Superoxide overproduction and kidney fibrosis: a new animal model.

OBJECTIVE: To establish whether the mutation in the Immp2L gene induces renal fibrosis and whether aging exacerbates renal morphology in mice.
METHODS: Female mutant mice with mutation in the inner mitochondrial membrane peptidase 2-like protein at 3 and 18 months of age were used. Renal fibrosis was analyzed using classic fibrosis score, Masson's trichrome staining, and analysis of profibrotic markers using real time polymerase chain reaction (superoxide dismutase 1, metalloproteinase-9, erythropoietin, transforming growth factor beta), and immunostaining (fibroblasts and Type IV collagen). Oxidative stress markers were determined by immunohistochemistry. The number of renal apoptotic cells was determined. Renal function was estimated by serum creatinine.
RESULTS: Young mutant mice had significantly more glomerulosclerosis than age-matched mice (p=0.034). Mutant mice had more tubular casts (p=0.025), collagen deposition (p=0.019), and collagen type IV expression (p<0.001). Superoxide dismutase 1 expression was significantly higher in young mutants (p=0.038). Old mutants exhibited significantly higher expression of the fibroblast marker and macrophage marker (p=0.007 and p=0.012, respectively). The real time polymerase chain reaction of metalloproteinase-9 and erythropoietin were enhanced 2.5- and 6-fold, respectively, in old mutants. Serum creatinine was significantly higher in old mutants (p<0.001).
CONCLUSION: This mutation altered renal architecture by increasing the deposition of extracellular matrix, oxidative stress, and inflammation, suggesting a protective role of Immp2L against renal fibrosis.

INTRODUCTION

Renal fibrosis is the major determinant of chronic kidney disease progression and typically results from chronic inflammation. Despite having different etiologies and clinical manifestations, most chronic fibrotic disorders have in common a persistent production of growth factors, proteolytic enzymes, angiogenesis factors, fibrogenic cytokines, and reactive oxygen species (ROS). These conditions stimulate deposition of extracellular matrix that progressively destroys the organ’s architecture and consequently its function.( ) Recently, ROS have been associated with kidney fibrosis in different diseases including chronic allograft nephropathy following transplantation,( ) and diabetic renal damage.( ) Furthermore, ROS have been shown to be important mediators of the adverse effects of the renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS) in renal and vascular tissue.( )

ROS are normal products of the aerobic metabolism and include, for example, superoxide anion (O2 -), hydrogen peroxide (H2O2), peroxynitrite (ONOO-), and the hydroxyl radical (-OH). Superoxide dismutase (SOD) is the main antioxidant enzyme for superoxide removal. In mammals, three isoforms of SOD have been described: cytoplasmic CuZnSOD (SOD-1), mitochondrial MnSOD (SOD-2), and extracellular CuZnSOD (SOD-3). When the production of ROS overcomes the antioxidant defense mechanisms, the result is oxidative stress. ROS can react with DNA, proteins, and lipids leading to, respectively, breakdown of DNA strands, protein oxidation, and lipid peroxidation.( ) By covalently modifying membrane-associated proteins, the membrane lipid peroxidation product 4-hydroxynonenal (4-HNE) may play a role in oxidative stress damage.( )

Mitochondria are the primary source of ROS, and it is well known that changes in mitochondrial function may lead to overproduction of superoxide. Thus, Immp2L mutant mice, which have a deficiency of the inner mitochondrial membrane peptidase 2-like protein (Immp2L) and present an abnormal signal peptide sequence processing of mitochondrial proteins cytochrome c1 (CYC1) and glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GPD2), exhibit overproduction of superoxide ions and high levels of ATP, probably due to a high mitochondrial respiration rate. Mitochondrial protein CYC1 in the kidney of these mutant mice has a higher molecular weight compared to wild type controls.( ) The abnormal size of this peptide is consistent with a loss of activity of Immp2L affecting the cleavage of the intermembrane space.( ) These mutant mice may be an interesting model to study superoxide-induced kidney effects without interfering comorbidities or secondary factors.

OBJECTIVE

To establish whether the mutation in the Immp2L gene induces renal fibrosis, inflammation, and oxidative stress, and whether aging exacerbates renal morphology in these animals, since aging is associated with changes in renal pathology and an increase in oxidative stress.

METHODS

Animals

Animals were bred and housed in the animal facilities of Wake Forest University Health Sciences. Experiments were approved by the local Animal Care and Use Committee (ACUC) and conducted according to the National Research Council publication Guide for Care and Use of Laboratory Animal (A08-071).

The mutant mouse, the Immp2L Tg (Tyr) 979 Ove, was produced with a transgenic insertion mutagenesis strategy. By injecting a tyrosinase minigene into fertilized eggs of Albino FVB mice and screening for offspring with phenotypes in the reproductive system, a mutant line with impaired fertility in both sexes was obtained. The genomic lesion of the mutant line was mapped to chromosome 12, disrupting the Immp2L gene.( ) Female mutants were age-matched with female wild-type animals. For the purpose of this study, 3 months of age were considered young and animals of 18 months of age were considered old (n=4 in each group).

The study was conducted from September 2009 to December 2012. All animal procedures, as blood, urine, and histological analyses, were made at the Wake Forest Institute for Regenerative Medicine.

Morphometric analysis

After fixation with 10% neutral buffered formalin, the kidney specimens were embedded in paraffin and sectioned at 4µm thickness. Glomerular injury was assessed according to Raji in hematoxylin and eosin stained sections( ) in 20 randomly chosen fields from cortex and medulla using 4 animals per group under 200x magnification. Briefly, the severity of the lesion was graded from zero to 4+ according to the percentage of glomerular involvement. Thus, a 1+ lesion represented an involvement of 25% of the individual glomerulus, while a 4+ lesion indicated that 100% of the glomerulus was involved. An injury score was then obtained by multiplying the degree of damage (zero to 4+) by the percentage of the glomeruli with the same degree of injury, which is, increase in mesangial matrix material or glomerulosclerosis. Tubular casts were counted in the same fields for all 20 chosen fields (n=4 per group). Tubular atrophy was considered as the dilation of tubules and areas in which normal tissue was substituted by fibrosis in the same chosen fields, and was quantified by the computerized morphometric software (AxioVision).

Masson’s trichrome staining

Extracellular matrix deposition was measured using Masson’s trichrome staining. Twenty randomly chosen fields of cortex and medulla were analyzed (n=4 animals per group) under 200x magnification. The collagen-to-parenchyma ratio was calculated in order to compare interstitial renal fibrosis in the four different groups.

Immunostaining

Four-µm paraffin sections were treated with antigen retrieval procedure in microwave, using Antigen Retrieval Solution Ready-to-Use (DAKO, Carpinteria, CA, United States). For cytoplasm proteins, cells were permeabilized with 0.1% Triton (Sigma, St. Louis, MA, United States) in PBS, for three minutes, rinsed in PBS, and blocked with 10% serum (FBS; GibcoTM Invitrogen, Carlsbad, CA, United States) for 30 minutes and protein block serum free solution, for 1 hour. Tissue was incubated with primary antibodies (SOD-1 1:500; type IV collagen 1:500; S100A4 1:50, all from Abcam Inc., Cambridge, MA, United States; CD68 1:200 Chemicon, CA; and 4-HNE 1:15,000 from Calbiochem, San Diego, CA, United States) for 1 hour, at room temperature, and biotinylated secondary antibodies for 30 minutes.

For assessment of SOD-1, S100A4, and type IV collagen, 20 random fields were analyzed in the kidney of each animal (n=4 per group) under 20x magnification. The positive areas were quantified by computerized morphometric analysis with AxioVision software. The final score for each animal represents the average of the 20 fields. For assessment of CD68, 20 random fields were analyzed for each animal (4 per group) under 20-x magnification. Positive cells were counted and compared among the groups. For evaluation of 4-HNE, 20 random fields were analyzed for each animal (n=4 per group) under 20x magnification. Positive tubules were considered when three or more cells were positive in the tubule. A percentage of positive tubules to total tubules was determined and compared among the groups.

Identification of apoptotic cells

Apoptotic cells in paraffin-embedded sections were visualized by terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) using TACS TdT kit (R&D Systems, Minneapolis, MN, United States) with immunoperoxidase visualization according to the manufacture’s protocol. Twenty random fields of sections from each animal were analyzed; positive cells were counted and compared among the groups using number of cells per field as unit.

Microscope specifications

We used Leica DM 4000B (Leica Mic Leica Microsystems, Bannockburn, IL, United States) microscope. Room temperature was 22°C; imaging medium was ImmersolTM 518F for fluorescent microscopy (Zeiss AG, Oberkochen, Germany). Images were performed in 20x HC PL FLUOTAR (NA 0.5) and 40x dry HCX PL FLUOTAR (NA 0.75). The camera used for all images was QImaging, model Retiga-2000RV (Surrey, BC, Canada), and the acquisition software was Image Pro 6.3 (Media Cybernetics, Bethesda, MD, United States).

Quantitative real time polymerase chain reaction

RNA was isolated from kidney tissues (n=4 per group). RNeasy Mini kit from QIAGEN was used for RNA extraction. RNA integrity and quantity were determined with spectrophotometry. Equal amounts of total RNA were reverse-transcribed with reverse transcriptase (GibcoTM Invitrogen, Carlsbad, CA, United States). Quantitative polymerase chain reaction (PCR) for SOD-1, transforming growth factor beta (TGF-ß), metalloproteinase-9 (MMP-9) and erythropoietin (EPO) were performed using TaqMan Gene Expression Assays with primer probes sets purchased from Applied Biosystems. Reactions were performed in triplicate. Quantification of messenger RNA (mRNA) was performed by the Delta-Delta CT method. Results were normalized to GAPDH and expressed as fold change in mutants compared to old wild type.

Renal function

To determine the serum creatinine, 30µL of blood was taken by cardiac aspiration when animals were euthanized (n=4 in each group: old mutants and old wild type animals). Creatinine was measured using QuantiChrom™ Creatinine Assay Kit, according to the manufacturer’s instructions.

Statistical analysis

Data were expressed as means ± standard deviation. Statistical analysis was performed using SigmaStat software. For comparison of two groups Student’s t test or Mann-Whitney Rank Sum test was performed. Differences among all groups were carried out using one-way analysis of variance (one-way ANOVA). We considered p<0.05 statistically significant.

RESULTS

Female mutant Immp2L mice at 3 and 18 months of age were compared to their respective wild-type counterparts. Young mutants were also compared to older mutants to assess the effects of aging in Immp2L mice on renal fibrosis, oxidative stress, and inflammation. No differences were found in animal’s body weight (young wild type: 31.77±7.92g; young mutant: 26.67±3.42g; old wild type: 35.02±7.19g and old mutant: 37.1±8.57g), or in the kidney weights (young wild type: 0.41±0.04; young mutant: 0.34±0.06; old wild: 0.39±0.06 and old mutant: 0.32±0.07). The ratio of kidney-to-body weight was also similar among the groups.

The alterations in renal morphology were characterized using indices of renal fibrosis in hematoxylin and eosin stained kidney sections. Glomerulosclerosis was graded zero to 4, and a total score was used to compare the groups. Young mutants had significantly increased glomerulosclerosis compared to young wild type animals (p=0.034); however, old mutants and old wild type mice exhibited similar scores (Figure 1A, and Figures 2A to 2D). Tubular casts were more prevalent in mutant animals regardless of age when compared to wild type controls. Thus, young and old mutants differed significantly from young and old wild type mice (p=0.029 and p=0.025). (Figure 1B, and Figures 2A to 2D). Tubular atrophy, represented by thick irregular tubular basement membranes with decreased diameter of tubules and increase in the interstitial space, was significantly more pronounced in mutant than in wild type mice, regardless of age (p=0.001 and p=0.005 for young and old mutant mice, respectively). Old mutants had significantly more tubular atrophy compared to young mutants (p=0.019), and to young controls (p=0.029). No differences were found between young and old wild type controls (Figure 1C, and Figures 2A to 2D). Young mutant mice had a significantly higher collagen-to-parenchyma ratio than aged matched controls as evaluated by Masson’s trichrome staining (p=0.019). Old mutants had significantly more collagen deposition compared to old wild type mice (p=0.029). Young mutants exhibited more collagen deposition than old wild type controls (p=0.009) (Figure 1D, and Figures 2E to 2H). In addition, collagen type IV immunostaining was significantly higher in young mutants compared to age-matched wild type mice (p=0.027). Old mutants and aged-matched wild type controls were also significantly different (p<0.001). Young mutant mice had a higher expression of collagen type IV than old wild type animals (p=0.004) (Figure 1E, and Figures 2I to 2L).

Figure 1

Analysis of renal fibrosis in the Immpl2 mutant mice and wild type controls. Glomerulosclerosis score (A), tubular cast formation (B), and tubular atrophy (C) were assessed using hematoxylin and eosin staining. Young mutant animals had significantly higher scores than the age-matched controls in A, B, and C while old mutants had more tubular casts and tubular atrophy than age-matched controls. The collagen deposition (D) was assessed by Masson’s trichrome staining. The collagen deposition was significantly higher in mutants, regardless of age. Type IV collagen (E) was measured using immunostaining and was higher in mutants. The epithelial-to-mesenchymal transition was analyzed using S100A4 staining (F). Old mutant mice exhibited significantly higher expression of fibroblast marker in tubular epithelial cells, representing the epithelial-to-mesenchymal transition

Figure 2

Representative pictures of hematoxylin and eosin, Masson’s trichrome staining, and profibrotic markers (collagen IV and S100A4) in the kidney of Immpl2 mice and wild type controls. Representative hematoxylin and eosin staining is shown in the upper part of the panel. (A) Young wild type animals. In young mutants (B), sclerotic glomeruli and some tubular atrophy are seen. Old wild type (C) showed some tubular atrophy and tubular cast formation. Old mutants (D) exhibited tubular atrophy and glomerulosclerosis. E to H represent young wild type, young mutant, old wild type, and old mutant mice respectively. Masson’s trichrome staining was used to measure total collagen/parenchyma ratio. Blue represents extracellular matrix and red, the parenchyma. Partial sclerosis of glomeruli is visible in G and H. Old mutant mice had a distortion of the organ architecture with substitution of tubular structures by collagen. Pictures I to L represent young wild type, young mutant, old wild type, and old mutant, respectively. Type IV collagen is shown by brown staining. Mutant mice had more type IV collagen deposition than age-matched controls. M to P represent young wild type, young mutant, old wild type, and old mutant, respectively. The brown staining corresponds to epithelial cells positive for S100A4, a fibroblast marker. All pictures were obtained in 20x magnification

Epithelial-to-mesenchymal transition was established by the analysis of fibroblast marker S100A4 only when the stain was present in tubular structures. The expression of S100A4 in young mutant animals was not different from that of young wild type mice (p=0.377). However, old mutant animals exhibited significantly higher S100A4 expression compared to aged matched wild type (p<0.001), young mutants (p<0.001), and young wild type mice (p=0.007) (Figure 1F, and Figures 2M to 2P).

SOD-1 and 4-HNE were analyzed using immunostaining to establish the effect of Immp2L mutation on oxidative stress in the kidney. SOD-1 immunostaining was considered positive when inside tubular-epithelial cells. Young mutant mice had a significantly higher expression of SOD-1 than the young wild type (p=0.037). Young mutants also had higher expression of SOD-1 compared to old mutants (p=0.039) and old controls (p=0.015). SOD-1 expression in old mutants was not different from that in wild type animals (Figure 3A, and Figures 4A to 4D). Interestingly, SOD-1 mRNA did not change in young mice, suggesting posttranscriptional regulation of SOD-1 protein in young mutant mice (Figure 5). 4-HNE immunostaining was considered positive when three or more cells were positive in the same tubule. Old mutants had significantly higher 4-HNE than wild types (p=0.024). Staining for 4-HNE was similar in young mutants compared to young age-matched controls (Figure 3B, and Figures 4E to 4H).

Figure 3

Analysis of superoxide dismutase 1 (SOD-1), 4-hydroxynonenal (4-HNE), CD68-positive cells, and apoptotic cells in the kidney of Immpl2 mice and wild type controls. Panel A displays SOD-1 expression in kidney of Immpl2 mice. Young mutants had significantly higher SOD-1 than aged matched controls, while no difference was found in old animals. 4-HNE had greater expression in kidneys from old mutants than in age-matched controls (B). Macrophage expression (C) was also higher in old mutants compared to old controls. Apoptosis was significantly higher in old mutants than in controls

Figure 4

Representative pictures of superoxide dismutase 1, 4-hydroxynonenal, CD68-positive cells, and the apoptotic cells in the kidney of Immpl2 mice. Panels A to D represent young wild type, young mutant, old wild type, and old mutant expression of superoxide dismutase-1, respectively. Young mutants exhibited a higher expression of superoxide dismutase 1 than age-matched controls. Panels E to H correspond to 4-hydroxynonenal, showing the higher expression in mutants, especially in old ones. Panels I to L correspond to the macrophage/monocyte infiltration in young wild type, young mutant old wild type, and old controls, respectively. Brown staining pointed out by the arrows represents the macrophages. Panels M to P demonstrate the apoptotic cells in young wild type, young mutant, old wild type, and old mutants, respectively. The black staining in the nuclei pointed out by arrows shows the positive cells. Old mutants had a higher number of black nuclei compared to wild type old animals. 20x magnification

Figure 5

Analyses of renal superoxide dismutase 1, erythropoietin, metalloproteinase-9 and transforming growth factor beta (TGF-β) gene expression in the kidney of Immpl2 mice and wild type controls. Renal superoxide dismutase 1, erythropoietin, metalloproteinase-9 and TGF-β mRNA were significantly higher in old mutants compared to old wild type mice

Macrophage and monocyte infiltration was determined by counting the number of CD68-positive cells in the kidney. The number of macrophages/monocytes was similar in young mice (young wild type: 4±1.4 cells per field versus young mutant mice: 3.75±1.25 cells per field). Old mutants had significantly more inflammatory cells than age-matched controls (old wild-type: 10±2.5; old mutants: 13.5±2.65; p=0.012) (Figure 3C, and Figures 4I to 4L).

Apoptotic cells were determined by using TdT staining. Young mutant mice had a tendency to exhibit a higher number of apoptotic cells than aged matched controls (young mutants: 27±7 cells per field versus young controls: 10±0.57 cells per field; p=0.072). However old mutants had significantly higher number of apoptotic cells compared to old wild type animals (old mutants: 18.67±3.66 cells per field versus old wild type mice: 5.33±1.33 cells per field; p=0.026) (Figure 3D, and Figures 4M to 4P).

Profibrotic genes were evaluated by real-time PCR (RT-PCR) (Figure 5). In mutant animals, MMP-9 mRNA was 2.5-fold higher than in the old wild type and the young animals. EPO gene was also upregulated six-fold. However, TGF-β was only 1.4-fold higher in mutant mice than in old wild type animals (Figure 5).

Since most of the architectural abnormalities were found in the old mutants, we analyzed the plasma creatinine in these animals. Young mutant mice had significantly higher serum creatinine levels than the young wild type animals (p<0.0001). Young mutants also had higher serum creatinine compared to old mutants (p=0.008) and old controls (p=0.0001).

DISCUSSION

Interstitial fibrosis is the common feature of most diseases progressing to chronic kidney failure. Human kidney biopsy studies showed a correlation between interstitial fibrosis and unfavorable prognosis.( , ) Kidney fibrosis in diabetes, aging and ischemia/reperfusion injury has been linked to excessive production of ROS, which is considered the major pathogenic pathway in these disorders.( ) The ROS excess is linked to alterations in mitochondrial metabolism leading to cell damage. The kidney is particularly affected by the aging process: age increases glomerulosclerosis and interstitial fibrosis.( ) Aging-associated changes at the cellular level include increased number of mutations in nuclear and mitochondrial DNA, lipofuscin and advanced glycation end products (AGE), increased oxidative stress and consequent increased apoptosis.( ) Ischemia/reperfusion injury in the kidney produces excess of ROS beyond this organ’s scavenging capacity, causing cell damage; excess of ROS has been associated with chronic allograft nephropathy after kidney transplantation.( ) A common feature of all these conditions is the ROS overproduction, which leads to renal fibrosis and progressive chronic disease. Oxidative stress and inflammation go hand-in-hand in many tissues. Oxidative stress induces the production of inflammatory cytokines that will, in turn, induce free radical production. One specific aldehyde is 4-HNE, that is increasingly recognized as a mediator and marker of cellular dysfunction. In the Immp2L mouse model, the overproduction of extracellular matrix, glomerulosclerosis, apoptotic cells, and up-regulation of pro-inflammatory genes may be related to the superoxide excess and show an accelerated aging process with function loss.

The Immp2L mutant mice have been shown to have a deficiency in the amount of CYC1 in various tissues, including the kidney. The mitochondria from these mice also showed excess levels of ATP and superoxide ion. The mitochondrial protein, CYC1, in the kidney was shown to have higher molecular weight than those in controls.( ) We found that compared to aged-matched controls, young mutants had a higher glomerulosclerosis score, tubular cast formation, and tubular atrophy. Analyses of extracellular matrix deposition, as reflected by deposition of total collagen and type IV collagen, were consistently higher in the young mutants than in aged-matched control animals. Old mutant animals had a similar glomerulosclerosis score and tubular atrophy as the aged-matched animals. However old mutant mice had significantly higher total collagen deposition and type IV collagen deposition than age-matched controls suggesting an increased extracellular matrix deposition, showing a fibrotic mechanism ongoing in the kidney. Macrophages/monocytes were more abundant in old mutant mice compared to age-matched controls showing a possible influx of inflammatory cells to the kidney tissue during the fibrotic process. Also, old mutants had higher creatinine levels then age-matched controls. Together, these findings suggest that mutation in mitochondrial Immp2L may alter the normal architecture of the kidney by increasing the deposition of extracellular matrix.

Compared to age-matched controls, young mutant animals had significantly higher SOD-1 expression, the most common superoxide scavenger enzyme in the kidney. Higher expression of this enzyme may represent a compensatory mechanism to overcome an increased superoxide production.( , ) In other models with increased ROS generation, the SOD expression seems to vary. Fujita et al.,( ) in two diabetic mice models (KK/Ta-Akita and C57BL/6-Akita), reported different susceptibility to diabetic nephropathy despite comparable hyperglycemia levels. KK/Ta-Akita mice developed albuminuria as the mice aged and presented with downregulation of SOD-1 and SOD-3, while C57BL/6-Akita had normal SOD expression and were more resistant to diabetic nephropathy. When KK/Ta-Akita mice were treated with a SOD mimetic, an attenuation of diabetic nephropathy was observed. Therefore, we may assume that the higher SOD-1 expression in young mutant mice, compared to the age-matched controls, is a protective mechanism, although not fully successful. The amount of SOD-1 did not differ between old mutants and the age-matched control animals. However, old mutants had upregulation of SOD-1 gene expression, possibly reflecting an attempt to scavenge the superoxide excess. These findings are in accordance with those of Dobashi et al.,( ) showing that the expression of antioxidant genes, such as SOD-1, is not directly coordinated with the respective protein expression. The loss of antioxidant enzymes may be a contributing factor towards renal damage as a result of the aging process.

In addition to an upregulation of SOD-1, old mutants had an increased 4-HNE protein in the kidney showing the breakdown of the superoxide scavenger mechanism leading to tissue damage. These findings suggest that while young animals produce more SOD-1, the tissue is only partially protected against renal injury.

Epithelial-to-mesenchymal transition defines a phenotypic transformation in epithelial cells.( , , ) After injury, epithelial cells lose their epithelial markers and start expressing some mesenchymal markers such as S100A4. Old mutant animals had significantly higher presence of S100A4 than their aged matched controls, while young mutants did not show this marker in the tubular epithelial cells. These observations suggest that during chronic exposure to superoxide, kidney cells lose their differentiation and start expressing fibroblast markers that represent the epithelial-mesenchymal transition. This transformation may be one of the sources of the overproduction of extracellular matrix in the kidney of old mutants represented as increased collagen type IV deposition. MMP-9 gene expression was also upregulated in old Immp2L mutants in an attempt to enzymatic digest the collagen deposition. These data suggest that mitochondrial Immp2L mutation leads to the epithelial-to-mesenchymal transition and fibrosis progression in the kidney.

Old mutant animals had a significantly higher number of apoptotic cells than aged matched controls, suggesting that Immp2L signaling may attenuate cell apoptosis. In the animal model of renal ischemia/reperfusion injury, administration of an antioxidant enzyme mimetic, MnTMPyP, attenuated the number of apoptotic cells( ) suggesting that oxidative damage is associated with an increase in cell apoptosis. The anti-apoptotic effects of exogenous EPO have been reported by several investigators.( - ) Recombinant human EPO (rhEPO) has multiple paracrine and autocrine functions that coordinate the local responses to injury attenuating both the primary (apoptotic) and the secondary (inflammatory) causes of cell death.( ) Moreover, clinical studies have reported that rhEPO reduces oxidative stress.( ) It can be speculated that in our model, the increase in EPO expression in older mutant mice was due to a compensatory response to renal damage.

CONCLUSIONS

A mutation in the Immp2L gene associated with increased levels of mitochondrial superoxide attenuated the antioxidant defense markers, and increased kidney interstitial extracellular matrix deposition and glomerulosclerosis with loss of function. We suggest that Immp2L is protective against the development of renal fibrosis. Moreover, the Immp2L mutant mouse model may be useful for further investigations of the role of superoxide in the development of kidney fibrosis and the aging process.

INTRODUÇÃO

A fibrose renal é o maior determinante da evolução crônica da doença renal e resulta de inflamação crônica característica. Apesar das diferentes etiologias e manifestações clínicas, a maioria dos distúrbios fibróticos crônicos tem em comum uma produção persistente de fatores de crescimento, enzimas proteolíticas, fatores de angiogênese, citocinas fibrinogênicas e espécies reativas de oxigênio (EROS). Essas condições estimulam a deposição de matriz extracelular que, progressivamente, destrói a arquitetura do órgão e deteriora sua função.( ) Recentemente, as EROS foram associadas à fibrose do rim em diferentes doenças, incluindo nefropatia crônica do aloenxertos após transplante( ) e nefropatia diabética.( ) Além disso, sabe-se que as EROS são importantes mediadoras dos efeitos adversos do sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA) nos tecidos renal e vascular.( )

As EROS são produtos normais do metabolismo aeróbico e incluem, por exemplo, o ânion superóxido (O2 -), peróxido de hidrogênio (H2O2), peroxinitrito (ONOO-), e o radical hidroxila (-OH). A superóxido dismutase (SOD) é a principal enzima antioxidante para remoção do superóxido. Em mamíferos, três isoformas de SOD foram descritas: CuZnSOD citoplasmático (SOD-1), MnSOD mitocondrial (SOD-2), e CuZnSOD extracelular (SOD-3). Quando a produção de EROS supera os mecanismos de defesa antioxidantes, o resultado é o estresse oxidativo. As EROS podem reagir com DNA, proteínas e lipídios, levando respectivamente à quebra dos filamentos de DNA, à oxidação de proteína e à peroxidação lipídica.( ) Pela modificação covalente de proteínas associadas às membranas, o produto de peroxidação lipídica da membrana 4-hidroxinonenal (4-HNE) pode desempenhar um papel no dano do estresse oxidativo.( )

As mitocôndrias são a principal fonte de EROS e sabe-se bem que alterações na função mitocondrial podem levar a uma produção excessiva de superóxido. Desse modo, camundongos com mutação de Immp2L, que têm deficiência da proteína semelhante à peptidase 2 da membrana interna da mitocôndria (Immp2L, sigla do inglês inner mitochondrial membrane peptidase 2-like protein), e que apresentam um processamento anormal na sequência de peptídeos de sinal das proteínas mitocondriais citocromo c1 (CYC1) e glicerol-3-fosfato desidrogenase (GPD2), exibem superprodução de íons de superóxido e níveis elevados de ATP, provavelmente em consequência de uma alta função mitocondrial. A proteína mitocondrial CYC1 no rim desses camundongos mutantes tem um peso molecular maior em comparação aos controles do tipo selvagem.( ) O tamanho anormal desse peptídeo é compatível com uma perda de atividade de Immp2L, que afeta a clivagem do espaço intermembrana.( ) Esses camundongos mutantes podem ser um modelo interessante para estudar os efeitos renais induzidos por superóxido sem a interferência de comorbidades ou fatores secundários.

OBJETIVO

Determinar se uma mutação em Immp2L induz a fibrose renal, inflamação e estresse oxidativo em modelos de camundongo mutante Immp2L, e se o envelhecimento exacerba a morfologia renal nesses animais, considerando que o envelhecimento está associado a alterações em patologia renal e a um aumento no estresse oxidativo.

MÉTODOS

Animais

Os animais foram gerados e abrigados no biotério do Wake Forest University Health Sciences. Os experimentos foram aprovados pelo comitê local de cuidado e uso de animais, o Animal Care and Use Committee (ACUC), e conduzidos segundo a publicação Guide for Care and Use of Laboratory Animal do National Research Council(A08-071).

O camundongo mutante Immp2LTg (Tyr) 979 Ove foi produzido com uma estratégia mutagênica de inserção transgênica. Pela injeção de um minigene de tirosinase nos ovos fertilizados de camundongos albinos FVB e triagem para filhotes com fenótipos no sistema reprodutor, uma linhagem mutante com fertilidade prejudicada em ambos os sexos foi obtida. A lesão genômica da linha mutante foi mapeada para o cromossomo 12, que altera o gene Immp2L.( ) As fêmeas mutantes foram pareadas por idade com fêmeas do tipo selvagem. Para os fins deste estudo, os animais com 3 meses de idade foram considerados jovens, e aqueles com 18 meses, idosos (n=4 em cada grupo).

O estudo foi realizado de setembro de 2009 a dezembro 2012. Todos os procedimentos nos animais, como exames de sangue, urina e histologia, foram realizados no Wake Forest Institute for Regenerative Medicine.

Análise morfométrica

Os espécimes de rim foram fixados em formol tamponado neutro 10%, incluídos em parafina e cortados com espessura de 4µm. A lesão glomerular foi avaliada segundo Raji em cortes corados com hematoxilina e eosina,( ) em 20 campos escolhidos aleatoriamente do córtex e medula, usando 4 animais por grupo com aumento de 200x. Em suma, a gravidade da lesão foi graduada de zero a 4+, segundo a percentagem de comprometimento glomerular. Assim, uma lesão 1+ representava um comprometimento de 25% do glomérulo individual, enquanto uma lesão 4+ indicava que 100% do glomérulo estava envolvido. Um escore de lesão foi, então, obtido ao multiplicar o grau de dano (zero a 4+) pela percentagem dos glomérulos com o mesmo grau de injúria, isto é, aumento no material da matriz mesangial ou glomeruloesclerose. Os cilindros tubulares foram contados nos mesmos campos para todos os 20 campos escolhidos (n=4 por grupo). A atrofia tubular foi considerada como a dilatação dos túbulos e áreas em que o tecido normal foi substituído por fibrose nos mesmos campos escolhidos, sendo quantificada pelo programa computadorizado morfométrico (AxioVision).

Coloração com tricrômio de Masson

A deposição da matriz extracelular foi medida usando a coloração com tricrômio de Masson. Vinte campos de córtex e medula escolhidos aleatoriamente foram analisados (n=4 animais por grupo) com aumento de 200x. A proporção colágeno/parênquima foi calculada para comparar a fibrose renal intersticial nos quatro diferentes grupos.

Imunocoloração

Os cortes de parafina medindo 4µm foram tratados com um procedimento de recuperação do antígeno em micro-ondas, usando a solução Antigen Retrieval SolutionReady-to-Use (DAKO, Carpinteria, CA, Estados Unidos). Para proteínas do citoplasma, as células foram permeabilizadas com Triton 0,1% (Sigma, St. Louis, MA, Estados Unidos) em PBS, por 3 minutos, enxaguadas em PBS e bloqueadas com soro a 10% (FBS, Gibco® Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos) por 30 minutos e em solução de bloqueador de proteína livre de soro por 1 hora. O tecido foi incubado com anticorpos primários (SOD-1 1:500; colágeno do tipo IV 1:500; S100A4 1:50 − todos da Abcam Inc., Cambridge, MA, Estados Unidos; CD68 1:200 Chemicon, CA; e 4-HNE 1:15.000 da Calbiochem, San Diego, CA, Estados Unidos), por 1 hora, em temperatura ambiente, e com anticorpos secundários biotinilados por 30 minutos.

Para avaliar SOD-1, S100A4 e colágeno do tipo IV, 20 campos aleatórios foram analisados nos rins de cada animal (n=4 por grupo) com aumento de 20x. As áreas positivas foram quantificadas por análise computadorizada morfométrica com o programa AxioVision. O escore final para cada animal representou a média dos 20 campos. Para avaliar o CD68, 20 campos aleatórios foram analisados para cada animal (4 por grupo) com aumento de 20x. As células positivas foram contadas e comparadas entre os grupos. Para avaliar o 4-HNE, 20 campos aleatórios foram analisados para cada animal (n=4 por grupo) com aumento de 20x. Os túbulos positivos foram considerados quando três ou mais células eram positivas no túbulo. A percentagem de túbulos positivos relativos ao total de túbulos foi determinada e comparada dentre os grupos.

Identificação de células apoptóticas

Células apoptóticas em cortes incluídos em parafina foram visualizadas por desoxinucleotidil-transferase terminal (TdT), com o kit TACS TdT (R&D Systems, Mineápolis, MN, Estados Unidos), com visualização por imunoperoxidase, conforme protocolo do fabricante. Vinte campos aleatórios de cada animal foram analisados; as células positivas foram contadas e comparadas entre os grupos usando o número de células por campo como unidade.

Especificações de microscópio

Foi utilizado um microscópio Leica DM 4000B (Leica Mic Leica Microsystems, Bannockburn, IL, Estados Unidos). A temperatura da sala era de 22°C; o meio de imagem foi Immersol® 518F para microscopia fluorescente (Zeiss AG, Oberkochen, Alemanha). As imagens foram feitas em 20x HC PL FLUOTAR (NA 0.5) e 40x HCX PL FLUOTAR (NA 0.75) seco. A câmera usada para todas as imagens foi QImaging, modelo Retiga-2000RV (Surrey, BC, Canadá), e o programa para aquisição foi o Image Pro 6.3 (Media Cybernetics, Bethesda, MD, Estados Unidos).

Reação em cadeia de polimerase quantitativa em tempo real

O RNA foi isolado de tecidos renais (n=4 por grupo). O kitRNeasy Mini Kit da QIAGEN foi usado para extração de RNA. A integridade e a quantidade de RNA foram determinadas por espectrofotometria. Quantidades iguais de RNA total passaram por transcrição reversa com transcriptase reversa (Gibco® Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos). Reação em cadeia de polimerase (PCR) quantitativa para SOD-1, fator de transformação do crescimento beta (TGF-β) e metaloproteinase-9 (MMP-9), eritropoietina (EPO) foi realizada usando ensaios TaqMan Gene Expression Assays com conjuntos de primer probes da Applied Biosystems. As reações foram feitas em triplicata. A quantificação de RNA mensageiro (mRNA) foi realizada pelo método Delta-Delta CT. Os resultados foram normalizados para GAPDH e expressos como vezes de mudanças nos mutantes comparados a animais idosos do tipo selvagem.

Função renal

Para determinar a creatinina sérica, foram coletados 30µL de sangue por aspiração cardíaca quando os animais foram sacrificados (n=4 em cada grupo: mutantes idosas e animais idosos do tipo selvagem). A creatinina foi medida com o kitQuantiChrom ® Creatinine Assay Kit, seguindo as instruções do fabricante.

Análise estatística

Os dados foram expressos como médias ± desvio padrão. A análise estatística foi feita por meio do programa SigmaStat. Para comparação dos dois grupos, foram usados o teste t de Student ou o teste U de Mann-Whitney. As diferenças entre todos os grupos foram avaliadas pelo teste de análise de variância (one-way ANOVA). Valor de p<0,05 foi considerado estatisticamente significante.

RESULTADOS

Camundongos fêmeas mutantes Immp2L com 3 e 18 meses de idade foram comparados aos respectivos pares do tipo selvagem. Jovens mutantes foram também comparadas a mutantes mais idosas, a fim de avaliar os efeitos do envelhecimento sobre camundongos Immp2L idosos quanto à fibrose renal, estresse oxidativo e inflamação. Nenhuma diferença foi encontrada no peso corpóreo do animal (selvagem jovem: 31,77±7,92g; jovem mutante: 26,67±3,42g; selvagem idosa: 35,02±7,19g; e idosa mutante: 37,1±8,57g), ou nos pesos dos rins (jovens selvagem: 0,41±0,04; jovens mutantes: 0,34±0,06; idosas selvagens: 0,39±0,06; e idosas mutantes: 0,32±0,07). A proporção rim/peso corporal também foi similar entre os grupos.

As alterações na morfologia renal foram caracterizadas usando índices de fibrose renal e cortes de rins corados com hematoxilina e eosina. A glomeruloesclerose foi classificada de zero a 4, e um escore total foi usado para comparar os grupos. Os jovens mutantes apresentavam glomeruloesclerose aumentada de forma significativa em comparação aos animais jovens do tipo selvagem (p=0,034); entretanto, camundongos fêmeas idosas mutantes e idosas do tipo selvagem exibiram escores semelhantes (Figura 1A e Figuras 2A a 2D). Cilindros tubulares foram mais prevalentes em animais mutantes, independente da idade, quando comparados a controles do tipo selvagem. Assim, mutantes jovens e idosas diferiram de forma significante de fêmeas jovens e idosas do tipo selvagem (p=0,029 e p=0,025) (Figura 1B e Figuras 2A a 2D). A atrofia tubular, representada por membranas basais tubulares espessas irregulares com diâmetro diminuído nos túbulos e aumento do espaço intersticial, foi muito mais pronunciada em fêmeas mutantes do que nas selvagens, independente da idade (p=0,001 e p=0,005 para animais jovens e idosos mutantes, respectivamente). Idosas mutantes apresentaram muito mais atrofia tubular em relação às mutantes jovens (p=0,019) e às jovens de controle (p=0,029). Nenhuma diferença foi encontrada entre controles jovens e idosas do tipo selvagem (Figura 1C e Figuras 2A a 2D). Jovens camundongos mutantes apresentaram uma proporção colágeno/parênquima significativamente maior que animais pareados por idade, conforme avaliação por coloração com tricrômio de Masson (p=0,019). Idosas mutantes apresentaram maior deposição de colágeno quando comparadas a animais idosos selvagens (p=0,029). Jovens mutantes exibiram maior deposição de colágeno que controles idosos do tipo selvagem (p=0,009) (Figura 1D e Figuras 2E a 2H). Além disso, a imunocoloração do colágeno do tipo IV foi marcadamente maior em jovens mutantes quando comparadas a animais do tipo selvagem, pareados por idade (p=0,027). Mutantes idosas e controles selvagens pareadas para a idade foram também significativamente diferentes (p<0,001). Animais mutantes jovens mostraram maior expressão de colágeno do tipo IV que animais idosos do tipo selvagem (p=0,004) (Figura 1E e Figuras 2I a 2L).

Figura 1

Análise de fibrose renal nos camundongos Immpl2 mutantes e controles do tipo selvagem. Escore de glomeruloesclerose (A), formação de cilindros tubulares (B) e atrofia tubular (C) foram avaliados usando coloração hematoxilina e eosina. Animais jovens mutantes apresentaram escores significativamente maiores que os controles da mesma idade em A, B e C, enquanto idosas mutantes tinham mais cilindros tubulares e atrofia tubular que os controles pareados para idade. A deposição de colágeno (D) foi avaliada usando a coloração com tricrômio de Masson. A deposição de colágeno foi significativamente maior nas mutantes, independentemente da idade. O colágeno do tipo IV (E) foi medido por imunocoloração e estava maior nas mutantes. A transição epitélio-mesenquimal foi analisada com coloração S100A4 (F). Camundongos fêmeas idosas mutantes exibiram expressão significativamente maior de marcador de fibroblastos em células epiteliais tubulares, representando a transição epitélio-mesenquimal

Figura 2

Fotos representativas com coloração hematoxilina e eosina, tricrômio de Masson e marcadores profibróticos (colágeno IV e S100A4) nos rins de camundongos Immpl2 e controles do tipo selvagem. A coloração representativa com hematoxilina e eosina é mostrada na parte superior do quadro. (A) Animais jovens do tipo selvagem. Em jovens mutantes (B), observam-se glomérulos escleróticos e um pouco de atrofia tubular. Animais idosos do tipo selvagem (C) demonstraram um pouco de atrofia tubular e formação de cilindros tubulares. Idosas mutantes (D) exibiram atrofia tubular e glomeruloesclerose. E a H representam jovens do tipo selvagem, jovens mutantes, idosas do tipo selvagem e idosas mutantes, respectivamente. A coloração com tricrômio de Masson foi usada para medir a proporção colágeno/parênquima total. O azul representa a matriz extracelular, e o vermelho, o parênquima. A esclerose parcial de glomérulos é visível em G e H. Camundongos idosos mutantes apresentaram uma distorção da arquitetura do órgão, com substituição de estruturas tubulares pelo colágeno. As figuras I a L representam jovens do tipo selvagem, jovens mutantes, idosas do tipo selvagem e idosas mutantes, respectivamente. Colágeno do tipo IV é mostrado pela coloração castanha. Camundongos mutantes apresentaram maior deposição de colágeno do tipo IV que os controles da mesma idade. M a P representam jovens do tipo selvagem, jovens mutantes, idosas do tipo selvagem e idosas mutantes, respectivamente. A coloração castanha corresponde a células epiteliais positivas para S100A4, um marcador de fibroblastos. Todas as fotos foram obtidas com aumento de 20x

A transição epitélio-mesenquimal foi determinada pela análise do marcador de fibroblastos, S100A4, apenas quando a coloração estava presente nas estruturas tubulares. A expressão de S100A4 em animais jovens mutantes não foi diferente daquela de camundongos fêmeas jovens do tipo selvagem (p=0,377). Todavia, animais mutantes idosas exibiram expressão significativamente maior de S100A4 quando comparadas a mutantes idosas do tipo selvagem (p<0,001), jovens mutantes (p<0,001), e animais jovens do tipo selvagem (p=0,007) (Figura 1F e Figuras 2M a 2P).

SOD-1 e 4-HNE foram analisados usando imunocoloração para determinar o efeito da mutação Immp2L sobre o estresse oxidativo no rim. A imunocoloração com SOD-1 foi considerada positiva quando dentro de células epiteliais tubulares. Camundongos jovens mutantes apresentaram uma expressão significativamente maior de SOD-1 que do tipo jovem selvagem (p=0,037). Jovens mutantes também mostraram maior expressão de SOD-1 em comparação com mutantes idosos (p=0,039) e controles idosos (p=0,015). A expressão de SOD-1 em idosas mutantes não foi diferente daquela de animais do tipo selvagem (Figura 3A e Figuras 4A a 4D). É interessante notar que o SOD-1 mRNA não sofreu alteração em camundongos jovens, o que sugere uma regulação após a transcrição da proteína SOD-1 em camundongos jovens mutantes (Figura 5). A imunocoloração de 4-HNE foi considerada positiva quando três ou mais células foram positivas no mesmo túbulo. Mutantes idosas apresentaram níveis significantemente maiores de 4-HNE que os tipos selvagens (p=0,024). A coloração para 4-HNE foi semelhante em jovens mutantes em comparação a controles jovens pareadas para idade (Figura 3B e Figuras 4E a 4H).

Figura 3

Análise de superóxido dismutase 1 (SOD-1), 4-hidroxinonenal (4-HNE), células CD68-positivas e células apoptóticas nos rins de camundongos Immpl2 e controles do tipo selvagem. Em A, está demonstrada a expressão de SOD-1 no rim de camundongos Immpl2. Jovens mutantes tinham níveis significativamente maiores de SOD-1 do que os controles da mesma idade, e nenhuma diferença foi encontrada em animais idosos. 4-HNE mostrou maior expressão nos rins de idosas mutantes do que nos controles da mesma idade (B). A expressão de macrófagos (C) foi também maior em idosas mutantes quando comparada à de idosas controle. A apoptose foi significantemente maior em idosas mutantes do que nos controles

Figura 4

Fotos representativas de superóxido dismutase 1, 4-hidroxinonenal, células positivas para CD68 e células apoptóticas nos rins de camundongos Immpl2. Em A a D, é representada a expressão de superóxido dismutase 1 em jovens do tipo selvagem, jovens mutantes, idosas do tipo selvagem e idosas mutantes, respectivamente. Jovens mutantes exibiram uma maior expressão de superóxido dismutase 1 do que os controles pareados pela idade. E a H correspondem a 4-hidroxinonenal, mostrando a maior expressão em mutantes, especialmente nos mais idosos. I a L correspondem à infiltração de macrófagos/monócitos nos jovens do tipo selvagem, jovens mutantes, idosos do tipo selvagem e idosos controle, respectivamente. A coloração castanha indicada pelas setas representa os macrófagos. M a P demonstram as células apoptóticas de jovens do tipo selvagem, jovens mutantes, idosos do tipo selvagem e idosos mutantes, respectivamente. A coloração preta nos núcleos indicada pelas setas mostra as células positivas. As idosas mutantes apresentaram um número maior de núcleos pretos quando comparadas a idosas do tipo selvagem. Aumento de 20x

Figura 5

Análises de níveis renais de expressão gênica de superóxido dismutase 1, eritropoietina, metaloproteinase-9 e fator de transformação do crescimento beta (TGF-β) nos rins de camundongos Immpl2 e controles do tipo selvagem. Os níveis do DNA mensageiro do superóxido dismutase 1, da eritropoietina, da metaloproteinase-9 e do TGF-β nos rins estavam significativamente maiores em mutantes idosas em comparação às idosas do tipo selvagem

A infiltração por macrófagos e monócitos foi determinada pela contagem do número de células CD68-positivas nos rins. O número de macrófagos/monócitos foi semelhante em camundongos jovens (jovens do tipo selvagem: 4±1,4 células por campo versus camundongos jovens mutantes: 3,75±1,25 células por campo). Idosas mutantes apresentaram significativamente mais células inflamatórias que os controles pareados por idade (idosas do tipo selvagem: 10±2,5; idosas mutantes: 13,5±2,65; p=0,012) (Figura 3C e Figuras 4I a 4L).

As células apoptóticas foram determinadas usando a coloração TdT. Camundongos jovens mutantes apresentaram tendência de exibir um número maior de células apoptóticas que os controles da mesma idade (jovens mutantes: 27±7 células por campo versus controles jovens: 10±0,57 células por campo; p=0,072). Entretanto, idosas mutantes mostraram número significativamente maior de células apoptóticas quando comparadas a animais idosos do tipo selvagem (idosas mutantes: 18,67±3,66 células por campo versus camundongos fêmeas idosas do tipo selvagem: 5,33±1,33 células por campo; p=0,026) (Figura 3D e Figuras 4M a 4P).

Os genes profibróticos foram avaliados por PCR em tempo real (RT-PCR) (Figura 5). Em animais mutantes, a MMP-9 mRNA estava 2,5 vezes maior que nas idosas do tipo selvagem e nos animais jovens. O gene da EPO também estava com regulação positiva (seis vezes maior). Porém TGF-β estava apenas 1,4 vez maior em camundongos mutantes do que em animais selvagens idosos (Figura 5).

Já que a maioria das anormalidades estruturais foi encontrada nas idosas mutantes, analisamos a creatinina plasmática nesses animais. Camundongos mutantes jovens mostraram níveis significativamente maiores de creatinina sérica que os animais jovens do tipo selvagem (p<0,0001). Jovens mutantes também tinham níveis séricos de creatinina mais elevados quando comparados a idosas mutantes (p=0,008) e controles idosos (p=0,0001).

DISCUSSÃO

Fibrose intersticial é o fator comum da maioria das doenças que evoluem para insuficiência renal crônica. Estudos com biópsias de rins humanos mostraram correlação entre a fibrose intersticial e o prognóstico desfavorável.( , ) Fibrose renal em diabete, envelhecimento e lesão por isquemia/reperfusão foi associada à produção excessiva de EROS, que é considerada a principal via patogênica nesses transtornos.( ) O excesso de EROS está ligado a alterações no metabolismo mitocondrial, levando ao dano celular. O rim é afetado particularmente pelo processo de envelhecimento: a idade aumenta a glomeruloesclerose e a fibrose intersticial.( ) Alterações associadas ao envelhecimento no nível celular incluem um número aumentado de mutações no DNA nuclear e no DNA mitocondrial, lipofuscina e produtos finais da glicação avançada (AGEs), estresse oxidativo aumentado, e consequente aumento da apoptose.( ) Lesão por isquemia/reperfusão no rim produz excesso de EROS, além da capacidade sequestradora do órgão, causando dano celular; o excesso de EROS foi associado à nefropatia crônica do aloenxerto após transplante renal.( ) Uma característica comum em todas essas condições é a superprodução de EROS, que resulta em fibrose renal e doença crônica progressiva. O estresse oxidativo e a inflamação agem conjuntamente em muitos tecidos. O estresse oxidativo induz à produção de citocinas inflamatórias que, por sua vez, induzirão à produção de radicais livres. Um aldeído específico é o 4-hidroxi-2-nonenal, que é cada vez mais reconhecido como um mediador e marcador de disfunção celular. No modelo de camundongo Immp2L, a superprodução da matriz extracelular, a glomeruloesclerose, a células apoptóticas e a regulação positiva de genes pró-inflamatórios poderão estar relacionadas ao excesso de superóxido e demonstrar um processo acelerado de envelhecimento com perda de função.

Os camundongos Immp2L mutantes têm demonstrado uma deficiência na quantidade de CYC1 em vários tecidos, incluindo o rim. As mitocôndrias desses animais também demonstraram níveis excessivos de ATP e do íon superóxido. A proteína mitocondrial, CYC1, no rim tem um peso molecular maior que nos controles.( ) Verificamos que, quando comparados a controles da mesma idade, os animais jovens apresentaram um escore maior de glomeruloesclerose, formação de cilindros tubulares, e atrofia tubular. Análises da deposição da matriz extracelular, assim como é mostrada pela deposição total de colágeno do tipo IV, foram mais elevadas nos jovens mutantes do que nos animais controle da mesma idade, de forma consistente. Os animais idosos mutantes apresentaram um escore de glomeruloesclerose e de atrofia tubular semelhante ao dos animais pareados por idade. Entretanto, camundongos idosos mutantes tiveram deposição significativamente maior de colágeno total e deposição de colágeno do tipo IV que os controles da mesma idade, o que sugere uma deposição aumentada da matriz extracelular e mostra um mecanismo fibrótico que ocorre no rim. Macrófagos/monócitos foram mais abundantes em camundongos mutantes idosos em comparação aos controles da mesma idade, mostrando um possível influxo de células inflamatórias para os tecidos renais durante o processo fibrótico. Ainda, as idosas mutantes apresentavam níveis maiores de creatinina que os controles da mesma idade. Em conjunto, esses achados sugerem que a mutação no Immp2L mitocondrial possa alterar a arquitetura normal dos rins pelo aumento de deposição da matriz extracelular.

Quando comparados com controles da mesma idade, animais jovens mutantes apresentaram expressão significativamente maior de SOD-1, a enzima depuradora de superóxido mais comum no rim. A expressão mais elevada da enzima pode representar um mecanismo compensatório para vencer uma produção aumentada de superóxido.( , ) Em outros modelos com geração aumentada de EROS, a expressão de SOD parece variar. Fujita et al.( ), em dois modelos murinos diabéticos (KK/Ta-Akita e C57BL/6-Akita), relataram diferente suscetibilidade à nefropatia diabética, apesar dos níveis comparáveis de hiperglicemia. Os camundongos KK/Ta-Akita desenvolveram albuminúria à medida que envelheciam e apresentaram regulação negativa de SOD-1 e SOD-3, enquanto os C57BL/6-Akita tiveram expressão normal de SOD e eram mais resistentes à nefropatia diabética. Quando camundongos KK/Ta-Akita foram tratados com um mimético de SOD, foi observada uma atenuação da nefropatia diabética. Assim, podemos considerar que a maior expressão de SOD-1 em jovens camundongos mutantes, comparado aos controles pareados por idade, é um mecanismo protetor, embora não seja plenamente eficaz. A quantidade de SOD-1 só diferiu entre idosos mutantes e os controles da mesma idade. Entretanto, as idosas mutantes apresentaram regulação positiva da expressão gênica de SOD-1, o que possivelmente refletia uma tentativa de depurar o excesso de superóxido. Esses achados estão em concordância com os de Dobashi et al.,( ) mostrando que a expressão de genes antioxidantes, tais como SOD-1, não é diretamente coordenada com a respectiva expressão proteica. A perda de enzimas antioxidantes pode ser um fator contribuinte para dano renal como resultado do processo de envelhecimento.

Além de uma regulação positiva de SOD-1, idosas mutantes apresentaram um aumento da proteína 4-HNE no rim, o que mostrou a quebra do mecanismo depurador do superóxido levando ao dano tissular. Esses achados sugerem que, embora jovens animais produzam mais SOD-1, o tecido é apenas parcialmente protegido contra lesão renal.

A transição epitélio-mesenquimal define uma transformação fenotípica nas células epiteliais.( , , ) Após uma lesão, as células epiteliais perdem seus marcadores epiteliais e começam a expressar alguns marcadores mesenquimais, como S100A4. Animais idosos mutantes apresentaram uma presença significativamente maior de S100A4 do que seus controles pareados para idade, enquanto os jovens mutantes não mostraram esse marcador nas células epiteliais tubulares. Essas observações sugerem que, durante exposição crônica ao superóxido, as células renais perdem sua diferenciação e começam a expressar marcadores de fibroblastos que representam a transição epitélio-mesenquimal. Essa transformação pode ser uma das fontes da superprodução da matriz extracelular nos rins de idosas mutantes, representada como um aumento de deposição do colágeno do tipo IV. A expressão gênica da MMP-9 também estava com regulação positiva em mutantes idosas Immp2L na tentativa de digerir enzimaticamente a deposição de colágeno. Esses dados sugerem que a mutação mitocondrial Immp2L leva à transição epitélio-mesenquimal e à fibrose progressiva no rim.

Animais idosos mutantes apresentavam um número significativamente maior de células apoptóticas que os controles da mesma idade, sugerindo que a sinalização de Immp2L pode atenuar a apoptose celular. No modelo animal de lesão por isquemia/reperfusão renal, a administração de uma enzima antioxidante mimética, MnTMPyP, atenuou o número de células apoptóticas.( ) Isso sugeriu que o dano oxidativo estava associado a um aumento de apoptose celular. Os efeitos antiapoptóticos da EPO exógena foram relatados por vários pesquisadores.( - ) A EPO recombinante humana (rhEPO) tem múltiplas funções parácrinas e autócrinas que coordenam as respostas locais a danos, atenuando tanto as causas primárias (apoptóticas) e secundárias (inflamatórias) da morte celular.( ) Ainda, alguns estudos clínicos relataram que rhEPO reduziu o estresse oxidativo.( ) Pode-se especular que, no nosso modelo, o aumento na expressão de EPO em camundongos idosos mutantes tenha ocorrido por uma resposta compensatória ao dano renal.

CONCLUSÕES

Uma mutação no gene Immp2L, associada a aumentos nos níveis de superóxido mitocondrial, atenuou os marcadores de defesa antioxidante e aumentou a deposição de matriz extracelular intersticial renal e glomeruloesclerose com perda de função. Sugerimos que Immp2L seja protetor contra o desenvolvimento de fibrose renal. Além disso, o modelo de camundongo Immp2L mutante pode ser útil para futuras investigações sobre o papel do superóxido no desenvolvimento de fibrose renal e o processo de envelhecimento.