[Advances in the pathogenesis of chronic graft versus host disease].

慢性移植物抗宿主病（cGVHD）是异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）后的一个主要并发症[1]，也是影响移植后生活质量的重要因素。cGVHD的主要表现与自身免疫病如系统性红斑狼疮、干燥综合征等类似[2]，主要累及的脏器包括皮肤、肺、口腔、肝脏、肾脏、消化道、眼、生殖道等，表现为硬皮病、闭塞性细支气管炎、肝脏和皮肤的纤维化、靶器官异基因抗体的沉积等多器官受损的自身免疫性血管性胶原病的特征。移植后100 d存活者中发生率30%~70%，病死率30%~50%[3]。根据GVHD不同的临床表现，2005年美国国立卫生院（NIH）将cGVHD定义为：①经典的cGVHD，即仅表现为cGVHD的临床症状而无急性移植物抗宿主病（aGVHD）的临床症状；②重叠综合征，即同时具有cGVHD和aGVHD的特点。相对于aGVHD而言，cGVHD的发病机制十分复杂，治疗效果欠佳，糖皮质激素治疗反应率仅50%~60%，难治性cGVHD患者预后差[4]，且长期使用激素会带来糖尿病、感染、骨质疏松、精神状态异常等不良反应，影响患者生活质量，严重者危及患者生命。深入研究cGVHD的发病机制有助于发现新型有效的预防和诊疗策略。本文我们将从以下4个方面论述cGVHD的发病机制。

一、胸腺损伤和中枢耐受缺失

T细胞在胸腺中的发育需要经过阳性选择和阴性选择过程。通过阴性选择，机体免疫系统清除了自身反应性T细胞克隆，因此不与自身组织抗原起反应，即中枢耐受。

预处理、aGVHD及包含免疫抑制剂的预防治疗等均会造成胸腺的损伤，导致移植后免疫重建过程中中枢耐受机制异常，自身反应性T细胞不能被克隆性清除，从而发生cGVHD。Sakoda等[5]通过研究cGVHD的小鼠模型发现，供者的自身反应性T细胞在cGVHD发展中起重要作用，切除胸腺的受者小鼠因其阴性选择作用损伤，不能清除自身反应性T细胞，导致cGVHD的发生。大剂量放疗引起受者胸腺中树突细胞缺乏，使自身反应性T细胞逃脱了胸腺的阴性选择[6]。Wu等[7]研究发现，供者的CD8+T细胞比CD4+T细胞引起更明显的cGVHD的症状，进一步研究发现，供者的CD8+T细胞介导的cGVHD是胸腺依赖性的，其会优先损伤受者的胸腺髓质上皮细胞引起胸腺阴性选择作用缺陷，从而产生较多的自身反应性CD4+T细胞，后者不仅会持续损伤胸腺而且会加重cGVHD的发展。移植后早期短期应用抗CD4单克隆抗体能恢复受损的胸腺，阻止cGVHD的发生，同时也不会影响CD8+T细胞介导的抗肿瘤效应[7]。

二、调节性T细胞（Treg）数量减少和外周耐受缺失

Treg是T细胞的一个亚群，占外周CD4+T细胞的5%~10%。Treg在免疫调节、维持外周耐受、防止自身免疫疾病及cGVHD等方面具有十分重要的作用。

allo-HSCT后CD4+Treg和传统CD4+T细胞（conventional CD4+T cells，CD4+Tcon）重建的不平衡促进了cGVHD的发展。Alho等[8]研究发现，allo-HSCT后胸腺持续产生初始（naive）CD4+Tcon和CD8+T细胞，且CD8+T细胞的恢复比CD4+Tcon快的多，但产生CD4+Treg显著减少且移植后2年无明显恢复，这种不平衡有利于效应T细胞的产生、扩增和维持，也使移植后外周耐受不能建立。在移植后9个月，未发生cGVHD患者的CD4+Treg与CD4+Tcon的比率以及CD4+ Treg与CD8+T细胞的比率均较cGVHD患者明显升高（P<0.001和P=0.028），形成这种差异的主要原因是cGVHD患者中枢记忆的Treg生成减少（P=0.002）。Mastuoka等[9]前瞻性监测allo-HSCT后CD4+细胞亚群变化，发现在持续的CD4+淋巴细胞减少期间，胸腺产生的初始（naive）Treg明显受损，Treg相对缺乏与广泛型cGVHD的发生相关。另外，移植后初始（naive）T细胞的早期恢复反映胸腺产生CD4+Tcon和CD8+T细胞增多，初始（naive）T细胞的早期恢复与发生cGVHD有关。Bleakley等[10]的一项纳入35例高危急性白血病患者的单组临床试验发现，去除初始（naive）T细胞的外周血干细胞移植不能降低aGVHD的发生率，但可以明显降低cGVHD的发生率，估计2年发生率9%对50%（95% CI 0~19%）。同时，移植后早期迅速增殖的相对不成熟的T细胞可以扩大潜在的同种反应性T细胞池，增加了发生cGVHD的风险。研究表明，移植后Treg的产生可以来自胸腺，也可以来自外周血[11]。Suqiyama等[12]在研究小鼠cGVHD模型中发现，长期应用环孢素A会损伤骨髓源性Treg的重建，增加cGVHD的发生，而雷帕霉素抑制剂无此影响。最近动物研究发现硼替佐米能减轻硬化性cGVHD症状，原因之一是其能促进移植后胸腺的恢复和供者来源T细胞的重建，并促使T细胞向Treg表型分化[13]。

Foxp3+T细胞（包括CD4+Treg和CD8+Treg）和Foxp3+γδTCR+ Treg（γδTreg）对维持allo-HSCT后的外周耐受有重要作用。Hu等[14]研究发现CD4+Treg、CD8+Treg和γδTCR+ Treg的百分率及血浆IL-2、TGF-β1的水平与cGVHD的发生呈负相关，且Spearman相关分析表明血浆IL-2和TGF-β1的水平与Treg各亚群比例呈正相关（P<0.01）。研究证实CD4+ Treg通过细胞间接触、分泌细胞因子如IL-10、TGF-β1、IL-35等发挥免疫抑制作用[15]。Zheng等[16]研究发现CD8+Treg在体外可以抑制同种反应性T细胞的增殖、炎症因子和趋化因子的分泌。在体内，CD8+Treg可以促进传统CD4+Treg的产生，同时抑制效应T细胞的扩增[17]。γδTreg可以以剂量依赖的方式抑制淋巴细胞增殖，最近在小鼠模型中还发现γδTreg具有预防异种GVHD的作用[18]–[19]。

三、B细胞稳态异常和自身抗体产生

在移植后期，60%以上的cGVHD患者能不同程度地检测到抗自身或异体的抗体，循环免疫复合物的存在表明B细胞参与了cGVHD的病理过程[20]。B细胞具有提呈HLA-Ⅰ类和Ⅱ类抗原、产生多种细胞因子和趋化因子、分泌多种抗体等功能，B细胞在cGVHD的发病机制中具有重要作用。

1．自身反应性B细胞与cGVHD：在移植后早期，受者外周B细胞池中包含供者来源的过渡型B细胞，这些细胞具有高度的自身反应性，参与主要的免疫反应，能产生短期生存的浆细胞，但不参与生发中心反应，促进了潜在的自身反应性和同种反应性B细胞的存活[21]。同时，自身反应性B细胞的存活依赖B细胞活化因子（B cell activating factor，BAFF）的水平，低水平BAFF促进其清除，高水平的BAFF通过激活细胞信号分子蛋白激酶（AKT）和胞外信号调节激酶（ERK），促进其存活、减少其凋亡[22]。正常B细胞的存活和增殖同样需要BAFF的支持，allo-HSCT后受者体内B淋巴细胞持续缺乏，此时BAFF水平升高，随着循环中B细胞的恢复，BAFF水平逐渐降低。而发生cGVHD患者移植后1年中的BAFF水平持续升高且相对稳定，但B细胞数量增加缓慢，BAFF与B细胞的比率增高[23]；无cGVHD患者的B细胞数目超过正常[24]，其B细胞中有高水平的BAFF受体，可以消耗BAFF，阻止高水平BAFF引起自身反应性B细胞克隆[25]。另外，Glauzy等[26]发现，cGVHD患者的B细胞分裂数目更多，且与BAFF水平呈正相关，移植后淋巴细胞持续减少期间，发生cGVHD患者的B细胞对BAFF更敏感，说明B细胞在体内的超活化状态。

除了BAFF，B细胞重建过程中与抗原结合的BCR（B-cell receptor）信号在自身反应性B细胞的维持中起关键作用。Allen等[27]研究发现，cGVHD患者的B细胞对BCR信号刺激的反应性显著增高，且近端BCR信号成分B细胞连接蛋白（BLNK）和脾酪氨酸激酶（SYK）水平是升高的。BCR信号激活后，BLNK和SYK磷酸化增加,通过激活NF-κB和ERK信号通路，促进自身反应性B细胞的存活和成熟。最近研究表明，小分子SYK抑制剂Fostamatinib可以有效诱导cGVHD患者的B细胞凋亡，减轻cGVHD小鼠的阻塞性细支气管炎及硬皮病等症状[28]。Bruton酪氨酸激酶（BTK）是BCR信号通路的另一重要分子，研究发现SYK和BTK的抑制剂依鲁替尼（Ibrutinib）在小鼠模型中能有效预防cGVHD[29]。

另外，B细胞池的细胞组成在维持B细胞稳态和免疫耐受中起重要作用。移植后早期前体B细胞和骨髓产生转化型B细胞减少，B细胞恢复延迟。无cGVHD患者的初始（naive）和转化型B细胞数量常常超过正常[30]–[31]，这些细胞在移植后早期成功对抗BAFF并促进自身反应性和同种反应性B细胞清除[22]。同时，大量的B细胞中可能含有重要的调节B细胞，能通过不同机制促进免疫耐受的形成[32]–[33]。

2．调节性B细胞（Breg）与cGVHD：Breg的主要特点是产生IL-10，在人类和小鼠中Breg能下调适应性或固有免疫[34]。Khoder等[35]证实健康供者的IgM记忆B细胞（CD19+ IgM+CD27+）和过渡型B细胞（CD19+CD24hiCD38hi）均含有丰富的Breg。最近研究发现，IL-10的产生并不局限于单一B细胞亚群，CD24hiCD27+B细胞和CD24−CD27hiCD38hi浆母B细胞池中也含有丰富的Breg，Breg通过分泌IL-10和CD80/CD86介导的直接细胞间接触发挥抑制自体CD4+T细胞增殖的作用[33]。在allo-HSCT后，cGVHD患者的Breg比健康供者和无cGVHD患者更少见，且产生IL-10的功能受损[35]。de Masson等[33]在一项纳入69例allo-HSCT受者的前瞻性研究中发现，发生cGVHD患者的Breg有明显缺陷。同时，Breg的百分率与cGVHD的活动性及严重程度相关。与健康供者、无cGVHD患者及cGVHD缓解者相比，活动性cGVHD患者Breg的百分率明显降低（1.1%对3.5%，P<0.001；1.1%对4.0%，P<0.001；1.0%对2.6%，P<0.001）；中型及重型cGVHD患者的Breg百分率低于轻型cGVHD患者（1.3%对3.0%，P=0.06；1.5%对3.0%，P=0.004）。临床上应用CD20单克隆抗体利妥昔单抗预防和治疗cGVHD取得了一定疗效，但个体差异较大，有持续初始（naive）B细胞减少的患者在应用利妥昔单抗后甚至会出现cGVHD的加重，除了与受者本身B细胞池恢复延迟有关外，还可能与CD20单克隆抗体在去除致病性B细胞的同时也造成了Breg的减少有关。由此推测，在某些以Breg缺乏为主要发病机制的cGVHD患者中，应用利妥昔单抗效果不佳。

3．自身抗体与cGVHD：在动物模型中发现，cGVHD涉及的器官有同种抗体的沉积，产生IgG缺陷的小鼠移植后cGVHD的发生减低[36]。B细胞产生的血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）受体自身抗体是与cGVHD纤维化改变相关的自身抗体之一[37]。研究表明同种抗体沉积与肝脏和肺脏的纤维化有关[38]。Jin等[39]通过DBA/2供者小鼠和BALB/c受者小鼠建立cGVHD模型，研究发现供者B细胞抗体引起皮肤cGVHD加重在某种程度上是通过破坏胸腺和增加致病性Th17细胞的组织浸润引起的。Miklos团队首先提出HY-抗体与cGVHD发生有关[40]–[41]。HY-次要组织相容性抗原是指可以被女性供者初始（naive）淋巴细胞识别的男性受者Y染色体编码的一类蛋白。女性供者初始（naive）淋巴细胞识别男性受者HY-抗原并产生应答，同时会攻击受者的其他组织，最终产生cGVHD自身免疫病的临床表现[40]。Nakasone等[41]研究发现，在移植后3个月，57%（78/136）的患者可以检测到至少一种HY-抗体，移植后3个月HY-抗体的检出与cGVHD的发生风险和非复发死亡率明显相关（P<0.001，P<0.01）。动物实验已经证明，HY-抗体的增加是同种反应性B细胞在cGVHD中的作用[36],[42]。这提示我们，在女性→男性移植患者中，可以通过检测移植后HY-抗体来预测cGVHD的发生风险，提前采取预防措施。cGVHD患者中也频繁发现其他自身抗体，但具体病理机制尚不明[43]。

四、细胞因子与cGVHD

多种细胞因子与cGVHD的发生相关。Hu等[14]研究发现，移植后未发生cGVHD患者的血清转化生长因子β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1）和IL-2水平明显高于cGVHD患者，广泛型cGVHD患者血清TNF-α水平明显升高。TGF-β1可以促进Foxp3在T细胞表达，并通过SMAD信号通路引起辅助T细胞向调节T细胞转化并扩增[44]。另外，TGF-β1还可以促进淋巴细胞相关抗原CTLA-4在初始（naive）T细胞表达，进而诱导Foxp3在Treg细胞产生[45]。Matsuoka等[46]研究发现，低剂量IL-2治疗可以恢复cGVHD患者CD4+T细胞亚群的稳态，促进免疫耐受的重建。Pratt等[47]研究发现，移植后IL-15的水平对cGVHD的发生具有预测意义。移植后第7天血清IL-15水平较低的患者（<30.6 ng/L）比IL-15水平高的患者发展为中型/重型cGVHD的可能性高2.7倍（P<0.001）。可能的机制之一是IL-15可以调节CD8+T细胞和NK细胞的增殖和存活，IL-15水平与CD8+T细胞数量呈负相关，低水平的IL-15提示CD8+T细胞或NK细胞，包括同种反应性细胞的扩增。供者的CD4+T细胞可以分化为Th1、Th2和Th17细胞。动物实验已经证明Th1和Th17细胞可以引起cGVHD。cGVHD受者的肺和肝脏中均发现有Th17细胞浸润。Th1细胞主要分泌ITF-γ，Th17细胞主要分泌IL-17。输注ITF-γ（−）或IL-17（−）的供者的T细胞可以减轻cGVHD的皮肤和外分泌腺表现。Hu等[14]的研究中并未发现血清INF-γ水平在cGVHD患者与非cGVHD患者间有明显差异。关于血清ITF-γ水平与发生cGVHD的关系目前尚无一致结论。IL-12和IL-23分别具有促使Th1细胞分化和稳定Th17细胞表型的作用，两种细胞因子具有共同的p40亚基。Wu等[48]在小鼠模型研究中发现，阻滞IL-12/23 p40亚基的治疗可以显著改善cGVHD的临床表现和免疫重建，而不引起GVHD相关死亡。最近研究发现，系统性cGVHD患者眼泪细胞因子IL-2、IL-10、IL-17α、IFN-γ、IL-6、TNF-α水平升高，且IL-10、IL-6、IL-17α、TNF-α水平与cGVHD的发生显著相关（P<0.001）[49]。趋化因子在cGVHD纤维化改变中发挥作用，Kim等[50]通过研究cGVHD的小鼠模型发现，磷酸二酯酶-4抑制剂罗氟司特可以明显减少促炎因子、促纤维化因子和趋化因子的mRNA表达，减轻肺的纤维化和炎症。PDGF信号通路的调节异常与动脉粥样硬化、肺动脉高压、纤维化等相关。所有硬皮病和广泛型cGVHD的患者都能检测到PDGF受体的刺激抗体[51]。

五、展望

随着异基因造血干细胞移植技术的进步、临床医师经验的丰富及对症支持治疗的增强，移植成功率逐渐提高，因此预防cGVHD的发生、及时有效治疗cGVHD对减少移植后非复发死亡率和提高患者生活质量具有重要意义。cGVHD发病机制复杂，胸腺阴性选择损伤，移植后T细胞、B细胞重建失衡、免疫耐受缺失、细胞因子等可能单独或同时出现在cGVHD患者中，导致cGVHD复杂的临床症状。目前针对不同发病机制的药物如利妥昔单抗、伊马替尼、依鲁替尼等已应用于临床或在临床及动物实验研究中。随着对cGVHD发病机制的深入研究，更多更有效的药物将会涌现，cGVHD的预防和治疗将会取得新的进展。