[Effects of 13-cis-retinoic acid combined with interferon-α2b in mantle cell lymphoma cell lines (Jeko-1) in vitro].

Objectives: To explore the effects of 13-cis-retinoic acid (13cRA) alone or combined with interferonα-2b (IFNα-2b) for the inhibition of cell growth and apoptosis induction of mantle cell lymphoma cell lines Jeko-1 cells.
Methods: Jeko-1 cells were treated by different concentrations of 13cRA alone or combined with IFN-α2b. CCK-8 was used to measure the inhibition effects by different treatments. Cell cycles were analyzed by flow cytometry. Effects on apoptosis were assessed by staining of Annexin Ⅴ/PI. And the levels of Cyclin D1, caspase-9 and Rb proteins were measured by Western blot method.
Results: 13cRA alone at different doses and its combination with IFNα-2b inhibited Jeko-1 cells growth and induced apoptosis, but the combination had higher inhibition potential and significant apoptosis rate (P<0.05) . The growth inhibition and apoptosis induction in Jeko-1 cells increased significantly with the elevation of drugs concentration and treating duration (P<0.05) . As well as the percentage of Jeko-1 cells at G(1)/G(2) phases increased (P<0.05) and cells at S phase decreased (P<0.05) , the levels of Cyclin D1 and Rb decreased with elimination caspase-9.
Conclusion: 13cRA, IFN-α2b and their combined administration inhibited cells growth and induced apoptosis, decreased the cell populations at S phase and blocked the cells at G(1)/G(2) phase. Combination of the drugs may have a cooperated action. The therapeutic synergistic effects of 13cRA and IFN-α2b were assumed to lower the expression of Cyclin D1 and Rb proteins, and induce apoptosis by activating caspase-9 pathway.

套细胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）是起源于生发中心周围套细胞区的B淋巴细胞淋巴瘤，占非霍奇金淋巴瘤的3%~8%[1]。其分子遗传学特点为染色体t（11;14）（q13;q32）易位，导致Cyclin D1的过量表达[2]。Cyclin D1与CDK4/DK6结合形成复合体调节细胞由G1期向S期转化，正常细胞由G1期向S期转化时受周期调控蛋白的控制，限制细胞由G1期向S期转化的速度。由于MCL患者中Cyclin D1的上述作用能加速细胞通过G1期向S期转化的调控，从而促使肿瘤细胞快速增殖。新型药物的研发给患者带来了更多的选择，但是这些药物价格昂贵，且MCL仍被认为是一种难治的恶性淋巴瘤。维甲酸（RA）类存在多种异构体，该类药物具有影响细胞增殖，促进细胞凋亡和分化的作用，具有一定的抗肿瘤活性[3]–[4]，如治疗青少年慢性髓性白血病、骨髓增生异常综合征和皮肤T细胞淋巴瘤等，但RA治疗B细胞淋巴组织增殖性疾病报道甚少[5]。干扰素（IFN）是一种细胞因子，具有抗肿瘤作用[6]。IFN和RA药物相互作用能增强疗效，二者联合抗肿瘤亦有报道[7]。在本研究中我们将两药单用及联合应用，观察其对MCL细胞增殖和凋亡的影响，并探索其作用机制。

材料与方法

1．材料：MCL细胞株Jeko-1购自美国细胞菌种库（ATCC），培养于含10%胎牛血清、100 µg/ml青霉素、100 µg/ml链霉素的RPMI 1640完全培养基中，于37 °C、5% CO2、饱和湿度孵箱内培养。IFN-α2b（甘乐能）购自美国先灵葆雅公司。13-顺式维甲酸（13cRA）购自大连美仑生物技术有限公司。硼替佐米为西安杨森制药有限公司产品。利妥昔单抗购自上海罗氏制药有限公司。注射用环磷酰胺为通化茂祥药业股份有限公司产品。CCK-8试剂盒、凋亡及全蛋白提取试剂盒、细胞周期检测试剂盒、蛋白含量检测试剂盒等均购自成都精博生物技术研究公司。抗Cyclin D1、caspase-9、Rb抗体均为美国Cell Signaling Technology公司产品。

2．采用CCK-8法检测13cRA、IFN-α2b对Jeko-1细胞增殖的影响：将对数生长期的Jeko-1细胞置于96孔培养板中，每孔4×104个细胞。实验分组：①空白对照组为不含有细胞及药物的完全培养基；②阴性对照组：不加药物干预的细胞悬液；③阳性对照组：硼替佐米（20 nmol/L）+利妥昔单抗（10 µg/ml）+环磷酰胺（10 mmol/L）；④13cRA实验组：预实验结果显示13cRA浓度在0.01~1.00 µmol/L，抑制率随药物浓度的增加而变化较小，抑制率差异无统计学意义（P值均>0.05），故在后续实验选择10、100 µmol/L 13cRA处理细胞；⑤IFN-α2b实验组：加入10 000 IU/ml IFN-α2b处理细胞；⑥两药联合应用组：分别加入不同浓度13cRA（10、100 µmol/L）联合10 000 IU/ml IFN-α2b处理细胞。各组培养1、3、5 d，到检测点后，每孔加入10 µl CCK-8试剂，振荡，孵育2~3 h后显色，用酶标仪在450 nm波长处测定各孔的吸光度（A）值。按公式计算细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率（%）=[1−（A处理组−A空白对照组）/（A阴性对照组−A空白对照组）]×100%。每组设3个复孔，实验重复3次。

3．采用Annexin Ⅴ/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡率：将对数生长期的Jeko-1细胞置于6孔板中，每孔8×105个细胞，实验分组同上。培养1、3、5 d后，将收集的细胞离心、PBS洗涤2次，用500 µl Binding Buffer重悬细胞，加入5 µl AnnexinⅤ-FITC和5 µl PI，避光反应15 min，上流式细胞仪（美国BD生物科学公司产品，型号BD FACSAria™Ⅲ）进行检测，用Flowjo分析软件计算细胞的凋亡率。细胞凋亡率（%）=早期凋亡率（Q2）+晚期凋亡率（Q4）。每组设3个复孔，实验重复3次。

4．采用PI单染法流式细胞术进行细胞周期分析：将对数生长期的Jeko-1细胞置于6孔板中，每孔8×105个细胞，实验分组同上。培养1、3 d后收集并用70%冰乙醇固定细胞，每管样品加入PI染液，避光于37 °C水浴箱孵育30 min。上流式细胞仪在激发波长488 nm波长处检测红色波长。用Modfit2软件进行细胞周期分析。每组设3个复孔，实验重复3次。

5．采用Western blot法检测凋亡途径的相关蛋白：收集终浓度分别为10、100 µmol/L 13cRA、10 000 IU/ml IFN-α2b及两药联合应用处理12 h的细胞，按试剂盒说明进行操作，提取细胞全蛋白，上等量的蛋白进行SDS-PAGE电泳，选用PVDF膜转膜，加入相应的一抗，4 °C过夜，用辣根过氧化酶标记的二抗室温温育30 min，最后通过显影、定影曝光出所测蛋白；以GAPDH（武汉博士德生物工程有限公司产品）为内参。

6．统计学处理：应用SPSS16.0软件进行统计学分析。实验数据均以±s表示，组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1．13cRA、IFN-α2b及两药联合对Jeko-1细胞增殖的影响：结果显示13cRA、IFN-α2b及两药联合对Jeko-1细胞增殖均有不同程度的抑制作用。不同药物浓度（10、100 µmol/L）的13cRA作用后，Jeko-1细胞增殖抑制率差异有统计学意义（P<0.05），13cRA浓度在10~100 µmol/L范围内，抑制率呈药物剂量和时间依赖性。100 µmol/L 13cRA对Jeko-1细胞增殖的抑制作用与阳性对照组接近（表1）。

表1

13-顺式维甲酸（13cRA）、干扰素（IFN）作用不同时间对Jeko-1细胞增殖和凋亡的影响（±s）

组别	细胞增殖抑制率（%）			细胞凋亡率（%）
	第1天	第3天	第5天	第1天	第3天	第5天
阴性对照组	0.00±0.01	0.00±0.02	0.03±0.01	4.80±0.10	5.00±0.20	59.87±0.21
10 µmol /L 13cRA处理组	16.11±2.07a	35.10±5.05a	75.32±3.16a	12.37±2.03a	12.50±0.56a	71.17±0.61a
100 µmol /L 13cRA处理组	40.14±6.08a	80.41±6.33a	89.50±2.27a	30.33±3.01ab	33.77±5.49a	85.43±4.30a
10 000 IU/ml IFN处理组	0.00±0.03	0.02±0.06	14.48±10.21a	11.50±0.40a	28.47±4.81a	64.03±4.01a
联合处理1组	8.26±1.17a	53.44±1.28a	82.46±2.15a	16.87±0.50a	36.60±3.25a	75.90±1.90a
联合处理2组	69.37±8.31ab	83.28±4.35a	92.37±2.41a	54.80±2.17ab	99.27±0.15ab	99.87±0.12ab
阳性对照组	63.34±4.22a	82.36±7.21a	91.38±4.21a	23.63±1.10a	67.20±3.94a	87.80±3.22a

注：阴性对照组：不加药物处理的细胞悬液；阳性对照组：20 nmol/L硼替佐米+10 µg/ml利妥昔单抗+10 mmol/L环磷酰胺处理组；联合处理1组：10 µmol/L 13cRA+10 000 IU/ml IFN处理组；联合处理2组：100 µmol/L 13cRA+10 000 IU/ml IFN处理组；a相同时间点与阴性对照组比较，P<0.05；b相同时间点与阳性对照组比较，P<0.05。每组设3个复孔，实验重复3次

采用回归分析-probit法计算半数抑制浓度（IC50）值。第3天单药13cRA的IC50值为18.63 µmol/L、IFN-α2b的IC50值为3 850 000 IU/ml；联合用药时13cRA的IC50值为16.13 µmol/L。在研究中我们发现第3天IFN-α2b对细胞增殖的抑制作用极弱，采用协同系数（combinationg index，CI）判断10 000 IU/ml IFN-α2b联合不同浓度13cRA的协同作用，0.9≤CI≤1.0为叠加作用，0.8≤CI<0.9为轻度协同作用；0.6≤CI<0.8为中度协同作用；0.4≤CI<0.6为高协同作用；0.2≤CI<0.4为强协同作用。通过公式计算，第3天联合用药CI=0.866，表明两药有轻度协同作用；第5天CI=0.735，表明两药联合第5天有中度协同作用。

与阴性对照组比较，第5天单药10 000 IU/ml IFN-α2b组对细胞增殖抑制作用明显（P<0.05），抑制率为（14.48±10.21）%。

13cRA和IFN-α2b联合应用组较单药组抑制率更高（P<0.05），100 µmol/L 13cRA+10 000 IU/ml IFN联合用药组对细胞增殖抑制作用在第1天高于阳性对照组[（69.37±8.31）%对（63.34±4.22）%，P<0.05]，而在第3、5天差异无统计学意义（P值均>0.05）（表1）。

2．13cRA、IFN-α2b及两药联合对Jeko-1细胞凋亡的影响：单独10、100 µmol/L 13cRA作用于Jeko-1细胞24 h即产生明显的促凋亡效应（P<0.05），且作用呈剂量和时间依赖性，差异有统计学意义（P<0.05）。10 000 IU/ml IFN-α2b对Jeko-1细胞有促凋亡作用（P<0.05）。13cRA联合IFN-α2b组，细胞凋亡比例随药物浓度的增加和干预时间的延长而增高，且组内（相同时间不同药物浓度）差异有统计学意义（P<0.05）。与相应浓度的单药13cRA相比，联合用药组的Jeko-1细胞凋亡率更高（表1）。

3．13cRA、IFN-α2b及两药联合对Jeko-1细胞周期的影响：结果显示不同浓度组13cRA及10 000 IU/ml IFN-α2b组均能降低S期细胞比例、提高G1期+G2期细胞比例。其中，100 µmol/L的13cRA浓度组在作用于细胞24 h后S期细胞比例降低、G1期细胞比例升高，与阴性对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。与相应浓度的单药13cRA相比，联合用药组能显著降低S期细胞比例、提高G1期+G2期细胞比例（P<0.05）（表2）。

表2

流式细胞术检测13-顺式维甲酸（13cRA）、干扰素（IFN）作用不同时间对Jeko-1细胞周期分布的影响[细胞比例（%），±s]

组别	第1天		第3天
	G1+G2期	S期	G1+G2期	S期
阴性对照组	63.55±2.64	36.45±2.48	67.21±2.71	32.80±2.71
10 µmol /L 13cRA处理组	60.02±0.64	39.99±0.64	78.10±1.52a	21.41±2.30a
100 µmol /L 13cRA处理组	84.13±0.38ab	15.87±0.37ab	81.41±1.97ab	19.00±1.37ab
10 000 IU/ml IFN处理组	70.85±2.98a	29.15±2.96a	80.06±0.45a	19.34±0.44a
联合处理1组	73.03±1.38a	26.97±1.38a	82.12±0.67ab	17.88±0.66ab
联合处理2组	88.86±1.27ab	11.14±0.81ab	90.35±0.56ab	9.66±0.56ab
阳性对照组	74.75±2.32	25.25±2.35	78.90±8.05	21.61±3.06

注：阴性对照组：不加药物处理的细胞悬液；阳性对照组：20 nmol/L硼替佐米+10 µg/ml利妥昔单抗+10 mmol/L环磷酰胺处理组；联合处理1组：10 µmol/L 13cRA+10 000 IU/ml IFN处理组；联合处理2组：100 µmol/L 13cRA+10 000 IU/ml IFN处理组；a相同时间点与阴性对照组比较，P<0.05；b相同时间点与阳性对照组比较，P<0.05。每组设3个复孔，实验重复3次

4．13cRA、IFN-α2b及两药联合对Jeko-1细胞Rb、Cyclin D1、caspase-9蛋白表达的影响：Western blot法检测结果显示：单用13cRA组及联合用药组细胞的Rb蛋白表达较阴性对照组明显降低，而单用IFN-α2b组无明显降低；单用不同浓度的13cRA组、单用IFN-α2b组及联合组细胞的Cyclin D1表达均较阴性对照组降低，联合用药组较单用13cRA组细胞降低更明显；与阴性对照组相比较，pro-caspase-9的表达因不同的药物处理方案有不同程度的降低，但cleaved-caspase-9表达呈不同程度的升高（图1）。

图1

Western blot法检测13cRA、IFN-α2b及两药联合对Jeko-1细胞Cyclin D1、caspase-9及Rb蛋白表达的影响

1：阴性对照组；2：10 µmol/L 13cRA处理组；3：100 µmol/L 13cRA处理组；4：10 000 IU/ml IFN-α2b处理组；5：10 µmol/L 13cRA +10 000IU/ml IFN-α2b处理组；6：100 µmol/L 13cRA +10 000 IU/ml IFN-α2b处理组

讨论

13cRA通过与RAR受体结合，降低Cyclin D1的表达和影响Bcl-2的功能，从而抑制细胞的增殖[8]。已有研究结果证明全反式RA、9cRA对MCL细胞株Granta519和SP53细胞有明显的抑制作用，同时证明9cRA能通过caspase-9依赖的凋亡途径使细胞发生凋亡[9]。

Wang等[10]的研究结果表明硼替佐米+利妥昔单抗+环磷酰胺联合用药在MCL体内外试验中均显示出明显的抑制增殖和诱导凋亡作用，故我们参考该文献的方案并将其设为阳性对照组。我们的结果显示0.01~100 µmol/L浓度范围的13cRA对Jeko-1细胞产生了明显的抑制作用，且与药物浓度和时间呈明显的依赖性。单药13cRA浓度在0.01~1.00 µmol/L范围时，随着时间的延长显示了对Jeko-1细胞的抑制作用，但各组之间的抑制率差异无统计学意义，可能与在该药物浓度范围内时药物浓度梯度差较小有关，相反当药物浓度从10 µmol/L增加至100 µmol/L时，由于药物浓度差增大，该两组药物浓度的抑制率差异有统计学意义，提示13cRA的有效药物浓度范围在10~100 µmol/L。两药联合在作用第3、5天均具有协同作用，随作用时间的延长。两药联合的协同效果越明显；Guidoboni等[11]的体外实验结果表明，9cRA联合IFN-α2b通过靶向作用于MCL细胞株的Cyclin D1、p27Kip1、Akt和Noxa等蛋白，从而发挥抗肿瘤细胞增殖的作用。在本研究中我们发现单药13cRA能降低Jeko-1细胞的Cyclin D1水平。同样，细胞周期检测结果显示，单药13cRA能使Jeko-1细胞S期比例降低，G1期细胞比例增高，与Guidoboni等[11]所报道的RA药物抗MCL细胞株的机制相似，使肿瘤细胞停滞在DNA合成前期，抑制细胞增殖。同时我们采用流式细胞术检测细胞凋亡，发现单药13cRA对Jeko-1细胞有促凋亡作用，Western blot法检测结果显示，100 µmol/L 13cRA促Jeko-1细胞凋亡作用伴有pro-caspase-9的裂解。我们推测13cRA的促Jeko-1细胞发生凋亡的机制可能为：①大剂量的13cRA可能通过诱导细胞核受体RXR的上调并与之结合发挥促细胞凋亡功能；②MCL的发生与Bcl-2的抗凋亡作用增强有关，而13cRA能下调其表达而降低抗细胞凋亡的功能。13cRA促Jeko-1细胞凋亡的作用机制仍需进一步深入研究进行探索。

在我们的实验中，单独IFN组在观察的第5天显现出对Jeko-1细胞生长的轻度抑制作用，而在采用流式细胞术进行凋亡及周期检测中发现IFN-α2b发挥作用的时间较早。分析可能原因为：CCK-8增殖抑制实验仅能检测活细胞的数量，即使IFN-α2b在早期对Jeko-1细胞的凋亡和细胞周期有影响，但此时的细胞可能尚未死亡。现已证明IFN-α2b能通过上调CDKI、p19Ink4和p21Cip，从而使细胞停滞于G1期[6]。因MCL的发生与细胞周期调控蛋白如CDKI、p21等相关，IFN-α2b可能通过此途径发挥抗Jeko-1细胞增殖的作用。本研究结果显示IFN-α2b作用于Jeko-1细胞后，能降低Cyclin D1蛋白水平，使G1期细胞比例明显升高，S期细胞比例明显降低，从而抑制细胞增殖。但在本研究中，Cyclin D1表达降低是否与CDKI、p19Ink4和p21Cip有关有待进一步研究证实。我们的实验结果同时表明，IFN-α2b联合13cRA治疗MCL，不仅能起到增强13cRA疗效的作用，本身亦能抑制Jeko-1细胞的增殖。

13cRA和IFN-α2b均能通过调节细胞周期相关蛋白Rb、Cyclin D1、E2F、CDK及c-Myc等的表达而发挥抑制肿瘤增殖的作用[7]。RA与IFN具有相互促进的作用，研究表明IFN通过上调RA受体RAR和RXR的表达，增强细胞对RA类药物的敏感性[12]–[13]，RA可以降低STAT的磷酸化水平和诱导IFN调节因子-1（IFN regulatory factor-1，IRF-1）的产生，继而增强IFN的生物学功能[14]–[15]。在本研究中我们发现，在药物作用的第1、3天，相同时间点联合用药组与对应浓度的单药13cRA相比，对细胞增殖抑制、凋亡和细胞周期的影响差异有统计学意义（P值均<0.05）。Western blot法检测结果显示联合用药组与单药13cRA组能明显降低Jeko-1细胞Cyclin D1的表达水平和促进caspase-9的裂解。在药物作用的第5天，联合用药组与对应浓度的单药13cRA相比对细胞的增殖抑制作用和促凋亡作用差异无统计学意义（P值均>0.05）。分析其可能原因与观察的第5天，培养基中的营养成分耗竭代谢产物增加或药物的最大效应有关。值得一提的是本研究中较高浓度的实验药物组表现出与阳性对照相似或更强的抗Jeko-1细胞增殖作用。