[Prognostic significance of early assessment of minimal residual disease in acute myeloid leukemia with mutated NPM1 patients].

Objective: To explore prognostic significance of early assessment of minimal residual leukemia (MRD) in adult patients with de novo acute myeloid leukemia (AML) with mutated NPM1.
Methods: The response, NPM1 mutated transcript level after induction chemotherapy and the first 2 cycles of consolidation chemotherapy, disease-free survival (DFS) and overall survival (OS) in 137 patients with AML with NPM1 mutations of A, B and D were retrospectively analyzed.
Results: Data of 137 patients were collected, 67 were male, the median age was 49 years (16-67 years) , 107 (78.1%) had normal karyotype, 57 (41.6%) had positive FLT3-ITD mutation, the median NPM1 mutated transcript level at diagnosis was 84.1%. Among the 134 evaluable patients, 115 (85.8%) achieved a complete remission (CR) . Multivariate analyses revealed that WBC<100×10(9)/L (OR=0.3, 95% CI 0.1-0.9, P=0.027) and first induction therapy with "IA10" protocol (OR=0.3, 95% CI 0.1-0.8, P=0.015) were factors associated with achieving a CR. With a median follow-up period of 24 months (range, 2 to 91 months) in 77 survived CR patients, the probabilities of DFS and OS at 3 years were 48.0% and 63.9%, respectively. Multivariate analyses showed that positive FLT3-ITD (HR=3.2, 95% CI 1.6-6.7, P=0.002) , high MRD level after 2 cycles of consolidation chemotherapy (NPM1 mutation transcript level <3-log reduction from the individual baseline, HR=23.2, 95% CI 7.0-76.6, P<0.001) and chemotherapy or autologous hematopoietic stem cell transplantation (auto-HSCT) rather than allogeneic HSCT (allo-HSCT) (HR=2.6, 95% CI 1.0-6.6, P=0.045) were the unfavorable factors affecting DFS, high MRD level at the time of achieving the first CR (NPM1 mutation transcript level <2-log reduction from the individual baseline, OR=2.5, 95% CI 1.0-6.1, P=0.040) and after 2 cycles of consolidation chemotherapy (HR=4.5, 95% CI 2.0-10.3, P<0.001) were the unfavorable factors affecting OS. Furthermore, DFS and OS rates at 3 years in those receiving chemotherapy or auto-HSCT were 39.7% and 59.1%, respectively; positive FLT3-ITD and high MRD level after 2 cycles of consolidation chemotherapy were independent factors associated with both shorter DFS (HR=3.5, 95% CI 1.6-7.6, P=0.002 and HR=8.9, 95% CI 3.8-20.7, P<0.001) and OS (HR=2.7, 95% CI 1.1-6.9, P=0.036 and HR=3.1, 95% CI 1.2-8.0, P=0.021) ; meanwhile, high MRD level at the time of achieving the first CR associated with shorter OS (HR=3.1, 95% CI 1.2-8.0, P=0.022) .
Conclusion: Positive FLT3-ITD mutation and high MRD level after induction or consolidation chemotherapy associated with poor outcomes in AML patients with mutated NPM1.

伴NPM1突变急性髓系白血病（AML）在成人AML中占28%~35%，其中正常核型占80%~85%，FLT3-ITD突变阳性约占40%[1]–[2]。在美国国家综合癌症网络（NCCN）指南和欧洲白血病网（ELN）推荐中，正常核型伴NPM1突变并缺乏FLT3-ITD突变（NPM1+/FLT3−）AML被归为预后良好型，而伴NPM1突变合并FLT3-ITD突变（NPM1+/FLT3+）AML归为预后差和中危Ⅰ型。国际上较为一致的观点为：伴NPM1+/FLT3+AML患者建议在第1次完全缓解（CR1）期接受异基因造血干细胞移植（allo-HSCT），而伴NPM1+/FLT3−AML患者建议化疗，如果复发，再考虑allo-HSCT。尽管伴NPM1+/FLT3−AML患者预后相对良好，但仍有近半数患者最终复发[3]，而且不少患者复发后没有再获CR的机会，因而无法接受allo-HSCT这一挽救性治疗。如何早期识别伴NPM1突变AML患者中的高危人群并予以及时干预，是值得关注的课题。国外有研究表明，伴NPM1突变AML患者某些治疗前特征和治疗后微小残留病（MRD）水平可以预示疾病复发和生存[3]–[8]，但国内缺乏报道。本研究回顾分析了我所初治伴有NPM1突变AML患者的治疗结果，探讨预后相关因素。

病例与方法

一、病例

自2007年7月1日至2015年12月31日，本所共收治初治成人伴NPM1突变AML患者156例，其中NPM1为主要突变类型（A、B、D）者为137例。所有患者经细胞形态学、免疫学、遗传学、分子生物学诊断分型[9]，除外骨髓增生异常综合征转化型AML、治疗相关AML及其他类型初发AML。患者无严重心、肺、肝、肾功能不全和重症感染，ECOG评分≤3分。随访截至2016年3月31日。

二、白血病相关检查方法和频率

骨髓细胞免疫表型分析方法见文献[10]。细胞遗传学分析：骨髓标本采用G显带法分析染色体核型。分子生物学检测：采用实时荧光定量PCR方法检测NPM1基因A、B和D三种主要突变体及AML1-ETO、PML-RARα、CBF-MTH11、MLL相关、BCR-ABL转录本水平，采用定性PCR方法检测FLT3-ITD突变[11]–[12]。

初诊时进行骨髓细胞形态学、免疫分型、染色体及分子学分析，筛选出NPM1基因主要突变类型阳性的患者，每个疗程化疗后复查骨髓细胞形态学及NPM1突变转录本水平。

三、治疗方案

1．诱导治疗：采用“3+7”方案[蒽环类药物去甲氧柔红霉素（IDA，8或10 mg/m2第1~3天）、柔红霉素（DNR，35~45 mg/m2第1~3天）或米托蒽醌（MIT，8或10 mg第1~3天）联合阿糖胞苷（Ara-C，100 mg/m2第1~7天）]、HAA方案或CAG方案化疗[13]。获得部分缓解（PR）患者采用原方案再诱导，未缓解（NR）者换用其他方案。

2．缓解后治疗：获得CR患者以原方案巩固1个疗程，再给予2~4个疗程大剂量Ara-C（2 g/m2，每12 h 1次，第1~3天），之后接受DA、MA、HAA等方案化疗，巩固治疗至少6个疗程。在CR1期，部分患者根据个人情况，在至少巩固治疗2个疗程后接受自体造血干细胞移植（auto-HSCT）或allo-HSCT，移植方案参见文献[14]–[15]。

四、评估指标及随访

CR、PR、NR、复发和总生存（OS）的评估标准参见文献[9]。早期死亡：在可以评估疗效前死亡。无病生存（DFS）时间：从第1次获得CR之日至复发或者任何原因死亡、末次随访之日的时间。患者NPM1突变转录本下降水平是以各时间点NPM1突变转录本水平较自身诊断时基线水平下降的对数级评估。

五、统计学处理

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。率的比较采用χ2检验，单因素分析P<0.1的变量代入二元logistic回归模型进行多因素分析。累积复发率（CIR）采用竞争风险模型R软件分析。DFS、OS采用Kaplan-Meier方法进行Log-rank检验，P<0.1的变量带入Cox回归模型进行多因素分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、患者诊断时的疾病特征

137例NPM1主要突变阳性的AML患者中，男67例，女70例，中位年龄49（16~67）岁，FAB分型为M4或M5型61例（44.5%），M1、M2或M6型76例（55.5%）。WBC、HGB、PLT中位数分别为31.8×109/L、88 g/L、66×109/L。染色体正常核型107例（78.1%），异常核型17例（12.4%），无结果13例（9.5%）。FLT3-ITD突变阳性57例（41.6%），NPM1突变转录本中位水平为84.1%（4.1%~509.9%）。

二、治疗反应

137例患者中，3例（2.2%）早期死亡。134例可评估的患者中，1个疗程诱导治疗后，98例（73.1%）获得CR，8例（6.0%）PR，28例（20.9%）NR。在36例1个疗程未获CR的患者中，30例继续诱导化疗，其中14例（46.7%）在第2个疗程后达CR，在第3和第5个疗程后获得CR分别有2例和1例。共计115例（85.8%）患者最终获CR。78例FLT3-ITD突变阴性患者与56例FLT3-ITD突变阳性患者总CR率分别为89.7%和80.4%。初始诱导治疗为“IA10”方案（IDA 10 mg/m2第1~3天联合Ara-C）者CR率为93.2%。MA、CAG、HAA、其他剂量IA方案的CR率差异无统计学意义，总体为77.0%。

三、影响获得CR的因素

分析134例可评估患者发病时特征[性别、年龄（以40岁为界）、FAB分型（是否为M4或M5型）、发病时WBC、HGB、PLT（分别以100×109/L、100 g/L、100×109/L为界）、染色体核型（是否正常）、FLT3-ITD（是否阳性）、NPM1突变转录本水平（以中位数85%为界）]和首次诱导方案（是否为“IA10”）与最终获得CR的关系。单因素分析显示，女性（91.4%对79.7%，P=0.052）、WBC<100×109/L（88.8%对66.7%，P=0.012）、PLT≥100×109/L（94.9%对82.1%，P=0.054）及首次诱导采用“IA10”方案（93.2%对77.0%，P=0.008）的患者获得CR的比例显著增高。多因素分析显示，WBC<100×109/L（OR=0.3，95% CI 0.1~0.9，P=0.027）、“IA10”方案（OR=0.2, 95% CI 0.1~0.8，P=0.015）是获得CR的有利因素。

四、化疗后MRD水平的动力学变化

108例连续治疗和随访的CR患者中，分别有103、99和93例在首次获得CR时及巩固1、2个疗程后评估了NPM1突变转录本水平，较治疗前自身基线水平分别中位下降了1.89、3和3个对数级（图1）。

图1

化疗后不同时间点NPM1突变转录本水平较治疗前自身基线下降情况

五、复发和生存

未获CR患者均于8个月内死亡、放弃治疗或失访。115例终获CR的患者中，108例持续治疗并随访，中位随访19（1~91）个月，其中77例存活的CR患者中位随访24（2~91）个月。

观察期内，75例（69.4%）持续接受化疗，其中FLT3-ITD突变阳性患者21例（26.9%）。在CR1状态下，3例（2.8%）FLT3-ITD突变阴性患者在巩固治疗5~7个疗程后接受auto-HSCT；30例（27.8%）在中位巩固治疗3（2~6）个疗程后接受allo-HSCT（包括同胞全相合移植9例，单倍体移植20例，非血缘移植1例），其中FLT3-ITD突变阳性21例（70.0%）。最终，40例复发，包括36例化疗患者和4例allo-HSCT患者，CR1持续中位时间为7（2~36）个月。复发患者中，16例放弃治疗或失访，其余24例中仅6例（25.0%）再诱导化疗后获得CR2。此后，6例患者中，3例分别在获得CR2后3、8、9个月再次复发，1例处于CR2已2个月，1例2个月后失访，1例感染死亡。随访期内，31例死亡，其中27例死于复发，4例死于移植相关并发症。108例CR患者中，3年CIR、DFS和OS率分别为48.4%、48.0%和63.9%。78例持续化疗或auto-HSCT患者中，3年CIR、DFS和OS率分别为60.3%、39.7%和59.1%。30例allo-HSCT患者中，3年CIR、DFS和OS率分别为16.6%、69.5%和77.9%。

单因素分析患者发病时的疾病特征、首次诱导方案（是否为“IA10”）、首次诱导化疗是否获得CR和各疗程后MRD水平（与诊断时自身基线相比，NPM1突变转录本水平在首次获得CR时是否下降≥2个对数级、巩固1个疗程和2个疗程后是否下降≥3个对数级）以及获得CR1后的治疗模式[持续接受化疗（或auto-HSCT）或allo-HSCT]与DFS和OS的关系，单因素分析结果见表1。多因素分析结果显示：巩固治疗2个疗程后MRD高水平（NPM1突变转录本水平下降<3个对数级）是影响患者DFS（HR=23.1，95% CI 7.0~76.6，P<0.001）和OS（HR=4.5，95% CI 2.0~10.3，P<0.001）的共同不利因素；此外，FLT3-ITD突变阳性（HR=3.2，95% CI 1.6~6.7，P=0.002）和持续接受化疗或auto-HSCT（而非allo-HSCT）（HR=2.6，95% CI 1.0~6.6，P=0.045）是影响患者DFS的不利因素，首次获得CR时MRD高水平（NPM1突变转录本水平下降<2个对数级，HR=2.5，95% CI 1.0~6.1，P=0.040）是影响患者OS的不利因素。

表1

NPM1突变阳性急性髓系白血病CR患者生存影响因素的单因素分析（仅列出P<0.1结果）

因素	全部患者（108例）					化疗患者（78例）					FLT3-ITD突变阴性患者（66例）
	例数	3年DFS		3年OS		例数	3年DFS		3年OS		例数	3年DFS		3年OS
		%	P值	%	P值		%	P值	%	P值		%	P值	%	P值
年龄			0.060										0.062		0.037
<40岁	37	69.0									17	79.4		94.1
≥40岁	71	37.5									49	42.1		64.5
FLT3-ITD突变			0.034		0.017			<0.001		0.001
阴性	66	53.2		72.6		57	49.9		70.0
阳性	42	41.8		49.0		21	15.6		30.8
首次获得CR时MRD水平			0.068		0.059			0.025		0.029			0.095
下降≥2个对数级	45	58.7		75.4		35	56.2		74.7		30	67.0
下降<2个对数级	53	39.2		51.1		36	30.3		43.2		29	43.0
巩固1个疗程后MRD水平			0.010		0.019			0.001		0.003
下降≥3个对数级	61	52.1		72.2		46	46.8		71.3
下降<3个对数级	37	43.2		47.9		26	28.1		32.2
巩固2个疗程后MRD水平			<0.001		<0.001			<0.001		<0.001			<0.001
下降≥3个对数级	73	58.4		71.6		51	50.7		67.7		50	60.3
下降<3个对数级	20	0		12.7		17	0		12.4		10	0
治疗模式			0.035
化疗（或auto-HSCT）	78	39.7
Allo-HSCT	30	69.5

注：CR：完全缓解；DFS：无病生存；OS：总生存；MRD：微小残留病；auto-HSCT：自体造血干细胞移植；allo-HSCT：异基因造血干细胞移植

六、接受不同治疗模式CR患者的预后影响因素分析

1．非allo-HSCT患者：在78例接受化疗或auto-HSCT患者中，单因素分析见表1。多因素分析确定：FLT3-ITD突变阳性和巩固治疗2个疗程后MRD高水平是独立影响患者DFS（HR=3.5，95% CI 1.6~7.6，P=0.002和HR=8.9，95% CI 3.8~20.7，P<0.001）和OS（HR=2.7，95% CI 1.1~6.9，P=0.036和HR=3.1，95% CI 1.2~8.0，P=0.021）的共同不利因素；此外，首次获得CR时MRD高水平（HR=3.1，95%CI 1.2~8.0，P=0.022）是影响OS的不利因素。

根据影响DFS和OS的共同危险因素（FLT3-ITD突变阳性和巩固治疗2个疗程后MRD高水平）将患者分为三组：低危（无危险因素，43例）、中危（具有1个危险因素，16例）和高危（具有2个危险因素，9例），各组3年DFS率（56.9%、14.5%和0，P<0.001）和OS率（73.0%、30.5%和13.9%，P<0.001）差异均有统计学意义（图2）。

图2

具有不同危险因素的化疗患者无病生存（A）和总生存（B）曲线

注：危险因素为FLT3-ITD突变阳性和巩固治疗2个疗程后NPM1突变转录本水平较治疗前下降<3个对数级

进一步分析57例FLT3-ITD突变阴性患者，其中51例评估了2个疗程后MRD水平。8例巩固治疗2个疗程后MRD高水平的患者3年DFS率（0）显著低于43例MRD低水平的患者（56.9%），差异有统计学意义（P=0.001）。多因素分析证实，巩固治疗2个疗程后MRD水平为唯一影响患者DFS的因素（HR=4.0，95% CI 1.3~12.0，P=0.016），未发现与OS相关的因素。

在21例FLT3-ITD突变阳性患者中，17例评估了2个疗程后MRD水平。单因素分析，巩固治疗2个疗程后MRD高水平的患者2年DFS率（9例，0）显著低于MRD低水平者（8例，45.0%）（P<0.001），2年OS率有降低趋势（13.9对57.1%，P=0.067）。

2．allo-HSCT患者：30例在CR1接受allo-HSCT患者的单因素分析结果显示，FAB分型为M4/5和非M4/5患者相比，3年DFS率和OS率显著降低（45.7%对78.6%，P=0.048和46.7%对92.9%，P=0.006）；巩固治疗2个疗程后MRD高水平和低水平患者相比，3年DFS率和OS率亦显著降低（33.3%对74.9%，P<0.001和66.7%对82.4%，P=0.050）。

七、FLT3-ITD突变阳性和阴性CR患者的预后影响因素分析

1．FLT3-ITD突变阴性患者：在全部66例FLT3-ITD突变阴性患者中，接受化疗（或auto-HSCT）（57例）与allo-HSCT（9例）均不影响3年DFS率（49.9%对63.5%，P=0.593）和OS率（70.0%对85.7%，P=0.277）；在其中可评估的50例治疗2个疗程后MRD低水平患者中，治疗方式（化疗43例，allo-HSCT 7例）也不影响3年DFS率（56.9%对71.4%，P=0.536）和OS率（73.0%对85.7%，P=0.394）。可评估的10例巩固治疗2个疗程后MRD高水平患者中，8例持续化疗，其中5例复发，2例复发后死亡；2例接受allo-HSCT，1例复发后死亡。

基于患者疾病和治疗相关特征（如上文所述）的单因素分析结果见表1，多因素分析确认，巩固治疗2个疗程后MRD水平为唯一影响FLT3-ITD突变阴性患者DFS的因素（HR=5.1，95% CI 1.9~13.8，P=0.002），未发现与OS相关的因素。

2．FLT3-ITD突变阳性患者：在42例FLT3-ITD突变阳性患者中，接受allo-HSCT的患者3年DFS率（分别为75.0%和15.6%，P<0.001）和OS率（分别为73.5%和30.8%，P=0.027）显著高于化疗（或auto-HSCT）患者。

讨论

多项研究表明，伴NPM1突变AML患者CR率较高[1]–[2],[4]。本研究也证实这一点（CR率85.8%）。本所以往的研究显示，骨髓原始细胞CD34高表达（以7%为界）者CR率较低[16]。本研究结果显示，在我所的治疗模式下，发病时高WBC和首次诱导为非“IA10”方案不利于获得CR。ELN指南推荐中，AML诱导治疗“3+7”方案中IDA剂量为10~12 mg·m−2·d−1，DNR至少60 mg·m−2·d−1，Ara-C 100~200 mg·m−2·d−1。本研究中，首次诱导化疗采用“IA10”方案者CR率显著高于其他方案，显示规范化疗剂量的重要意义不容忽视。本研究未显示FLT3-ITD突变阳性与否和初诊时NPM1突变转录本水平与治疗反应率相关。

本研究结果显示：全部CR患者3年CIR、DFS和OS率分别为48.4%、48.0%和63.9%，FLT3-ITD突变阳性、持续接受化疗（或auto-HSCT，而非allo-HSCT）和巩固治疗2个疗程后MRD高水平是影响患者DFS的不利因素，首次获得CR时和巩固治疗2个疗程后MRD高水平是影响患者OS的不利因素。在持续化疗（或auto-HSCT）患者中，FLT3-ITD突变阳性和巩固治疗2个疗程后MRD高水平是影响患者预后的独立因素。FLT3-ITD突变阴性患者接受持续化疗（或auto-HSCT）与allo-HSCT治疗结果相似；而FLT3-ITD突变阳性患者能够获益于allo-HSCT。

业已证实，正常核型伴NPM1+/FLT3−AML属预后良好型AML[1],[17]，而正常核型伴FLT3-ITD突变阳性AML患者复发率高、生存率低[18]。伴NPM1+/FLT3+AML患者的预后无异于这两个基因均无突变或仅具有FLT3-ITD突变患者[4],[17],[19]。allo-HSCT可以改善AML伴有FLT3-ITD突变患者的预后。目前，公认的治疗推荐为：伴NPM1+/FLT3+AML患者应在CR1接受allo-HSCT，而伴NPM1+/FLT3−AML患者建议如果复发再考虑allo-HSCT[20]。本研究得到了相似的结论：无论是在全部CR患者还是持续化疗的CR患者中，FLT3-ITD突变阳性均为影响预后的不利因素，伴NPM1+/FLT3+AML患者获益于allo-HSCT，而NPM1+/FLT3−患者，接受化疗和allo-HSCT，DFS和OS差异无统计学意义。

研究发现，伴NPM1突变AML发病时某些疾病特征，如高龄、FLT3-ITD阳性、WBC高、PLT低、骨髓原始细胞CD34高表达、具有DNMT3A或IDH1/2突变与不良预后相关[1],[5],[16],[21]–[22]。近年，伴NPM1突变AML患者NPM1突变转录本水平已被视为监测MRD的可靠指标，后者与预后显著相关。2009年Schnittger等[5]报道，对252例初发伴NPM1突变AML患者进行17种不同类型NPM1基因检测，多因素分析显示，在化疗60 d后任意时间点MRD高水平均是不利于无事件生存的因素。之后，两项来自德国的研究表明伴NPM1突变AML患者诱导化疗结束后NPM1突变基因转阴或低水平时复发率低、OS改善[3],[6]。2016年初，Ivey等[8]报告了英国国家肿瘤研究所AML17研究结果，对346例患者2 569份外周血标本进行NPM1突变转录水平监测，第2个化疗周期后MRD阳性患者3年复发率明显高于转阴者（82%对30%），OS率明显降低（24%对75%），而且MRD水平是独立于经二代测序证实的FLT3-ITD和DNMT3A突变阳性等曾经报道的与伴NPM1突变AML不良预后显著相关的基线分子学特征、唯一影响复发和生存的因素。我们首次在国内报道了伴NPM1突变AML患者化疗后NPM1突变转录本水平对疾病预后的影响。在我所治疗模式下，CR患者中，首次获得CR时和巩固治疗2个疗程后MRD水平是影响预后的因素，特别是后者，无论是FLT3-ITD突变阳性或阴性患者中，巩固治疗2个疗程后MRD水平均显著影响其DFS和（或）OS。

正常核型伴NPM1+/FLT3−AML的治疗推荐为大剂量Ara-C作为巩固治疗，allo-HSCT作为疾病复发后的选择之一。而最新，Röllig等[23]报道了一项在德国进行的前瞻性研究结果，旨在比较同胞全相合allo-HSCT与非移植治疗伴NPM1突变AML患者的疗效。研究显示，无论是在全部患者还是NPM1+/FLT3−患者中，allo-HSCT组无复发生存率均显著高于非移植组，OS率相似。提示，即使在预后良好的NPM1+/FLT3−AML患者中，allo-HSCT也不失为一种选择。本研究结果显示，在伴NPM1+/FLT3−AML的化疗（或auto-HSCT）患者中，巩固治疗2个疗程后MRD高水平为影响预后的不良因素，8例患者中5例复发，提示伴NPM1+/FLT3−AML巩固治疗2个疗程后MRD高水平患者应被视为高危人群，可以尝试更积极的治疗，如allo-HSCT。目前公认，对于像伴NPM1+/FLT3−AML这类预后良好型的患者，推荐复发后再考虑移植。但本研究的复发患者中，再次获得CR的概率仅25%。提示若等到复发后，大部分患者将丧失移植的机会。笔者建议，对于伴NPM1+/FLT3−AML患者，应在MRD的监测下指导治疗选择，如MRD水平高者，应在CR1期接受移植。最终这些患者能否获益于allo-HSCT，尚需开展前瞻性研究予以证实。

本研究有以下局限：为回顾性研究，诱导和巩固化疗方案不完全统一，选择移植是根据患者意愿、经济条件、供者等多种因素，而非仅仅是疾病本身，只针对NPM1的主要突变类型进行监测，少数CR患者未在每个疗程后监测NPM1基因，故并非所有患者评估了MRD。

总之，我们的研究结果提示，在伴NPM1突变的AML患者中，高WBC和非标准诱导方案不利于获得CR，伴有FLT3-ITD突变者预后差，获得CR者巩固治疗2个疗程后MRD水平是影响预后的重要因素。