[Persistence of hepatitis A virus antibodies after primary immunization and response to revaccination in children and adolescents with perinatal HIV exposure].

OBJECTIVE: To assess possible factors associated with the loss of antibodies to hepatitis A 7 years after the primary immunization in children of HIV-infected mothers and the response to revaccination in patients seronegative for hepatitis A.
METHODS: Quantification of HAV antibodies by electrochemiluminescence was performed in 39 adolescents followed up at the Pediatric Aids Clinic of Federal University of São Paulo (Unifesp): 29 HIV-infected (HIVgroup) (median age: 12.8 years) and 10 HIV-exposed but non-infected (ENI group) (median age: 13.4 years). All of them received two doses of HAV vaccine (Havrix(®)) in 2002.
RESULTS: The median age at primary immunization (PI) was 5.4 years for HIV group and 6.5 years for ENI group. All children, from both groups, had antibodies to HAV >20 mIU/mL after PI. Seven years later, the ENI group showed a median concentration of antibodies = 253.5 mIU/mL, while the HIV group = 113.0 mIU/mL (Mann-Whitney test, p=0.085). All ENI group and 23/29 (79.3%) from HIV group mantained HAV antibodies 7 years after PI. The levels of hepatitis A antibodies in the primary vaccination were the only factor independently associated with maintaining these antibodies for 7 years. The group that lost HAV seropositivity was revaccinated and 83.3% (5/6) responded with antibodies >20 mUI/mL.
CONCLUSIONS: The antibodies levels acquired in the primary vaccination in the HIV group were the main factor associated with antibodies loss after HAV immunization.

Introduction

In recent years, advances in the diagnosis, treatment, and clinical and laboratory monitoring of the infection by the human immunodeficiency virus (HIV) in children have allowed longer survival and better quality of life for this population.1 , 2 In this sense, it is important to vaccinate HIV-infected children who will reach adulthood and monitor the maintenance of antibodies after vaccination.

To monitor and revaccinate HIV-infected patients when necessary can prevent vaccine-preventable disease outbreaks in this population.3 To protect adolescents infected with HIV against infection by the hepatitis A virus (HAV) is need, considering that the HIV/HAV coinfection can influence the clinical course of hepatitis A4 and be associated with an increase in HIV replication.5 , 6 Additionally, during adolescence, these individuals are more prone to liver disorders when exposed to sexually-transmitted diseases (STDs), prolonged use of antiretroviral drugs and opportunistic conditions.

A previous study carried out in the Service Center of the Division of Pediatric Infectious Diseases of Universidade Federal de São Paulo (CEADIPe/UNIFESP)7 showed that two doses of vaccine against hepatitis A, in addition to being well tolerated, resulted in an antibody titer >20 mUI/mL in children with perinatal HIV exposure, both infected ones and those exposed and non-infected (ENI).

The objective of this study was to analyze the persistence of antibodies against HAV seven years after the primary immunization and possible associated factors, as well as the response to revaccination of children and adolescents with perinatal exposure to HIV.

Method

This is a prospective cohort study with intervention, carried out between December 2009 and January 2011 in the Service Center of the Discipline of Pediatric Infectious Diseases (CEADIPe) of Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) and approved by the Institutional Review Board of Hospital São Paulo/Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). The free and informed consent form was signed by parents or guardians of all adolescents included in the study (CEP 1710/06).

A previous study on seroprevalence carried out at the Service identified children and adolescents who were seronegative for hepatitis A,8 who received two doses of the hepatitis A vaccine (Havrix; Glaxo SmithKline Beecham, Rixensart, Belgium) between 2002 and 2003, with a six months interval between doses.7 At the time of primary immunization,7 only those infected with HIV through vertical transmission were included; and the following were excluded from the study: patients who had serological evidence of previous infection with hepatitis viruses A, B or C, the ones who had received immunoglobulin in the previous six months, those who were using immunosuppressive drugs, or HIV-infected children who belonged to the clinical category C and immunological category 3.

Of the 32 HIV-infected patients who received primary immunization,7 two were not currently undergoing regular monitoring at the service, and one received an additional dose of hepatitis A vaccine. Thus, a total of 29 patients infected with HIV (HIV Group) were included in this study. Of the 27 patients exposed to HIV who were non-infected and received primary immunization,7 only 10 (ENI Group) are being followed at the service and were included in the present study. Hence, 39 of these subjects who were regularly followed at the service were included.

Clinical data of patients were obtained from the review of medical records: clinical and immunological category for HIV infection (CDC 1994)9; weight and height measurements used to calculate the Z-score for body mass index (BMI z-score) and z-scores for height/age (H/A z-scores) according to the reference standards and recommendations by the World Health Organization10; clinical events; hospitalizations, and age at start of antiretroviral therapy prescribed to the HIV Group.

As part of the routine clinical follow-up, patients in the HIV group underwent assessment of CD4+ T lymphocyte count and viral load (VL) of HIV every four months. CD4+ T cells were assessed by flow cytometry (FACS Calibur, BD Biosciences, Franklin Lakes, USA). The HIV viral load quantification was performed through RT-PCR (Cobas Amplicor) HIV-1 Monitor kit (Roche Diagnostics System, Basel, Switzerland) and Bayer Versant human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) RNA 3.0 (B-DNA) (Bayer, Tarrytown, New York). The following data were collected: CD4 + T lymphocyte count and HIV viral load quantification 30 days after primary vaccination and seven years later.

Quantification of total antibodies against HAV was performed using electrochemiluminescence by means of a commercial Elecsys Anti-HAV kit (Roche Diagnostics, Indianapolis, USA) seven years after the primary immunization. Plasma samples with antibody concentrations ≥20mIU/mL were considered positive, and those <20 mIU/mL were considered negative. A new measurement of hepatitis A antibodies was performed by electrochemiluminescence in stored samples related to 30 days after the primary vaccination (seven years before).

All patients with antibody concentration <20 mIU/mL for HAV received two doses of the same vaccine used in the primary vaccination seven years before (Havrix), administered intramuscularly with an interval of six months between doses.

The statistical analysis for categorical variables was performed using the chi-square test, and the Mann-Whitney test was used for the quantitative ones. Factors associated with maintenance of hepatitis A antibodies >20 IU/mL were analyzed using uniand multivariate logistic regression. Thus, in search of possible factors that could differentiate patients from the HIV Group who lost their HAV seropositivity (anti-HAV antibodies <20 mIU/mL) during the period, from the ones who kept the seropositivity, some clinical, virological, and immunological events were assessed. The calculation of the odds ratio was performed using logarithmic transformation for the variables CD4+ T lymphocyte count, HIV viral load and quantification of HAV antibodies. Considering the sample size (n=29), the multivariate model could have a maximum of two explanatory variables, in addition to the adjustment constant of the model. Thus, to verify which variables were independently associated to the response, we adjusted the models containing a maximum of two of the following variables: CD4+ T lymphocyte count in the primary vaccination (CD4 PV), CD4+ T lymphocyte count seven years after the primary vaccination (CD4 7 years after PV), viral load seven years after the primary vaccination (VL 7 years after PV), episode of herpes zoster, and hepatitis A antibodies after the primary vaccination (HAV AB after PV). The variables VL seven years after the PV and HAV AB after PV were included in the adjustment as numerical variables, since in the univariate analysis, VL seven years after PV produced no adjustment in the Odds Ratio when categorized, and HAV AB after PV showed wide confidence interval when categorized. The level of statistical significance was set at p<0.05. Statistical analysis was performed using the Statistical Package for Social Sciences 16.0 (SPSS Inc. Chicago, IL, USA).

Results

Both groups were similar regarding age, H/A z-score, and BMI z-score (Table 1). All individuals in the ENI group, and 23/29 of individuals from the HIV group were seropositive for hepatitis A (HAV antibodies ≥20 mIU/mL) (Table 1). The levels of HAV antibodies showed no statistically significant differences between the two groups seven years after the primary immunization (HIV Group: 113.0 mIU/mL and ENI Group: 253.5mIU/mL; Mann-Whitney test, p=0.08). Both groups (HIV and ENI) showed significant decrease in the levels of HAV antibodies seven years after the primary vaccination (Fig. 1).

Table 1.

Characterization of the study population.

Characterization of Patients	HIV Group (n=29)	ENI Group (n=10)	p
Age in years [median (min; max)]	12.8 (9.7; 16.8)	13.4 (10.9; 16.9)	0.64
Female gender (%)	48	30	0.31
E/I Z-score [median (min; max)]	–0.47 (–2.21; +1.44)	+0.12 (–1.60; +1.28)	0.08
BMI Z-score [median (min; max)]	–0.10 (–2.64; +1.70)	–0.29 (–1.31; +1.64)	>0.99
Immune patients 7 years after PV (%)	79	100	0.17

PV, primary vaccination.

Figure 1.

Hepatitis A Antibodies in HIV Group and ENI Group 30 days and 7 years after primary immunization.

The following events showed a statistically significant difference between the groups in the univariate analysis: number of patients with herpes zoster, antibody levels 30 days after the primary vaccination, CD4 + T lymphocytes at the primary vaccination and after seven years (Table 2). In the multivariate model, the only variable that was independently associated with the maintenance of hepatitis A antibodies >20 mIU/mL was the level of hepatitis A antibodies assessed 30 days after the primary vaccination, whether the assessment was quantitative or categorized (antibodies > or <1,000 mUI/mL).

Table 2.

Univariate analysis of the HIV group according to maintenance of HAV antibodies 7 years after primary vaccination (HAV seropositive) and loss of HAV antibodies 7 years after primary vaccination (HAV seronegative).

	HIV Group			Odds Ratio	95%CI	p-value
	Seropositive		Seronegative
	VHA (n=23)		VHA (n=6)
Age at PV						0.924
≤5.5 years	12 (52.2%)		3 (50.0%)	1.09	0.18-6.58
>5.5 years	11 (47.8%)		3 (50.0%)	1.00
Age at PV (years)						0.655
Median (Min-Max)	5.1 (1.9-9.3)		6.0 (3.2-9.0)	0.88	0.56-1.39
CD4 PV						0.049
≤1,000	5 (21.7%)		4 (66.7%)	1.00
>1,000	18 (78.3%)		2 (33.3%)	7.20	1.01-51.39
CD4 PV						0.023
Median (Min-Max)	1,488 (629-2,717)		689 (572-1,501)	21.69	1.53-308.25
CD4 7 years after PV						0.026
≤500	6 (26.1%)		5 (83.3%)	1.00
>500	17 (73.9%)		1 (16.7%)	14.17	1.37-147.07
CD4 7 years after PV						0.018
Median (Min-Max)	634 (188-1,295)		200 (9-737)	13.09	1.57-109.39
VL PV						0.137
≤400	9 (39.1%)		0 (0.0%)	NE	NE
>400	14 (60.9%)		6 (100.0%)
VL PV						0.244
Median (Min-Max)	700 (200-84,000)		1500 (760-24,000)	0.78	0.51-1.19
VL 7 years after PV						0.295
≤50	6 (27.1%)		0 (0.0%)	NE	NE
>50	17 (73.9%)		6 (100.0%)
VL 7 years after PV						0.095
Median (Min-Max)	1,277 (25-94,250)		14,004 (147-58,078)	0.68	0.43-1.07
Clinical Cat. PV						0.497
N or A	15 (65.2%)		3 (50.0%)	1.88	0.31-11.52
B	8 (34.8%)		3 (50.0%)	1.00
Clinical Cat. after 7 years						0.655
N or A	10 (43.5%)		2 (33.3%)	1.54	0.23-10.15
B or C	13 (56.5%)		4 (66.7%)	1.00
Imunol Cat. PV						0.509
1	7 (30.4%)		1 (16.7%)	2.19	0.21-22.34
2 or 3	16 (69.6%)		5 (83.3%)	1.00
Imunol Cat. after 7 years						0.634
1	6 (26.1%)		1 (16.7%)	1.77	0.17-18.32
2 or 3	17 (73.9%)		5 (83.3%)	1.00
Zoster						0.005
Absent	22 (95.7%)		2 (33.3%)	44.00	3.18-608.16
Present	1 (4.3%)		4 (66.7%)	1.00
Age at ART start						0.193
Median (Min-Max)	1.7 (0.1-5.6)		3.2 (1.7-4.3)	0.67	0.36-1.23
HAV AB after PV						0.008
Median (Min-Max)	2,070 (269-10,260)		296 (103-1,175)	9.04	1.77-46.21
HAV AB after PV						0.003
<1000	2 (8.7%)		5 (83.3%)	1.00
≥1000	21 (91.3%)		1 (16.7%)	52.50	3.93-700.53

NE, not estimable; PV, Primary vaccination for A hepatitis; VL, viral load; CD4, TCD4+ Lymphocytes; AB, Antibodies; Cat, category; Imunol, immunological; ART, antiretroviral therapy and HAV-Hepatitis A virus.

The six patients who lost their seropositivity for HAV were revaccinated with two doses of vaccine against hepatitis A (Havrix), and five responded with antibody concentrations >20 mUI/mL. HAV-antibody levels are shown in Figure 2 at the following times: one month after the 1st booster dose, immediately before the 2nd booster dose, and one month after the 2nd booster dose.

Figure 2.

Dynamics of plasma levels of hepatitis A antibodies after revaccination in 6 patients from the HIV group without protective antibody levels seven years after primary immunization. Note: the sample from child #6 immediately before the 2nd booster dose was lost.

Table 3 and Figures 3 and 4 show clinical, virological, and immunological features of patients who lost seropositivity for hepatitis A during this follow-up period of seven years.

Table 3.

Clinical manifestations shown by children who did not maintain protective levels of hepatitis A antibodies seven years after vaccination. Patients Hospital

Patients	Hospital admissions	Pneumonia	Herpes Zoster	Upper respiratory tract infections	Chronic Otitis Media	Neurotoxoplasmosis	Others
1	4	2	1	>10 episodes		2
2		2	1	1
3		2	1
4		1	0	1			Parotitis/Gastritis
5		1	1	1			Diarrhea
6					1		Fractures

Figure 3.

Evolution of viral load at four different moments: 30 days after primary vaccination (PV), seven years after PV, immediately before the 1st and 2nd booster dose (REVAC) in 6 patients from the HIV group who did not respond to revaccination.

Figure 4.

CD4+ T cell count evolution at four different time: 30 days after primary vaccination (PV), 7 years after PV, immediately before the 1st and 2nd booster doses (REVAC) in 6 patients from the HIV group who did not respond to revaccination.

Discussion

The HAV vaccine is known to be highly immunogenic in healthy individuals.11 , 12 Additionally, serum antibody levels remain for long periods after vaccination. Bian et al., in 2010, in China, assessed 110 healthy children vaccinated against HAV and obtained a geometric mean of 61.6 mIU/mL of antibodies, with antibody persistence in 99.1% of individuals 10 years after the immunization schedule.13

This study showed that 79% of adolescents and children infected with HIV through vertical transmission maintained the seropositivity against HAV seven years after the primary immunization schedule, with two vaccine doses. These results were similar, from a statistical point of view, when compared to the group of ten adolescents exposed to, but not infected by, HIV, where 100% maintained HAV seropositivity (Chi-square, p=0.174) (Table 1). Moreover, there was no statistical difference between the median antibody levels of the two groups seven years after the primary vaccination (Fig. 1). The impossibility of assessing all children immunized in the previous study7 may have been responsible for the lack of statistical significance between the two groups (type II error or b error).

However, it is worth mentioning that, for the final model (the one that showed only HAV AB after PV), the power obtained with α set at 5% was 98.6%, indicating that this model had high probability of detecting an actual difference between the groups.

Other groups have assessed the persistence of HAV antibodies for shorter periods than the one analyzed in the present study and included patients with severe immunosuppression. Rigaud et al.,14 in 2008, observed 72% of seroconversion four weeks after vaccination, with a decrease to 66% at week 52. Weinberg et al.,15 in 2009, showed a seroconversion of 97% at week 8 after vaccination, which decreased to 90% 18 months later. The group of HIV-infected patients studied here showed a decrease from 100% to 79% in the percentage of individuals with antibody levels ≥20 mIU/mL for HAV in seven years. There is evidence of a decrease in vaccination antibody levels to other antigens in the population of HIV-infected children,3 even when they received antiretroviral therapy and were revaccinated.16 The proportion of immune HIV-infected children decreased from 88% to 85% for measles, 84% to 61% for mumps, and 100% to 79% in the case of rubella, three years after revaccination.16 Choudhury and Matin,17 in 2013, evaluated the persistence of tetanus toxoid antibodies in 24 HIV-infected children and observed levels >0.1 IU/mL in 62% of infected children and 100% of controls. These authors also showed that 71% responded to revaccination with levels >0.16 IU/mL. They noted that HIV-infected children need a tetanus toxoid booster dose before the recommended revaccination time, which is 5-10 years.

Several factors seem to be involved in the response to vaccination and maintenance of antibody seropositivity in HIV-infected individuals. The immunological status18 , 19 and the HIV viral load20 at the time of vaccination are known to be important. Similarly, the clinical, immunological and virological course21 must influence the maintenance of vaccination antibody levels.

The presence of co-infection, such as hepatitis C, as well as male gender was associated with lower response to hepatitis A vaccine in adult HIV-infected patients.22 The maintenance of specific antibodies against vaccine antigens is associated with better maturation and preservation of B cell memory compartment when the combined antiretroviral therapy is started early in children.23 In the current study, children who lost hepatitis A antibodies started antiretroviral therapy at a later period, although this finding was not statistically significant (p=0.19).

Disease progression caused by HIV occurs even in patients receiving antiretroviral therapy and undergoing stringent clinical follow-up. The six patients who lost their seropositivity for HAV were the ones with the most severe clinical and immunological impairment during the period, and only 50% of them received antiretroviral therapy, although all of them had treatment indication. It is worth mentioning that, over the seven-year period, the following data were observed (Fig. 3): a) the viral load increased in patients 1 and 2; b) four patients (1, 3, 5 and 6) had clinical progression of the disease, aggravating their clinical category (CDC-1994); c) four patients (1, 2, 5 and 6) showed a worsening in immunosuppression, aggravating their immunological category (CDC-1994), and d) patients (2, 4 and 6), who had the highest concentrations of HAV antibodies after revaccination were the ones who had a higher CD4+ T cell count at the time of the primary immunization (Fig. 4). The only patient who did not respond to revaccination (patient 1 in Fig. 4) was the one with the highest number of clinical complications, with important nutritional impairment, decreased z-BMI and immunological impairment in the period after vaccination. It is noteworthy that, at the time of the 1st revaccination dose, this adolescent had an undetectable viral load, responding with an antibody concentration of 19.7mIU/mL for HAV. As he started to show evidence of HIV viral replication, the antibody titers for HAV decreased again (Fig. 2), even though he received a 2nd booster dose and showed an increase in CD4+T cell count (from 65 cells/mm3 to 285 cells/mm3 in the period between the 1st and 2nd revaccination doses).

The small number of sample subjects, particularly in the ENI Group, who typically abandon follow-up soon after their uninfected status is verified, and the great variability of data may have impaired the statistical analysis of our findings. Still, it was possible to demonstrate the importance of temporal monitoring of antibody levels after hepatitis A vaccine in HIV-infected patients.

Although all adolescents exposed and not infected with HIV remained seropositive for HAV, 21% of the HIV-infected adolescents lost the seropositivity for hepatitis A seven years after the primary immunization, particularly those with more clinical complications and more severe immunosuppression. However, it is encouraging to verify that revaccination determines antibody production response at levels >20 mIU/mL in most assessed patients. It is noteworthy that no other studies in the literature have shown the association between post-vaccination antibody titers and their persistence in the long term, or the possible association between clinical events and the maintenance of these antibodies.

To maintain protection against hepatitis B, there are national24 and international25 recommendations on the revaccination of immunosuppressed individuals who lost their antibodies. There is no such recommendation regarding hepatitis A, but the data shown here suggest that, for children and adolescents infected with HIV, antibody titer monitoring is necessary, and revaccination is advisable to maintain protective levels of antibodies. It is known that HIV-infected patients should be vaccinated as early as possible, at a time when immunological impairment has not occurred yet. It can be concluded, based on the multivariate analysis shown here, that the level of hepatitis A antibodies in the first vaccination is the only factor independently associated with the maintenance of these antibodies after a period of seven years. This association was also observed by Sharapov et al.26 A less intense response at the primary vaccination suggests an immunological impairment at this moment. Nevertheless, 83.3% of patients seronegative for hepatitis A responded to revaccination, although the duration of these antibodies is something to be studied in the future.

Introdução

Nos últimos anos, os avanços no diagnóstico, tratamento e acompanhamento clínico e laboratorial da infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) em crianças permitiram maior sobrevida e melhor qualidade de vida para essa população.1 and 2 Nesse sentido, é importante vacinar crianças infectadas pelo HIV que chegarão à idade adulta e acompanhar a manutenção de anticorpos após a vacinação.

Monitorar e revacinar, quando necessário, os pacientes infectados pelo HIV pode prevenir surtos de doenças imunopreveníveis nessa população.3 Proteger adolescentes infectados pelo HIV contra a infecção pelo vírus da hepatite A (VHA) é necessário, na medida em que a coinfecção HIV/VHA pode influenciar a evolução clínica da hepatite A4 e associar-se a um aumento da replicação do HIV.5 and 6 Além disso, durante a adolescência, esses indivíduos estão mais sujeitos aos agravos hepáticos quando expostos a doenças sexualmente transmissíveis, ao uso prolongado de antirretrovirais e às doenças oportunistas.

Estudo prévio feito no Centro de Atendimento da Disciplina de Infectologia Pediátrica da Universidade Federal de São Paulo (CEADIPe/Unifesp)7 mostrou que duas doses da vacina contra hepatite A, além de bem toleradas, determinaram título de anticorpos acima de 20 mUI/mL em crianças com exposição perinatal ao HIV, tanto as infectadas quanto aquelas expostas e não infectadas (ENI).

O objetivo deste estudo foi analisar a persistência de anticorpos contra o VHA sete anos após a imunização primária e os possíveis fatores associados, assim como a resposta à revacinação de crianças e adolescentes com exposição perinatal ao HIV.

Método

Estudo de coorte prospectivo com intervenção feito entre dezembro de 2009 e janeiro de 2011 no Centro de Atendimento da Disciplina de Infectologia Pediátrica (CEADIPe) da Universidade Federal de São Paulo (Unifesp) e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital São Paulo/Universidade Federal de São Paulo (Unifesp). O termo de Consentimento Livre e Esclarecido foi assinado pelos pais ou responsáveis dos adolescentes incluídos no estudo (CEP 1710/06).

Um estudo prévio de soroprevalência no serviço identificou crianças e adolescentes soronegativos para a hepatite A8 que receberam entre 2002 e 2003 duas doses da vacina hepatite A (Havrix; Glaxo SmithKline Beecham, Rixensart, Bélgica), com intervalo de seis meses.7 Na época da imunização primária,7 foram incluídos apenas os infectados pelo HIV por transmissão vertical e excluídos da pesquisa os pacientes que apresentavam evidência sorológica de infecção prévia pelos vírus da hepatite A, B ou C, os que haviam recebido imunoglobulina nos últimos seis meses, aqueles que estavam em uso de imunossupressor ou as crianças infectadas pelo HIV que pertenciam à categoria clínica C e à categoria imunológica 3.

Dentre os 32 pacientes infectados pelo HIV que receberam a imunização primária,7 dois não estavam atualmente em acompanhamento regular no serviço e um recebeu dose adicional de vacina de hepatite A. Portanto, foram incluídos no estudo atual 29 pacientes infectados pelo HIV (Grupo HIV). Entre os 27 pacientes expostos ao HIV e não infectados que receberam a imunização primária, 7 somente 10 (Grupo ENI) permaneceram em acompanhamento no serviço e foram incluídos no estudo atual. Assim, foram incluídos para participar desta pesquisa 39 desses sujeitos que mantinham acompanhamento regular no serviço.

Os dados clínicos dos pacientes foram obtidos a partir de revisão dos prontuários médicos: categoria clínica e imunológica para infecção pelo HIV (CDC 1994);9 medidas de peso e estatura usadas para o cálculo do escore z de índice de massa corpórea (zIMC) e escore z de estatura/idade (zE/I), seguindo o padrão de referência e a preconização da Organização Mundial da Saúde;10 intercorrências clínicas; hospitalizações e idade de início da terapia antirretroviral recebida pelo Grupo HIV.

Como parte do acompanhamento clínico de rotina, os pacientes do Grupo HIV fizeram avaliação de linfócitos T CD4+ e da carga viral (CV) do HIV a cada quatro meses. Os linfócitos T CD4+ foram avaliados por citometria de fluxo (FACS Calibur, BD Biosciences, Franklin Lakes, USA). A quantificação da carga viral do HIV foi feita apor RT-PCR (Cobas Amplicor) HIV-1 Monitor kit (Roche Diagnostics System, Basel, Switzerland) e pela Bayer Versant human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) RNA 3.0 (B-DNA) (Bayer, Tarrytown, New York). Foram coletados os seguintes dados: contagem de linfócitos T CD4+ e carga viral do HIV 30 dias após a primovacinação e sete anos após.

A quantificação de anticorpos totais contra o VHA usou a eletroquimoluminescência, por meio do kit comercial Elecsys Anti-VHA (Roche Diagnostics, Indianapolis, USA) sete anos após imunização primária. Amostras de plasma com concentração de anticorpos ≥20 mIU/mL foram considerados positivas e <20 mIU/mL foram considerados negativas. Foi feita nova dosagem de anticorpos para hepatite A pela técnica de eletroquimioluminescência nas amostras armazenadas referentes a 30 dias após a primovacinação (há sete anos).

Todos os pacientes com concentração de anticorpos < 20 mIU/mL para o VHA receberam duas doses da mesma vacina usada na primovacinação há sete anos (Havrix(r)), administrada por via intramuscular com intervalo de seis meses entre as doses.

A análise estatística para variáveis categóricas foi feita por meio do teste do qui-quadrado e as quantitativas pelo teste de Mann-Whitney. Os fatores associados à manutenção de anticorpos para hepatite A acima de 20 UI/mL foram analisados por meio de regressão logística uni e multivariada. Assim, na busca de possíveis fatores que pudessem diferenciar os pacientes do Grupo HIV que perderam a soropositividade para o VHA (anticorpos anti-VHA <20 mIU/mL) durante o período e aqueles que mantiveram a soropositividade, alguns eventos clínicos, virológicos e imunológicos foram avaliados. O cálculo da razão de chance (odds ratio) foi feito a partir da transformação logarítmica para as variáveis da contagem de linfócitos T CD4+, carga viral do HIV e quantificação de anticorpos para VHA. Considerando-se o tamanho da amostra (n total = 29), o modelo multivariado poderia ter, no máximo, duas variáveis explicativas, além da constante de ajuste do modelo. Dessa forma, para verificar qual (is) variável (is) mostrava(m)-se independentemente associada(s) à resposta, ajustaram-se modelos que continham no máximo duas das seguintes variáveis: contagem de linfócitos T CD4+ na primovacinação (CD4 PV), contagem de linfócitos T CD4+ sete anos após a primovacinação (CD4 sete anos pós-PV), carga viral sete anos após a primovacinação (CV sete anos pós-PV), episódio de herpes zoster e anticorpos para o vírus da hepatite A após a primovacinação (AC VHA pós-PV). As variáveis CV sete anos pós-PV e AC VHA pós-PV entraram no ajuste como numéricas, uma vez que, na análise univariada, CV sete anos pós-PV não produziu ajuste no odds ratio quando categorizada e AC VHA pós-PV apresentou grande variabilidade no intervalo de confiança quando categorizada. Adotou-se como estatisticamente significante p<0,05. A análise estatística foi feita com o Statistical Package for Social Science 16.0 (SPSS Inc. Chicago,IL, USA).

Resultados

Os dois grupos avaliados eram semelhantes quanto à idade, ao escore z E/I e ao escore z IMC (tabela 1). Todos os indivíduos do grupo ENI e 23/29 dos indivíduos do grupo HIV permaneceram soropositivos para hepatite A (anticorpos anti-HVA ≥20 mIU/mL) (tabela 1). A concentração de anticorpos contra VHA não apresentou diferença estatisticamente significativa entre os dois grupos sete anos após a imunização primária (Grupo HIV: 113,0 mIU/mL e Grupo ENI: 253,5 mIU/mL; Mann-Whitney, p=0,08). Ambos os grupos (HIV e ENI) apresentaram queda significativa da concentração de anticorpos contra o VHA nos sete anos após a primovacinação ( fig. 1).

Tabela 1.

Caracterização da população estudada

Caracterização dos pacientes	Grupo HIV (n=29)	Grupo ENI (n=10)	p
Idade em anos [mediana (min;máx)]	12,8 (9,7;16,8)	13,4 (10,9;16,9)	0,64
Sexo feminino (%)	48,3	30	0,31
Escore z E/I [mediana (min;máx)]	–0,47 (–2,21; +1,44)	+0,12 (–1,60; +1,28)	0,08
Escore zIMC [mediana (min;máx)]	–0,10 (–2,64; +1,70)	–0,29 (–1,31; +1,64)	>0,99
Pacientes imunes sete anos após PV (%)	79	100	0,17

PV, primovacinação.

Figura 1.

Anticorpos contra hepatite A no Grupo HIV e no Grupo ENI 30 dias e sete anos após imunização primária.

Os seguintes eventos apresentaram diferença estatisticamente significativa entre os grupos na análise univariada: número de pacientes com herpes zoster, concentração de anticorpos um mês após a primovacinação, contagem de linfócitos T CD4+ na primovacinação e sete anos após (tabela 2). No modelo multivariado, a única variável que se mostrou independentemente associada à manutenção de anticorpos para hepatite A acima de 20 mUI/mL foi a concentração de anticorpos para hepatite A atingida um mês após a primovacinação, fosse ela avaliada quantitativamente ou de forma categorizada (anticorpos acima ou abaixo de 1.000 mUI/mL).

Tabela 2.

Análise univariada do grupo HIV de acordo com manutenção de anticorpos para VHA após sete anos da primovacinação (soropositivo VHA) e com perda de anticorpos para VHA após sete anos da primovacinação (soronegativo VHA)

	Grupo HIV		Odds ratio	IC 95%	p valor
	Soropositivo VHA (n=23)	Soronegativo VHA (n=6)
Idade VP					0,924
≤5,5 anos	12 (52,2%)	3 (50,0%)	1,09	0,18-6,58
>5,5 anos	11 (47,8%)	3 (50,0%)	1,00
Idade VP (anos)					0,655
Mediana (Min-Máx)	5,1 (1,9-9,3)	6,0 (3,2-9)	0,88	0,56-1,39
CD4 VP					0,049
≤1.000	5 (21,7%)	4 (66,7%)	1,00
>1.000	18 (78,3%)	2 (33,3%)	7,20	1,01-51,39
CD4 VP					0,023
Mediana (Min-Máx)	1.488 (629-2717)	689 (572-1501)	21,69	1,53-308,25
CD4 sete anos pós-VP					0,026
≤500	6 (26,1%)	5 (83,3%)	1,00
>500	17 (73,9%)	1 (16,7%)	14,17	1,37-147,07
CD4 sete anos pós-VP					0,018
Mediana (Min-Máx)	634 (188-1295)	200 (9-737)	13,09	1,57-109,39
CV VP					0,137
≤400	9 (39,1%)	0 (0%)	NE	NE
>400	14 (60,9%)	6 (100%)
CV VP					0,244
Mediana (Min-Máx)	700 (200-84.000)	1.500 (760-24.000)	0,78	0,51-1,19
CV sete anos pós-VP					0,295
≤50	6 (27,1%)	0 (0%)	NE	NE
>50	17 (73,9%)	6 (100%)
CV sete anos pós-VP					0,095
Mediana (Min-Máx)	1.277 (25-94.250)	14004 (147-58.078)	0,68	0,43-1,07
Cat. Clínica VP					0,497
N ou A	15 (65,2%)	3 (50,0%)	1,88	0,31-11,52
B	8 (34,8%)	3 (50,0%)	1,00
Cat. clínica pós-sete anos					0,655
N ou A	10 (43,5%)	2 (33,3%)	1,54	0,23-10,15
B ou C	13 (56,5%)	4 (66,7%)	1,00
Cat. Imunol VP					0,509
1	7 (30,4%)	1 (16,7%)	2,19	0,21-22,34
2 ou 3	16 (69,6%)	5 (83,3%)	1,00
Cat. Imunol pós-sete anos					0,634
1	6 (26,1%)	1 (16,7%)	1,77	0,17-18,32
2 ou 3	17 (73,9%)	5 (83,3%)	1,00
Zoster					0,005
Ausente	22 (95,7%)	2 (33,3%)	44,00	3,18-608,16
Presente	1 (4,3%)	4 (66,7%)	1,00
Idade início TARV					0,193
Mediana (Min-Máx)	1,7 (0,1-5,6)	3,2 (1,7-4,3)	0,67	0,36-1,23
AC VHA pós-VP					0,008
Mediana (Min-Máx)	2.070 (269-10.260)	296 (103-1.175)	9,04	1,77-46,21
AC VHA pós-VP					0,003
<1.000	2 (8,7%)	5 (83,3%)	1,00
≥1.000	21 (91,3%)	1 (16,7%)	52,5	3,93-700,53

NE, não estimável; VP, vacinação primária de hepatite A; CV, carga viral; CD4, linfócitos TCD4+; AC, anticorpo; Cat, categoria; Imunol, imunológica; TARV, Terapia antirretroviral; VHA, vírus da hepatite A.

Os seis pacientes que perderam a soropositividade para o VHA foram revacinados com duas doses da vacina contra hepatite A (Havrix(r)) e cinco responderam com concentrações de anticorpos acima de 20 mUI/mL. A concentração de anticorpos contra o VHA está apresentada na figura 2 nos seguintes momentos: um mês após a 1a dose da revacinação, imediatamente antes da 2a dose de revacinação e um mês após a 2a dose de revacinação.

Figura 2.

Dinâmica dos níveis plasmáticos dos anticorpos contra hepatite A após a revacinação nos seis pacientes do grupo HIV sem níveis protetores de anticorpos sete anos após a imunização primária. Observação: a amostra da criança 6 imediatamente antes da 2ª dose de revacinação foi perdida.

A tabela 3 e as Figura 3 and Figura 4 mostram aspectos clínicos, virológicos e imunológicos dos pacientes que perderam a soropositividade para hepatite A nesse período de sete anos de acompanhamento.

Tabela 3.

Manifestações clínicas apresentadas pelas crianças que não mantiveram níveis de anticorpos protetores para hepatite A sete anos após a vacinação

Pacientes	Internações hospitalares	Pneumonia	Herpes zoster	Infecções de vias aéreas superiores	Otite média crônica	Neuro toxoplasmose	Outras
1	4	2	1	>10 episódios		2
2		2	1	1
3		2	1
4		1	0	1			Parotidite/gastrite
5		1	1	1			Diarreia
6					1		Fraturas

Figura 3.

Evolução da carga viral, em quatro momentos: 30 dias após vacinação primária (VP), sete anos após VP, imediatamente antes da 1a e da 2a doses da revacinação (revac) nos seis pacientes do grupo HIV que não responderam à revacinação.

Figura 4.

Evolução da contagem de células T CD4+ em quatro momentos: 30 dias após vacinação primária (VP), sete anos após VP, imediatamente antes da 1a e da 2a doses da revacinação (revac) nos seis pacientes do grupo HIV que não responderam à revacinação.

Discussão

A vacina contra o VHA é reconhecida como altamente imunogênica em indivíduos saudáveis.11 and 12 Além disso, os níveis séricos de anticorpos permanecem por longos períodos após a vacinação. Bian et al., em 2010, na China, ao avaliar 110 crianças saudáveis vacinadas contra o VHA, obtiveram média geométrica de 61,6 mIU/mL de anticorpos, com persistência de anticorpos em 99,1% de indivíduos, decorridos 10 anos do esquema de imunização.13

Neste estudo, observamos que 79% dos adolescentes e das crianças infectadas pelo HIV por transmissão vertical mantiveram a soropositividade contra o VHA, decorridos sete anos do esquema de imunização primária com duas doses da vacina. Esses resultados foram semelhantes, do ponto de vista estatístico, quando comparados com os do grupo de dez adolescentes expostos e não infectados pelo HIV, em que 100% mantiveram soropositividade para o VHA (qui-quadrado, p=0,174) ( tabela 1). Também não se observou diferença estatística entre a mediana dos níveis de anticorpos dos dois grupos sete anos após a vacinação primária ( fig. 1). A impossibilidade de avaliar todas as crianças imunizadas no estudo anterior 7 pode ter sido responsável pela ausência de significância estatística entre os dois grupos (erro tipo II ou erro ß). Entretanto, vale a pena ressaltar que, para o modelo final (aquele que apresentou apenas AC VHA pós-PV), o poder obtido, fixando-se a em 5%, foi de 98,6%. Isso indica que esse modelo teve alta probabilidade de detectar uma real diferença entre os grupos.

Outros grupos avaliaram a persistência de anticorpos contra o VHA por períodos menores do que o analisado no presente estudo e incluíram pacientes com imunossupressão grave. Rigaud et al.,14 em 2008, obtiveram 72% de soroconversão após quatro semanas da vacinação, com queda para 66% na semana 52. Weinberg et al.,15 em 2009, mostraram soroconversão de 97% na semana oito após a vacinação, com queda para 90% 18 meses depois. O grupo de pacientes infectados pelo HIV aqui estudado mostrou queda de 100% para 79% no percentual de indivíduos com concentração de anticorpos ≥20 mIU/mL para o VHA em sete anos. Há evidências de queda dos níveis de anticorpos vacinais para outros antígenos na população de crianças infectadas pelo HIV,3 mesmo quando em terapia antirretroviral e revacinadas.16 A proporção de crianças infectadas pelo HIV imunes caiu de 88% para 85% no caso do sarampo, de 84% para 61% no caso da caxumba e de 100% para 79% no caso da rubéola, três anos após a revacinação.16 Choudhury e Matin,17 em 2013, avaliaram a persistência de anticorpos para toxoide tetânico em 24 crianças infectadas pelo HIV e observaram níveis acima de >0,1 UI/mL em 62% das crianças infectadas e 100% dos controles. Esses autores ainda demonstraram que 71% responderam à revacinação com níveis maiores do que 0,16 UI/mL. Salientaram que crianças infectadas pelo HIV necessitam de dose de reforço de toxoide tetânico antes do tempo preconizado, que é de cinco a 10 anos.

Vários fatores parecem estar implicados na resposta à vacinação e na manutenção da soropositividade de anticorpos em indivíduos infectados pelo HIV. O estado imunológico18 and 19 e a carga viral do HIV20 no momento da vacinação são reconhecidamente importantes. Da mesma forma, a evolução clínica, imunológica e virológica21 deve influenciar a manutenção dos níveis de anticorpos vacinais. A presença de coinfecção, como hepatite C, e o sexo masculino foram associados com menor resposta à vacina de hepatite A em pacientes adultos infectados pelo HIV.22 A manutenção de anticorpos específicos contra antígenos vacinais está relacionada à melhor maturação e preservação do compartimento de células B de memória, quando se inicia a terapia antirretroviral combinada precocemente em crianças.23 No estudo atual, as crianças que perderam os anticorpos para hepatite A iniciaram a terapia antirretroviral mais tardiamente, embora esse dado não tenha sido estatisticamente significativo (p=0,19).

A progressão da doença causada pelo HIV ocorre mesmo em pacientes que recebem terapia antirretroviral e fazem seguimento clínico rigoroso. Os seis pacientes que perderam a soropositividade para o VHA foram os que mais apresentaram comprometimento clínico e imunológico no período e apenas 50% deles recebiam terapia antirretroviral, embora todos tivessem indicação de tratamento. Salienta-se que, ao longo desses sete anos, os seguintes dados foram observados (fig. 3): a) A carga viral aumentou nos pacientes 1 e 2; b) Quatro pacientes (1,3,5 e 6) apresentaram progressão clínica da doença, o que agravou sua categoria clínica (CDC-1994); c) Quatro pacientes (1,2,5 e 6) apresentaram pioria da imunossupressão, o que agravou sua categoria imunológica (CDC-1994); d) Os pacientes (2,4 e 6), que apresentaram as mais altas concentração de anticorpos para o VHA após a revacinação, foram os que tinham maior contagem de células T CD4+ na época da imunização primária (fig. 4). O único paciente que não respondeu à revacinação (paciente 1 na fig. 4) foi o que apresentou mais intercorrências clínicas, com comprometimento nutricional importante, queda do zIMC e comprometimento imunológico no período após vacinação. Interessante observar que, no momento da 1ª dose de revacinação, esse adolescente apresentava carga viral indetectável, respondeu com concentração de anticorpos 19,7 mUI/mL para o VHA. À medida que apresentou evidências de replicação viral do HIV, os títulos de anticorpos para o VHA voltaram a cair (fig. 2), mesmo após receber uma 2a dose da revacinação e apresentar elevação da contagem de células T CD4+ (de 65 células/mm3 para 285 células/mm3 no período entre a 1a e a 2a doses da revacinação).

O pequeno número de sujeitos na amostra, particularmente no Grupo ENI, que caracteristicamente abandona o acompanhamento logo após definir sua situação de não infectados, e a grande variabilidade dos dados podem ter comprometido a análise estatística de nossos achados. Mesmo assim, foi possível demonstrar a importância do monitoramento temporal da concentração de anticorpos após vacina de hepatite A nos pacientes infectados pelo HIV. Embora todos os adolescentes expostos e não infectados pelo HIV tenham mantido soropositividade para o VHA, 21% dos adolescentes infectados pelo HIV perderam a soropositividade para hepatite A sete anos após a imunização primária, particularmente aqueles que apresentaram mais intercorrências clínicas e imunossupressão mais acentuada. É encorajador, entretanto, verificar que a revacinação determina resposta de produção de anticorpos em níveis superiores a 20 mUI/mL na maioria dos pacientes estudados. Vale ressaltar que não foram identificados, na literatura, outros estudos que tenham avaliado a relação entre títulos pós-vacinais de anticorpos e sua persistência em longo prazo, nem a possível relação entre eventos clínicos e manutenção desses anticorpos.

Para manter a proteção contra hepatite B há recomendações nacionais24 e internacionais25 de revacinar indivíduos imunossuprimidos que perderam seus anticorpos. Essa recomendação ainda não existe em relação à hepatite A, mas os dados aqui apresentados sugerem que, para crianças e adolescentes infectados pelo HIV, o acompanhamento da titulação dos anticorpos é necessário e a revacinação é desejável para manter níveis protetores de anticorpos. Sabe-se que pacientes infectados pelo HIV devem ser vacinados o mais precocemente possível, em um momento em que ainda não tenham comprometimento imunológico. Pode-se concluir, com base na análise multivariada aqui apresentada, que os níveis de anticorpos para hepatite A na primovacinação constituem o único fator independentemente associado à manutenção desses anticorpos decorridos sete anos. Essa associação também foi vista por Sharapov et al.26 Uma resposta menos intensa na primovacinação sugere um comprometimento imunológico já nesse momento. Apesar disso, 83,3% dos pacientes soronegativos para hepatite A responderam à revacinação, embora o tempo de duração desses anticorpos seja algo a ser estudado futuramente.