[Influence of RNA interference on MSI-2 gene in THP-1 cell and expression of NUMB].

OBJECTIVE: To investigate the effect of small interfering RNA（siRNA）for MSI-2 on the growth, apoptosis and NUMB expression of THP-1 cells.
METHODS: Three siRNA for MSI-2 gene was designed and transfected into THP- 1 cells. The cell inhibition, colony formation and apoptosis were determined. The protein expression of NUMB, caspase- 3 and PARP were detected by Western blotting.
RESULTS: After MSI- 2 expression of THP- 1 cells was down- regulated for 24 hours, cell inhibition of siRNA MSI-2 group was（47.89±7.64）%, obviously higher than that of negative control group（P=0.005）. After 9 days, cell colony count of siRNA MSI-2 group was 7.50±1.53, also lower than that of negative control group（35.75±7.46, P<0.001）. In addition, apoptotic rates of siRNA MSI- 2 group at 24 hours ［（15.22±1.52）%］and 48 hours［（33.83±3.96）%］were significantly higher than those of negative control group（P=0.008 and P=0.001, respectively）. Accordingly, activations of caspase-3 and PARP and increased NUMB were observed in siRNA MSI- 2 group.
CONCLUSION: siRNA for MSI- 2 gene could increase the expressions of NUMB to inhibit the proliferation and induce apoptosis of THP-1 cells.

Musashi基因家族包括Musashi-1 (MSI-1)和Musashi-2(MSI-2)，是一组mRNA结合蛋白，MSI-1在人造血干／祖细胞中低表达或不表达，而MSI-2呈现高表达，对维护后者细胞功能状态起着重要作用[1]。研究表明，MSI-2表达水平随慢性髓性白血病(CML)进展而逐渐增高，并与BCR-ABL有协同作用。MSI-2高表达预示急性髓系白血病(AML)预后不良[2]。最近，我们也发现MSI-2高表达不仅是AML预后不良指标[3]，也是急性淋巴细胞白血病(ALL)预后风险因素[4]。然而，MSI-2基因在急性白血病中具体作用机制尚不清楚。因此，本研究以AML细胞株THP-1细胞为研究对象，观察MSI-2沉默对细胞增殖、凋亡及潜在靶基因NUMB表达的影响，初步探讨MSI-2在急性白血病中分子作用机制。

材料和方法

一、细胞株与主要试剂

THP-1细胞购于中国科学院上海细胞研究所。RPMI 1640培养基和新生牛血清购于美国Gibco公司；脂质体(Lipofectamine™ RNAiMAX)转染试剂和MSI-2定量PCR引物购于美国Invitrogen公司；caspase-3、PARP和NUMB抗体购自美国Cell Signaling公司；MSI-2和β-actin抗体购自美国Santa Cruz公司；MTT试剂购于美国Sigma公司，Annexin Ⅴ/PI试剂盒购自美国BD公司。

二、方法

1．细胞培养：THP-1细胞接种于含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中，接种细胞密度为(2~5)× 105/ml，置37 °C、5% CO2的饱和湿度培养箱中培养，1~3 d传代1次。取对数生长期的细胞进行实验。

2．细胞转染：将THP-1细胞分为三组，分别采用3种不同siRNA片段(HSS133729、HSS133730、HSS133731)干扰THP-1细胞，同时设置空白对照组和阴性对照组(无关序列RNA)。采用脂质体(Lipofectamine™ RNAiMAX)转染法转染siRNA片段。以10 nmol/L阳性对照RNA(红色荧光标记)按说明书分别接种THP-1细胞(细胞密度为4× 105/ml)，转染24、48 h后收集细胞，用荧光显微镜和流式细胞仪检测THP-1细胞转染率，定量PCR和Western blot法验证干扰效率并进行后续实验。

3．实时定量RT-PCR法检测MSI-2 mRNA表达：提取不同处理组细胞的总RNA，取2 µg总RNA为模板，用随机引物反转录合成cDNA，采用GAPDH管家基因作为内参。反应体系为25 µl: 2× SYBR @Premix Ex Taq™ Ⅱ12.5 µl，内参基因和目的基因上、下游引物终浓度0.4 µmol/L，cDNA模板1 µl，加DEPC双蒸水补足25 µl，按说明书操作。PCR条件：95 °C预变性3 min, 95 °C 15 s, 60 °C 1 min，40个循环。PCR收集荧光信号，制作GAPDH、MSI-2熔解曲线，均为单一熔解峰提示PCR特异性较好。反应体系在BIO-RAD仪器上进行，结果用2−ΔΔCt表示。

4．Western blot法检测MSI-2、PARP、capase-3和NUMB蛋白表达：收集转染siRNA 24 h的THP-1细胞并提取蛋白，用Bradform法测定样本蛋白浓度。各组取50 µg，经120 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，将蛋白转至PVDF膜上。50 g/L脱脂奶粉溶液封闭液室温封闭2 h，加入封闭液稀释的一抗(MSI-2 1:2 000) 4 °C过夜，以β-actin为内参。TBST洗4次，每次10 min；再将PVDF膜放入1:2 000二抗中室温孵育2 h洗膜。用化学发光显色试剂进行显色，凝胶成像系统成像。

5．MTT法检测THP-1细胞的增殖抑制率：将转染24 h后的细胞接种于96孔板(调整细胞密度为4× 105/ml)，每孔200 µl，培养48 h；加入5 mg/ml MTT溶液20 µl，继续培养4 h；吸去上清后每孔加入200 µl二甲基亚砜，避光振荡10 min，使蓝紫色结晶充分溶解，酶标仪上读取570 nm波长处吸光度(A)值。每组设5个平行孔，实验重复3次。按下式计算细胞增殖抑制率。

6．细胞集落生成检测：将转染siRNA 24 h后的THP-1细胞调整密度为1×103/ml，接种于甲基纤维素培养基，进一步观察转染后集落形成能力。

7．细胞凋亡的检测：选取干扰效率最高的一组细胞，加入Annexin Ⅴ和PI溶液染色，混匀后于室温避光孵育，然后上流式细胞仪进行分析。

三、统计学处理

应用SPSS10.0软件进行统计学分析，计量资料采用±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1．MSI-2 siRNA干扰效率验证：与阴性对照相比，HSS133729、HSS133730和HSS133731转染24 h后，THP-1细胞MSI-2 mRNA表达水平分别为(69.02±8.45)%、(32.47±12.12)％和(57.50±15.06)%。Western blot法对MSI-2蛋白表达水平测定结果与RT-PCR结果类似，siRNA转染组条带亮度明显弱于阴性对照组，其中HSS133730转染组最弱(图1)。

图1

Western blot法检测不同siRNA片段转染THP-1细胞24 h MSI-2蛋白表达变化

1：阴性对照组（无关序列RNA）；2：HSS133729转染组；3：HSS133730转染组；4：HSS133731转染组

2．MSI-2 siRNA对THP-1细胞增殖的影响：转染MSI-2 siRNA 24 h后，我们用MTT法检测细胞增殖抑制率。结果显示，与阴性对照组相比，HSS133729、HSS133730、HSS133731转染组THP-1细胞增殖抑制率分别为(2.09±2.99)% (47.89±7.64)％和(5.23±4.11)% (t值分别为1.207、10.850、1.266，P值分别为0.351、0.008、0.333)。此外，我们通过甲基纤维素集落形成实验检测集落生成能力。结果发现，阴性对照组、HSS133729、HSS133730和HSS133731转染组集落数分别为35.75±7.46、36.00±9.56、7.50±1.53和25.25±4.35。与阴性对照组相比，HSS133729转染组集落数无明显变化(t=−0.041，P=0.968)，HSS133730组集落数则明显减少(t=7.382，P<0.001)，HSS133731组集落数有减少趋势(t=2.433，P=0.051)。

3．MSI-2 siRNA干扰对THP-1细胞凋亡的影响：转染24 h后，HSS133730组凋亡率为(15.22±1.52)%，明显高于阴性对照组的(9.67±1.27)% (t=−4.863，P=0.008)；转染48 h后，HSS133730组凋亡率为(33.83±3.96)%，明显高于阴性对照组的(12.42±2.07)% (t=−8.295，P=0.001) (图2)。Western blot法检测转染siRNA 24 h THP-1细胞凋亡相关蛋白的表达，结果显示HSS133730转染组的PARP和caspase-3剪切带比阴性对照组明显增高(图3)。

图2

流式细胞术检测MSI-2 siRNA干扰对THP-1细胞凋亡的影响

图3

Western blot法检测MSI-2 siRNA对THP-1细胞PARP和caspase-3蛋白表达的影响

1：阴性对照组（无关序列RNA）；2：HSS133730转染组

4．MSI-2 siRNA对MSI-2潜在下游基因NUMB表达的影响：用Western blot检测发现，与阴性对照组相比，HSS133730转染组MSI-2表达明显下调，而NUMB表达明显上调(图4)。

图4

MSI-2 siRNA对THP-1细胞NUMB蛋白表达水平的影响

1：阴性对照组（无关序列RNA）；2：HSS133730转染组

讨论

AML是临床上常见的一种造血干／祖细胞的恶性克隆性疾病。近些年来，随着科学技术不断进步，人们对AML分子发病机制的认识已经有了很大的提高，如FLT3-ITD、NPM1、TET2等基因突变[5]–[7]和SET、MMP-9等基因的异常表达[8]–[9]，这些基因均参与了AML发生或发展过程，可能成为治疗靶点。

近年来国外几项研究及我们的研究结果均表明AML患者MSI-2表达水平高于正常人，并与预后呈负相关。为此，我们选用AML细胞株THP-1细胞作为研究对象，观察下调MSI-2表达水平对细胞增殖的影响。我们针对MSI-2合成3个siRNA片段，尽管HSS133729和HSS133731片段使MSI-2 mRNA水平有所下降，但不到50%。而HSS133730片段干扰RNA后，对MSI-2 mRNA抑制最为明显，表达水平为阴性对照组的32.47%。该siRNA片段在转染THP-1细胞24 h后，细胞增殖抑制率明显高于阴性对照组。此外，甲基纤维素集落形成实验结果也证实转染组集落生成能力明显低于阴性对照组。Park等[10]在小鼠白血病模型中证实：敲除MSI-2基因能明显改善小鼠的生存状况，降低白血病细胞的增殖能力。这些结果均提示下调MSI-2表达水平，能抑制肿瘤细胞生长，从而也能解释MSI-2高表达更易导致AML患者治疗失败的现象。我们最近的报道显示MSI-2高表达也是成人急性B淋巴白血病(B-ALL)预后不良指标[4]。由此可推测，无论是AML还是成人B-ALL，MSI-2都是潜在治疗靶点。

癌基因通常通过抑制细胞凋亡或干扰细胞周期来促进细胞增殖。为了进一步探索MSI-2生物学功能，我们观察沉默MSI-2对细胞凋亡的影响。结果表明，沉默MSI-2基因24 h后，siRNA组凋亡率为(15.22±1.52)%，沉默48 h后，凋亡率为(33.83± 3.96)%，均明显高于相应阴性对照组。同时我们也观察到凋亡相关蛋白PARP和caspase-3剪切带也明显增高，这些与Zhang等[11]在K562细胞株中的研究结果相似。沉默MSI-2基因24 h后，siRNA组细胞增殖抑制率为(51.39±7.92)%，而此时凋亡率仅为(47.89±7.64)%[阴性对照组为(9.67±1.27)%]，提示细胞周期阻滞可能也参与其中机制。在将来研究中，我们拟用caspase广谱抑制剂抑制细胞凋亡，进一步观察沉默MSI-2对细胞周期及周期蛋白影响。

目前MSI-2的分子作用机制仍不是很清楚。由于MSI-2与MSI-1蛋白有75％的同源性[12]，因而推测与MSI-1类似，MSI-2能和NUMB基因mRNA结合来抑制NUMB蛋白翻译。而NUMB是一个抑癌基因，能通过NOTCH途径、p53途径和Hedhehog途径发挥生物学功能[13]。为此，我们观察沉默MSI-2基因对NUMB蛋白表达水平影响。结果表明，MIS-2 siRNA处理THP-1细胞后，随着MIS-2蛋白表达水平下降，NUMB蛋白表达却增高。提示沉默MSI-2基因后，减少了该基因对NUMB蛋白负性调控，从而抑制肿瘤细胞生长。

综上所述，我们发现通过siRNA方法下调THP-1细胞MSI-2表达水平，能抑制细胞增殖和集落形成能力并诱导细胞凋亡，同时观察到NUMB表达水平上调。提示MSI-2可能通过NUMB介导影响细胞增殖和凋亡。