[Rita induce acute lymphoblostic leukemia cell apoptosis by activating P53 pathway].

随着多药联合化疗的应用，急性淋巴细胞白血病（ALL）的治愈率得到了极大的提高，但仍有15%~20%的ALL患儿难以到达长期缓解[1]。白血病细胞耐药是导致白血病治疗失败的最主要原因[2]–[3]。因此寻找区别于目前临床治疗药物的新类型化疗靶向药物，有可能克服常用药物形成耐药的问题。

近年来研究发现的一种天然小分子化合物—Rita（Reactivation of p53 and induction of tumor cell apoptosis）能激活细胞内P53蛋白，促进肿瘤细胞凋亡，可能成为肿瘤治疗的新药物[4]。目前关于Rita的报道多集中在实体瘤[5]–[7]，ALL中鲜有报道。尽管ALL中P53表达阳性的比例仅占10%[8]，但54%复发耐药的ALL患者表达P53[9]。Rita能否通过恢复耐药ALL细胞中P53的功能，从而改善耐药ALL的治疗效果，目前尚不明确。我们提供探讨Rita在P53野生型ALL细胞系中的功能及调控机制，以期为ALL治疗引入新型化疗靶向药物提供理论依据。

材料与方法

1．细胞株及细胞培养：人ALL细胞株NALM6细胞及Molt4细胞均购自中国科学院细胞库。两株细胞均从ALL复发患者中取得，NALM6细胞为T细胞来源，而Molt4细胞为B细胞来源。两种细胞均对糖皮质激素及化疗药物敏感。细胞接种于含有15%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素的RPMI 1640培养液中，置于37 °C、5% CO2培养箱中培养。

2．细胞活性检测：利用CCK-8试剂盒（日本同仁公司产品）检测细胞活性。实验按照产品说明书进行。具体步骤：取对数生长期的NALM6、Molt4细胞，调整细胞密度为3×105/孔，接种于96孔板，分别加入不同浓度（终浓度分别为0、0.5、1、2、4、8、10 µmol/L）Rita（Abmole公司产品），并设置空白对照。每组设3个复孔，实验重复3次。培养22 h后每孔加入10 µl CCK-8试剂，继续培养2 h，应用多功能酶标仪检测450 nm处吸光度（A）值，以630 nm为参比波长。根据公式计算细胞存活率及半数抑制浓度（IC50），选择存活率为20%~30%时的两个浓度进行后续实验。

3．流式细胞术检测细胞凋亡率：取对数生长期的NALM6和Molt4细胞，以3×105/ml密度接种于12孔板，每孔1 ml。加入终浓度2.5 µmol/L和4.5 µmol/L Rita，每组设3个复孔，置于37 °C、5%CO2、饱和湿度培养箱培养，NALM6细胞培养0、12、24、36 h后收集细胞；Molt4细胞培养0、24、36、48 h后收集细胞，使用PBS洗涤细胞1次。以500 µl 1×结合缓冲液重悬细胞，加入5 µl Annexin Ⅴ-FITC和10 µl PI（上海联科生物公司产品），避光室温孵育5 min。采用流式细胞术进行凋亡分析，以Annexin Ⅴ+/PI−细胞为凋亡细胞，检测各组细胞凋亡率，实验重复3次。

4．Western blot法检测PARP、caspase-3及P53蛋白的表达水平：分别收集未加药处理组及Rita处理组的NALM6和Molt4细胞，使用事先加入蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液（美国Thermo公司产品）裂解细胞，冰上放置30 min，13 000 r/min（离心半径9 cm）离心30 min后，加入5×蛋白上样缓冲液，100 °C变性10 min。总蛋白经BCA法（美国Thermo公司产品）检测蛋白浓度。总蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳（上样量每孔20 µg）分离后转膜，用50 g/L脱脂奶粉封闭2 h后，洗膜3次，用抗P53（美国Proteintech公司产品）、抗PARP（美国Cell Signaling公司产品）及抗caspase-3（美国Cell Signaling公司产品）的一抗4 °C孵育过夜，洗膜3次，用辣根过氧化物酶偶联的二抗（美国Proteintech公司产品）室温孵育1 h，洗膜3次，加入化学发光剂，应用蛋白印迹成像系统（美国Bio-Rad公司产品）显色，扫描保存。

5．统计学处理：采用SPSS 16.0软件进行统计分析，结果以至少3次独立实验的±s表达，两样本组间的比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1．Rita对NALM6和Molt4细胞活性的影响：不同浓度的Rita处理表达野生型P53的ALL细胞株NALM6和Molt4细胞后，细胞存活率均随着浓度增加而降低。其中NALM6细胞IC50值为0.73 µmol/L，Molt4细胞为1.81 µmol/L（图1）。选择20%~30%存活率的两个浓度（2.5、4.5 µmol/L）进行后续实验。

图1

不同浓度Rita处理后细胞存活率

2．Rita对NALM6和Molt4细胞凋亡的影响：为了验证Rita能否诱导NALM6及Molt4细胞凋亡，我们用2.5~4.5 µmol/L Rita处理NALM6及Molt4细胞，通过流式细胞术检测其不同时间点的凋亡情况，结果见表1。结果显示，Rita可以诱导NALM6及Molt4细胞凋亡，且Rita作用的方式具有时间依赖性。

表1

Rita对NALM6和Molt4细胞凋亡的影响（%，±s）

组别	NALM6细胞				Molt4细胞
	0h	12 h	24 h	36 h	0h	24 h	36 h	48 h
2.5 µmol /L作用组	2.74±0.61	3.14±0.73	9.38±0.99b	26.70±1.02c	0.71±0.35	6.18±0.69c	25.40±0.85c	26.40±0.90c
4.5 µmol /L作用组	2.49±0.96	4.56±0.84a	10.30±0.89c	26.70±1.03c	0.82±0.43	13.90±0.74c	18.20±0.78c	20.90±0.95c

注：与对照组（0 h）比较,aP<0.05, bP<0.01，cP<0.001。实验重复3次

3．Rita对细胞凋亡蛋白剪切的PARP和caspase-3表达的影响：Western blot检测结果显示，与对照组（0 h）相比，2.5 µmol/L和4.5 µmol/L的Rita处理NALM6细胞8 h后，均可检测到剪切的PARP和caspase-3蛋白，24 h时表达明显升高（图2）。同样，2.5 µmol/L和4.5 µmol/L的Rita处理Molt4细胞24 h后，可检测到剪切的PARP及caspase-3蛋白，60 h时表达明显升高。结果进一步表明Rita能诱导NALM6和Molt4细胞凋亡（图3）。

图2

不同浓度Rita处理NALM6细胞后凋亡蛋白表达水平

A：2.5 µmol/L；B：4.5 µmol/L

图3

不同浓度Rita处理Molt4细胞后凋亡蛋白表达水平

A：2.5 µmol/L；B：4.5 µmol/L

4．Rita激活p53促进ALL细胞凋亡：为了研究Rita诱导白血病细胞凋亡的具体机制，我们采用Western blot法检测了Rita处理NALM6及Molt4细胞后多个时间点的P53的表达变化水平。结果显示，与对照组相比，2.5、4.5 µmol/L的Rita处理NALM6细胞8 h后，均可见P53表达升高，约24 h时，P53表达量最高（图4）。同样，2.5、4.5 µmol/L的Rita处理Molt4细胞24 h后，P53表达升高，约60 h时，P53表达量最高（图5）。表明在ALL细胞株NALM6及Molt4细胞中，Rita可通过激活P53促进其凋亡。

图4

不同浓度Rita处理NALM6细胞后P53表达水平

A：2.5 µmol/L；B：4.5 µmol/L

图5

不同浓度Rita处理Molt4细胞后P53表达水平

A：2.5 µmol/L；B：4.5 µmol/L

讨论

目前临床上对ALL细胞耐药缺乏有效的药物，因此探索新型有效治疗药物已成为当前ALL研究的重大课题。已有研究表明Rita在不影响正常细胞活性的前提下通过调节P53的功能而诱导多种肿瘤细胞凋亡[10]–[15]。本研究中，我们发现Rita对ALL细胞具有杀伤作用，证实了ALL细胞经Rita处理后发生凋亡，且具有明显的时间依赖性。在凋亡过程中，P53蛋白的表达量明显增高，表明Rita结合P53导致其聚集，最终诱导细胞凋亡。这与Kazemi[16]和Nahi等[17]研究报道一致。

尽管只有10%~15%的白血病患者在诊断时肿瘤细胞表达P53蛋白[18]–[21]，但是表达P53蛋白的ALL患者复发后对原治疗方案易产生耐药，预后较差。因此，P53是ALL复发重要的分子标志物[9]。已有研究证实了Rita可通过与P53蛋白氨基末端结合，诱导细胞凋亡[22]–[23]。因此，Rita有望区别于传统的化疗药物而提高部分复发ALL患者的治疗效果。

目前大多数研究停留于研究Rita依赖P53起促进肿瘤细胞凋亡的作用。然而，也有少量研究表明Rita能诱导P53突变型或缺失型细胞发生凋亡。我们前期研究结果也显示在P53突变或缺失型ALL及AML细胞系Reh及HL-60细胞中，Rita也起杀伤作用，但是Rita的IC50值明显高于NALM6及Molt4细胞（约5倍），且作用的最佳时间也明显延长。进一步检测P53蛋白的表达情况，并未见其表达增高（结果未显示）。因此，我们认为Rita主要通过结合野生型P53促进ALL细胞凋亡，大剂量时可能通过P53以外的通路发挥促凋亡的作用。具体的机制还有待于进一步的研究。

综上所述，本研究着重探讨了Rita在P53野生型ALL细胞系NALM6和Molt4细胞中靶向激活P53诱导凋亡的分子机制，进一步阐明了Rita在人ALL细胞中的促凋亡功能，为Rita作为新型的白血病治疗药物提供了理论依据。