染色，在光学显微镜下观察肺组织病理形态变化。

6．采用Western blot法检测肺组织NLRP1及相关炎性蛋白的表达：取保存在−80 °C中的肺组织，用液氮研磨法将其研碎，加入RIPA裂解液与苯甲基磺酰氟，冰上静置20 min，4 °C下20 000×g离心20 min，吸取上清后加入SDS-PAGE 5×上样缓冲液，混匀后用99 °C金属浴加热10 min后进行加样；将蛋白质条带转移至硝酸纤维素膜；用明胶封闭3 h后，加入NLRP1、Caspase-1、IL-1β、IL-18、MPO和β-actin一抗后，4 °C过夜；PBST洗膜3次，加入二抗，室温孵育1 h，再用PBST洗膜3次后进行显影。以目的条带与β-actin条带的灰度值比值表示目的蛋白的相对表达水平。

7．统计学处理：采用SPSS16.0软件对数据进行统计学分析。符合正态分布的数据以均数±标准差表示，两组间比较若方差齐采用t检验或t′检验；多组间比较采用单因素方差分析，与正常组的两两比较采用Dunnett检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1．allo-HSCT小鼠造血干细胞植入情况：流式细胞术检测结果显示allo-HSCT后第14天，BT组和NT组的供鼠造血干细胞植入，嵌合率均大于96%（表1），提示allo-HSCT模型建立成功。

表1

移植后不同时间点供鼠骨髓细胞嵌合率（%，±s）

组别	鼠数	第7天	第14天	第21天	第28天
C57BL/6移植组	5	92.40±1.37	97.07±0.19	98.90±0.36	98.73±0.38
NLRP1−/−移植组	5	92.43±0.85	96.67±0.43	99.27±0.09	98.80±0.41

2．allo-HSCT后小鼠肺组织形态学观察：移植后小鼠肺组织出现严重损伤，可见明显的肺泡壁增厚，伴肺泡中出现渗出物及炎性细胞浸润。该损伤在移植后的21 d内呈进行性加重，而至移植后第28天，上述病理改变则逐渐减轻（图1）。

图1

正常C57BL/6小鼠及异基因造血干细胞移植后C57BL/6小鼠不同时间点肺组织病理形态变化（HE染色，×400）

A：正常C57BL/6小鼠；B~E：为移植后第7、14、21、28天C57BL/6小鼠肺组织（箭头所指为肺泡壁增厚、肺泡内渗出及浸润细胞较多的区域）

3．移植对MPO、p20、Mature-IL-1β、Mature-IL-18及NLRP1表达的影响：移植后中性粒细胞及巨噬细胞的标志蛋白MPO、p20、Mature-IL-1β及Mature-IL-18表达逐渐增多，移植后第21天达到峰值，随后下降；NLRP1表达水平也于第21天达到峰值，随后下降（图2、表2）。

图2

正常及移植后不同时间点C57BL/6小鼠肺组织中MPO、p20、Mature-IL-1β、Mature-IL-18及NLRP1的表达

1：正常C57BL/6小鼠；2：移植后7 d；3：移植后14 d；4：移植后21 d；5：移植后28 d

表2

移植后不同时间点肺组织中相关蛋白的表达（±s）

组别	鼠数	MPO	p20	Mature-IL-1β	Mature-IL-18	NLRP1
C57BL/6正常组	5	40 127±1 567	52 055±8 381	29 450±2 703	14 287±558	24 670±2 190
C57BL/6移植组
移植后第7天	5	34 313±2 253	75 355±9 831	76 782±4 311a	101 313±3 181 a	28 581±1 297a
移植后第14天	5	122 460±3 173a	143 538±14 586a	119 384±6 866a	146 398±4 511a	76 883±1 209a
移植后第21天	5	255 620±11 665a	221 863±28 386a	125 911±4 350a	143 696±5 054 a	151 727±2 948a
移植后第28天	5	194 020±3 122a	144 437±17 104a	124 999±12 199a	124 999±12 199a	111 991±2 546a
F值		852.7	45.31	110.2	720.6	1927
P值		< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001	< 0.001

注：与C57BL/6正常组比较，aP<0.05

4．敲除NLRP1基因对移植后肺损伤的影响：HE染色结果显示，NLRP1敲除组小鼠，在对应时间点肺泡增厚程度、肺泡内渗出及细胞浸润均轻于非敲除组小鼠（图3）。

图3

正常及异基因造血干细胞移植后NLRP1−/−小鼠肺组织病理形态变化（HE染色，×400）

A：正常NLRP1−/−小鼠；B~E：为移植后第7、14、21、28天NLRP1−/−小鼠肺组织

5．敲除NLRP1基因对MPO、p20、Mature-IL-1β、Mature-IL-18及NLRP1表达的影响：结果显示，NLRP1敲除组小鼠中性粒细胞及巨噬细胞的标志蛋白MPO、p20、Mature-IL-1β及Mature-IL-18在同一时间点的表达低于非敲除组（图4）。

图4

采用Western blot法检测敲除NLRP1基因对移植后不同时间点小鼠MPO（A）、p20（B）、Mature-IL-1β（C）、Mature-IL-18（D）表达的影响（aP<0.05）

讨论

非感染性肺损伤作为allo-HSCT后的并发症之一，严重影响患者的预后。本研究中，我们在移植前后给予小鼠含抗生素的高压酸化水、高压灭菌后的饲料，定期更换消毒后的鼠笼及垫料，从而避免移植后感染，消除感染因素导致的肺损伤，构建allo-HSCT后非感染性肺损伤模型。

研究发现放射可以损伤肺泡Ⅱ型上皮细胞及内皮细胞[7]。在辐射作用下细胞中的水可分解为ROS（一种比氧分子更为活跃的氧分子衍生物，主要包括羟自由基、超氧阴离子和过氧化氢）。ROS可与磷酸二酯键、碱基和核糖相互作用引起脂质过氧化和DNA损伤，从而破坏生物膜[8]。当细胞膜在ROS的作用下发生损伤，有可能引起钾离子外流，而钾离子外流则是激活NLRP1的重要因素[9]–[10]。

NLRP1通过Nod样受体识别危险相关分子模式（DAMP）[11]以及病原相关分子模式（PAMP）[12]，并通过接头蛋白ASC募集Caspase-1前体，Caspase-1的前体相互活化剪切生成有活性的Caspase-1片段p20，继而活化下游的炎性细胞因子IL-1β及IL-18[13]。IL-1β作为一种炎性细胞因子，主要参与了组织破坏、水肿形成等多种病理损伤过程。根据Bhatia等[14]的研究，IL-1β可以作用于内皮细胞，促进IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-γ、PAF的释放及氮氧化物、蛋白酶、花生四烯酸代谢产物的生成，引发级联瀑布反应，造成急性肺损伤。IL-18则是一种可以诱导多种Th1型细胞因子产生的前炎症细胞因子，具有促进Ⅰ型免疫应答、免疫调节和致炎的作用。IL-18也可通过NF-κB和AP1信号通路促进IL-2的表达[15]。Kitasato等[16]通过每日给予小鼠IL-18，成功诱导小鼠发生致命性肺损伤。此外，Strieter等[17]证实IL-1β还可以诱导内皮细胞表达MCP-1，从而刺激中性粒细胞及单核巨噬细胞等炎性细胞游走至相应部位加重炎性损伤[18]。

通过研究我们发现，allo-HSCT后小鼠肺组织出现肺泡壁增厚、肺泡内渗出物增多并伴有细胞浸润，在移植后第21天损伤程度最重，其与中性粒细胞和单核巨噬细胞浸润程度、Mature-IL-1β及Mature-IL-18的变化具有相同的趋势，和Bhatia、Kitasato、Strieter等[14],[16]–[17]的研究结果相符。测定肺组织NLRP1，其变化趋势与其下游Caspase-1活性片段p20、Mature-IL-1β及Mature-IL-18也具有相同趋势。提示NLRP1可能通过Caspase-1生成具有活性的Mature-IL-1β及Mature-IL-18，并趋化中性粒细胞及单核巨噬细胞等炎性细胞，介导allo-HSCT后非感染性肺损伤的发生。为进一步明确NLRP1与allo-HSCT后非感染性肺损伤的关系，我们又以NLRP1−/−小鼠建立allo-HSCT模型，发现敲除NLRP1后，肺组织病理损伤程度较非敲除组低，NLRP1下游的Caspase-1活性片段p20、Mature-IL-1β及Mature-IL-18的表达也较非敲除组低，中性粒细胞及单核巨噬细胞浸润减少。说明敲除NLRP1可以减轻移植后肺损伤程度。由此进一步证明NLRP1可能参与allo-HSCT后非感染性肺损伤的发生。

随着当下对NLRP1的深入研究，越来越多可对NLRP1信号通路进行负调控的物质得以发现：①凋亡相关蛋白Bcl家族中的Bcl-2和Bcl-X（L）已被证明可与NLRP1结合，并抑制Caspase-1的活化，从而影响其下游炎性细胞因子IL-1β的成熟[19]；②Ⅰ型干扰素可以促进转录因子stat1第701位的氨基酸酪氨酸磷酸化，继而抑制NLRP1b的活化[20]；③效应及记忆T细胞可通过细胞间接触抑制NLRP1活化；④卡波西肉瘤相关疱疹病毒编码的Orf63蛋白与NLRP1中的LRR结构域高度类似，因此能与NLRP1结合，但因其缺少PYD和CARD结构域，所以无法再与胞壁酰二肽结合，而起到抑制NLRP1的作用[21]。