[Application of molecular assay for adenovirus detection among different pediatric patients].

OBJECTIVE: Adenoviruses play an important role in the etiology of severe acute lower respiratory infection, especially in young children. The aim of the present study was to evaluate the Human Adenovirus (HAdV) detection by different methods (Direct Fluorescence Assay - DFA and Nested Polymerase Chain Reaction - nested PCR), among samples collected from different groups of pediatric patients.
METHODS: Collection of samples was made in children with congenital heart disease (CHD - 123 nasal aspirates collected in the years of 2005, 2007 and 2008) and in community children (CC - 165 nasal aspirates collected in 2008). Children were eligible if they presented acute respiratory infection (ARI) of probable viral etiology, within up to 7 days of symptoms' onset. All studied samples were evaluated by DFA and nested PCR assay.
RESULTS: Of the 290 samples included during the study period, 43 (14.8%) were positive on at least one test: 17/165 (10.3%) of the CC and 26/125 (20.8%) of the CHD children. The nested PCR detection rates in the community children were 15/165 (9.1%), and for children with CHD, 24/125 (19.2%). Molecular method showed higher detection rates when compared to the DFA test (p<0.001). Univariate analysis showed that children with congenital heart disease presented a significantly higher chance for acquiring the HAdV (Odds Ratio 2.3; 95% CI: 1.18-4.43).
CONCLUSIONS: Based on data obtained in the present evaluation, we suggest that a routine surveillance should be performed in high risk patients by molecular methods, thus improving diagnostic flow and efficiency.

Introduction

Adenoviruses play an important role in the etiology of severe acute lower respiratory infection, especially in young children.1 Human adenoviruses (HAdV) spread rapidly in closed environments, which often cause epidemic disease in crowded communities. Furthermore, adenovirus infection is difficult to clinically distinguish from other viral or bacterial respiratory infections.2 This combination of factors indicates that improved clinical microbiological methods are necessary for detection of the acute respiratory disease caused by adenoviruses.

Prior to the advent of PCR, DFA and viral isolation were the most sensitive methods that were available for respiratory viruses detection.3 , 4 However, a significant number of specimens in patients with clinically compatible viral respiratory infection were incorrectly determined to be negative by DFA and viral culture, implying a failure to identify the causative virus in a significant percentage of cases.5 - 7 Molecular methods demonstrate greater sensitivity when compared to conventional assays for detecting adenovirus in respiratory samples.8 , 9

In the pediatric population HAdV is the second most common detected pathogen10 and the virus is responsible for 5%-15% of respiratory disease.10 , 11 Clinical samples from children often present higher viral loads when compared to adults patients.12 Brazilian studies described an incidence ranging from 3% to 7.1%, depending on the technique used.13 - 16 Other group at risk to acquired HAdV respiratory infection was the congenital heart disease children, but there are no published data.

In this context, the aim of the present study was to assess HAdV occurrence by two different methods (Direct Fluorescence Assay DFA and Nested Polymerase Chain Reaction nested PCR) in samples collected from different pediatric populations.

Method

This cross sectional study included two different populations assessed from 2005 to 2008:

Congenital heart disease children (CHD): during 2005, 2007, and 2008, 123 outpatients with CHD assisted in the Congenital Heart Disease Pediatric Service were included. During the year of 2006 the congenital heart disease ward underwent a structural and administrative reform, preventing sample collection. Among these patients, 49.7% were male, the mean and median age 3.9 and 2.9 years old, ranging from1 year and 6 month to 11 years old.

Community children (CC): in 2008, 165 outpatients seen in a primary care facility by a pediatrician were included. Among these patients, 47.2% were male, the mean and median age 3.9 and 3.0 years old, ranging from 7 months to 11 years old.

For both groups, children were eligible if they presented acute respiratory infection (ARI) of probably viral etiology and preferably up to 7 days of symptoms until sample collection. In the community children group, patients were included when parents or guardians sought medical care due to acute respiratory infection. Among CHD group, the inclusion of patients was defined by a physician during a previous routine visit. The CHD population was considered at risk for viral respiratory infection complications; therefore, samples of children with more than 7 days of symptoms were collected (ranged from 1 to 60 days). Respiratory symptoms assessed were: coryza, cough, sore throat, or nasal congestion; and systemic symptoms were: fever, headache, malaise, chills, or fatigue. Written consent was obtained from all participants' legal representative before enrollment.

All nasal samples were maintained at 4 ºC and transported immediately to the laboratory. An aliquot (1 mL) was separated for molecular analysis and stored at -70 ºC. The remaining specimen volume was evaluated on the same day by direct fluorescent assay (DFA), according to previous study.17 Afterwards, one aliquot from each stored sample had DNA extracted by QIamp DNA Blood extraction kit (Qiagen, USA), according to manufacturer's instructions, follow by nested-PCR for detection of all adenovirus serotypes, as previously described.18

All studied samples were evaluated by direct immunofluorescence technique (DFA). The tests were performed using the kit "Simulfluor Respiratory Screen and Panel" (Chemicon Int., EUA), in accordance with the manufacturer's instructions.

The primers used for detection target the region of HAdV Hexon gene. The outer primer pair, hex1deg (5′-GCC SCA RTG GKC WTA CAT GCA CAT C-3′) and hex2deg (5′-CAG CAC SCC ICG RAT GTC AAA-3'), resulted in a 301 bp product. The nested primer pair, nehex3deg (5′-GCC CGY GCM ACI GAI ACS TAC TTC-3′) and nehex4deg (5′-CCY ACR GCC AGI GTR WAI CGM RCY TTG TA-3′), produced an amplicon of 171 bp. For the first amplification reaction, 5 µL of extracted DNA were placed in a tube with a reaction mixture consisting of 2.5 µL of 103 buffer (200mM Tris-HCl, pH 8.4, 500mM KCl), 3.5 µM of MgCl2, 0.5 µM of primers Hex1deg and Hex2deg, 1µL of dNTPs mixture containing 20 mM of each nucleotide, 2,5U of Platinum(r) TaqDNA Polymerase (Invitrogen, Brazil) and autoclaved MilliQ water to a final volume of 25 µL. For the second amplification reaction, 2 µL of first reaction amplicon were placed in a tube with a reaction mixture consisting of 2.5 µL of 103 buffer (200 mM Tris-HCl, pH 8.4, 500 mM KCl), 3.5 µM of MgCl2, 0.5 µM of primers Nehex3deg and Nehex4deg, 1µL of dNTPs mixture containing 20 mM of each nucleotide, 2,5U of Platinum(r) TaqDNA Polymerase (Invitrogen, Brazil) and autoclaved MilliQ water to a final volume of 25 µL. Positive controls (Adenovirus Serotype 3) and redundant negative control (autoclaved MilliQ water) were included in each series. Positive results were considered when amplicon were visualized after 2% agarose gel electrophoresis. The sensibility of the reaction were standardized and showed a detection limit of 10- 4 TCID50/mL.

Association between different categorical variables (response variable: presence or absence of HAdV; independent variable: community children and congenital heart disease children) was tested using the chi-square test and univariate Odds Ratio (SPSS, version 11.5). p<0.05 was considered to be statistically significant. To compare used methods, the Kappa test was conducted (R software version 2.11.1) and the interpretation of the coefficients was performed using the classification of Altman.19

The present study was approved by the Institutional Review Board of São Paulo Hospital and the Federal University of São Paulo (1654/09).

Results

Samples from 290 symptomatic patients were analyzed (48.6% (141/290) females and 51.4% (149/290) males), being 56.9% (165/290) from the community and 43.1% (125/290) from CHD children. The time between onset of symptoms and sample collection ranged from 1 to 60 days.

Among the 290 samples included during the study period, 41 (14.1%) were positive for at least one test: 17/165 (10.3%) children from community, 26/125 (20.8%) CHD children. Table 1 show the differential detection between assays according to different studied populations. Overall, 4/290 (0.7% of samples were DFA positive and 39/290 (13.40%) were nested-PCR positive. Nested-PCR presented a higher detection, statistically significant, among all studied populations when compared to DFA (p<0.001). Comparing the children groups by molecular methods, CHD presented higher detection rate (p=0.02).

Table 1.

HAdV detection by DFA and nested-PCR among different studied populations.

	Nº	DFA		nested-PCR		p	Global positivity
		Positive	Negative	Positive	Negative
Community	165	2 (1.2%)	163 (98.8%)	15 (9.1%)	150 (90.9%)	<0.001	17 (10.3%)
CHD	125	2 (1.6%)	123 (98.4%)	24 (19.2%)	101 (80.8%)	<0.001	26 (20.8%)
Total	290	4 (1.4%)	286 (98.6%)	39 (13.4%)	251 (86.5%)		43 (14.8%)

CHD, children with congenital heart disease; DFA, direct fluorescence assay; PCR, Polymerase Chain Reaction.

Analysis of the length of time between symptoms onset and the sample collection day showed a statistical difference between DFA and nested-PCR (Table 2). Among community children, the mean ± standard deviation, median and range since symptoms onset were: 3.2±2.72; 3; 1-20 days; and among CHD children the mean ± standard deviation, median and range since symptoms onset were: 6.5±7.1; 5; 1-60 days. Nested-PCR compared to DFA detected a higher number of cases both for samples collected within 5 days of symptoms onset, and >5 days of symptoms onset.

Table 2.

Time of symptoms onset according to evaluated test.

	≤5 days		>5 days
	Positive	Negative	Positive	Negative
	%	%	%	%
DFA	3 (1.4)	211 (98.6)	1 (1.3)	75 (98.7)
Nested-PCR	24 (11.2)	190 (88.8)	15 (19.7)	61 (80.3)
p	<0.001		<0.001
Total	214		76

DFA, direct fluorescence assay; PCR, Polymerase Chain Reaction.

Table 3 shows the agreement between the evaluated tests. The general agreement was low, mainly among community children. The concordance regarding negative results was high for both studied populations.

Table 3.

Agreement assessment between the tests.

	Collected samples	DFA positive	Nested-PCR postive	Concordancea	Positivity concordance	Negativity concordanceb
Children
Community	165	2 (1.2%)	15 (9.1%)	64.9%	0	98.7%
CHD	125	2 (1.6%)	24 (19.2%)	79.2%	0	98.0%
Total	290	4 (1.4%)	39 (13.5%)

CHD, children with congenital heart disease; PCR, Polymerase Chain Reaction. a Concordance calculated by method to compare two tests when gold standard method was not known. b Higher values of negativity concordance show that the methods presented similar performance to detected negative cases.

Table 4 shows the result of the univariate Odds Ratio analysis of HAdV occurrence among different studied populations. The response variable was the presence or absence of HAdV, and the independent variable was the studied group: community children and CHD children. CHD children presented approximately two times more chance to acquired HAdV infection when compared to community children.

Table 4.

Univariate Odds Ratio analysis of HAdV occurrence among studied populations.

Populations	General positivity	x2 (p)	OR (95% CI)
Community	17 (10.3%)	0.01	1.0
CHD	26 (20.8%)		2.3 (1.18-4.43)

CHD, children with congenital heart disease; OR, Odds Ratio; 95% CI, 95% Confidence Interval.

Discussion

Among community children, the adenovirus detection rate was similar to that described in the national literature, with rates ranging from 6% to 7.1%.13 - 16 A recent Brazilian study evaluating 1,121 samples collected from hospitalized infants found adenovirus occurrence in 15.8%, which corroborates the findings of the present study.10 International studies report HAdV occurrence ranging from 2%-3.8% among pediatric populations, which is slightly lower when compared to our results.20 - 22 Studies with CHD children demonstrate respiratory viruses circulation, with relative high occurrence rates, showing that these agents must be considered in clinical and diagnostic practice.22 The present study is the first to describe HAdV respiratory infection in Brazilian children with congenital heart disease. The HAdV detection rate in CHD children was higher (20.8%) when compared to community children (10.3%). It is noteworthy that, among CHD children sample collection was accomplished during routine consultation. If the patient presented respiratory infection during the scheduled appointment, the sample was collected. Therefore the rate found could be underestimated, because probable cases may have been lost due to lack of active demand from patients. One hypothesis for the higher detection can be related to comorbidities presence among this children.23

When evaluating the two tests used in this study some important questions for both clinicians and hospital administrators are raised: Which is the best test? Up to which day is ideal to collect the sample? Is there a need to repeat the test? Which is the ideal number of samples for laboratory routine flow? What is the impact of negative and positive tests for high-risk patients? Some of these aspects could be evaluated in the present study.

The analysis of the association between patient´s symptom onset and laboratorial test results showed that the molecular method was always more sensible than the DFA, and this difference was more evident after the fifth day of symptoms (p<0.001). Lower detection by DFA was related to low viral load in respiratory samples.24 The higher detection rates among patients with more than five days of symptom were expected due to higher nested-PCR sensibility.25 , 26 The success of DFA test depend on some key factors as good sample collection and experienced laboratory staff,10 while nested-PCR, based on nucleic acid amplification, can detect a very low number of viral particles.10 , 26

Univariate analysis showed that CHD children have a higher risk of acquiring HAdV (Odds Ratio: 2.29), when compared to community children. Utokaparch (2011)27 described that pediatric patients with lower respiratory infection presented higher viral load when compared to patients with upper respiratory infection. Echavarria et al.28 described that children are 2 to 3.5 times more likely to become infected by HAdV than adults. These data corroborates the results of the present study.

One of the study limitations was the lack of another respiratory viruses analysis. Among HAdV negative samples, others virus could be present. As a result of the high sensitivity of the molecular methods, viral infections could be detected weeks after the symptoms resolution29 , 30 but, in the present study, the included samples were collected from children presenting acute respiratory infection, decreasing the chance of a past infection detection. Another study limitation was the lack of sample collection during 2006; however the main idea of the study was to understand the occurrence of the virus in the community (community children), and in a population with at high risk of complications after a viral respiratory infection (CHD children). Some studies described an occurrence of adenovirus during different years, and throughout the year,31 , 32 with similar occurrence patterns; therefore the collection of samples during different years apparently did not compromise the purpose of the study.

Three parameters can indicate the validity of the diagnostic test choice, the cost per sample, the turnaround time (time to provide the result) and the test reliability. In a study published in 2009 Mahony et al.33 compared the cost of DFA versus molecular technique for diagnosing respiratory virus infection, and they described that molecular test was slightly more expensive but, at the same time, was highly cost-effective due to reduction in hospitalization time. Different studies described the turnaround time of DFA and PCR, with both tests presenting the ability to provide results in one day.34 , 35 Gharabaghi et al.34 compared the sensitivity and specificity of DFA and commercial molecular assay. This study showed lower sensitivity of DFA test in comparison to molecular testing for all surveyed virus, with adenovirus presenting the lowest sensitivity (38.1%)34

We suggest that routine surveillance should be performed in high-risk patients by molecular methods, improving diagnostic flow and efficiency. Our results also demonstrated that in samples with more than five days of symptom onset nested-PCR might be the best option.

Introdução

Os adenovírus desempenham um papel importante na etiologia da infecção aguda grave do trato respiratório inferior, especialmente em crianças menores.1 Os adenovírus humanos (HAdV) disseminam-se rapidamente em ambientes fechados, o que muitas vezes resulta em doença epidêmica em comunidades populosas. Além disso, a infecção por adenovírus é clinicamente difícil de distinguir de outras infecções respiratórias virais ou bacterianas.2 Essa combinação de fatores indica que métodos microbiológicos clínicos mais eficazes são necessários para a detecção da doença respiratória aguda causada por adenovírus.

Antes do advento da reação em cadeia de polimerase (PCR), a imunofluorescência direta (DFA) e o isolamento viral eram os métodos mais sensíveis disponíveis para a detecção dos vírus respiratórios.3 and 4 Entretanto, um número significativo de amostras de pacientes com infecção respiratória viral clinicamente compatível era incorretamente classificado como negativo pela DFA e pela cultura viral, o que implica falha na identificação do vírus causador em uma percentagem significativa de casos.5 , 6 and 7 Os métodos moleculares demonstram maior sensibilidade quando comparados com ensaios convencionais para detecção de adenovírus em amostras respiratórias.8 and 9

Na população pediátrica, o HAdV é o segundo patógeno mais frequentemente detectado10 e o vírus é responsável por 5% a 15% das doenças respiratórias.10 and 11 Amostras clínicas de crianças geralmente apresentam cargas virais maiores quando comparadas com as dos pacientes adultos.12 Os estudos brasileiros descrevem uma frequência que varia de 3% a 7,1%, de acordo com a técnica usada.13 , 14 , 15 and 16 Outro grupo de risco para infecção respiratória adquirida por HAdV são as crianças com cardiopatias congênitas, embora não haja publicação que comprove esse fato.

Nesse contexto, o objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrência de HAdV por meio de diferentes métodos (imunofluorescência direta DFA e reação em cadeia da polimerase nested nested PCR) em amostras coletadas de crianças de diferentes populações.

Método

Este estudo transversal incluiu duas populações distintas avaliadas de 2005 a 2008.

1) Crianças com doença cardíaca congênita (DCC): durante 2005, 2007 e 2008, 123 pacientes ambulatoriais com doença cardíaca congênita atendidos no Serviço Pediátrico de Doenças Cardíacas Congênitas foram incluídos. Durante 2006, a ala de cardiopatia congênita passou por uma reforma estrutural e administrativa, o que impossibilitou a coleta das amostras. Dos pacientes incluídos, 49,7% eram do sexo masculino, com idade média de 3,9 anos (mediana de 2,9 anos), variação de um ano e seis meses a 11 anos.

2) Crianças da comunidade (CC): em 2008, foram incluídos 165 pacientes ambulatoriais atendidos por um pediatra em uma unidade básica de saúde. Entre esses pacientes, 47,2% eram do sexo masculino e a idade média era de 3,9 anos (mediana de três), variação de sete meses a 11 anos.

Para ambos os grupos, as crianças eram elegíveis se apresentassem infecção respiratória aguda (IRA) de provável etiologia viral, de preferência com intervalo de até sete dias do início dos sintomas até a coleta das amostras. No grupo de crianças da comunidade, os pacientes foram incluídos quando os pais ou responsáveis procuraram atendimento médico em consequência de uma infecção respiratória aguda. No grupo DCC, a inclusão de pacientes foi definida por um médico durante uma consulta de rotina previamente agendada. A população DCC foi considerada em risco para complicações de infecção respiratória viral; portanto, foram coletadas amostras de crianças com mais de sete dias do início dos sintomas (variação de um-60 dias). Os sintomas respiratórios avaliados foram: coriza, tosse, dor de garganta ou congestão nasal; os sintomas sistêmicos foram: febre, dor de cabeça, mal-estar, calafrios ou fadiga. Foi obtido termo de consentimento livre e esclarecido de todos os adultos responsáveis por cada paciente antes da inclusão.

Todas as amostras nasais foram mantidas a 4 °C e imediatamente transportadas para o laboratório. Uma alíquota (1 mL) foi separada para análise molecular e armazenada a -70 °C. O volume da amostra restante foi avaliado no mesmo dia por DFA, de acordo com estudo anterior.17 Em seguida, uma alíquota de cada amostra armazenada teve o DNA extraído com o kit de extração QIamp DNA Blood extraction kit (Qiagen, EUA), de acordo com as instruções do fabricante, seguido por nested PCR para a detecção de todos os serótipos do adenovírus, como anteriormente descrito. 18

Todas as amostras estudadas foram avaliadas pela técnica de DFA. Os testes foram feitos com o kit Simulfluor Respiratory Screen and Panel (Chemicon Int., EUA), de acordo com as instruções do fabricante.

Os primers usados para a detecção tiveram como alvo a região do gene Hexon do HAdV. O par de primers exteriores, hex1deg (5'-GCC SCA RTG GKC WTA CAT GCA CAT C-3') e hex2deg (5'-CAG CAC SCC ICG RAT GTC AAA-3') resultaram em um produto de 301 bp. O segundo par de primers (nested primers), nehex3deg (5'-GCC CGY GCM ACI GAI ACS TAC TTC-3') e nehex4deg (5'-CCY ACR GCC AGI GTR WAI CGM RCY TTG TA-3'), produziu um amplicon de 171 bp.

Para a primeira reação de amplificação, 5 µL de DNA extraído foram colocados em um tubo com uma mistura de reação com 2,5µL de 10× buffer (200 mM Tris-HCl, pH 8,4, 500 mM de KCl), 3,5µM de MgCl2, 0,5 µM de primers Hex1deg e Hex2deg, 1µL de mistura de dNTPs com 20 mM de cada nucleotídeo, 2,5U de Platinum(r) TaqDNA polimerase (Invitrogen, Brasil) e água MilliQ autoclavada, em um volume final de 25µL.

Para a segunda reação de amplificação, 2µL do amplicon da primeira reação foram colocados em um tubo com uma mistura de reação constituída por 2,5µL de 10× buffer (200 mM Tris-HCl, pH 8,4, 500 mM KCl), 3,5 µM de MgCl2, 0,5 µM de primers Nehex3deg e Nehex4deg, 1µL de mistura de dNTPs, com 20 mM de cada nucleotídeo, 2,5U de Platinum(r) TaqDNA polimerase (Invitrogen, Brasil) e água MilliQ autoclavada, em um volume final de 25µL. Controles positivos (Adenovírus Sorotipo 3) e controle redundante negativo (água MilliQ autoclavada) e foram incluídos em cada série. Foram considerados resultados positivos quando o amplicon foi visualizado após eletroforese em gel de agarose a 2%. A sensibilidade da reação foi padronizada e apresentou um limite de detecção de 10-4TCID50/mL.

A associação entre diferentes variáveis categóricas (variável resposta: presença ou ausência de HAdV; variável independente: crianças da comunidade e crianças com doença cardíaca congênita) foi avaliada pelo teste do qui-quadrado e a razão de probabilidade univariada (SPSS, versão 11.5). Valor de p<0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Para comparar os métodos usados, o teste Kappa foi feito (R software versão 2.11.1) e a interpretação dos coeficientes foi feita com o uso da classificação de Altman. 19

O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital São Paulo e da Universidade Federal de São Paulo (1654/09).

Resultados

As amostras de 290 pacientes sintomáticos foram analisadas [48,6% (141/290) do sexo feminino e 51,4% (149/290) do sexo masculino], 56,9% (165/290) de crianças da comunidade e 43,1% (125/290) de crianças com DCC. O tempo de início dos sintomas até o momento da coleta variou de um a 60 dias.

Entre as 290 amostras de pacientes sintomáticos incluídas durante o período do estudo, 41 (14,1%) foram positivas em pelo menos um teste: 17/165 (10,3%) crianças da comunidade, 26/125 (20,8%) crianças com DCC. A tabela 1 mostra a detecção diferencial entre os ensaios de acordo com as diferentes populações estudadas. No geral, 4/290 (0,7%) das amostras foram DFA positivas e 39/290 (13,40%) das amostras foram nested PCR positivas. O método da nested PCR apresentou uma maior taxa de detecção, estatisticamente significativa, entre todas as populações estudadas quando comparada com o DFA (p<0,001). Comparando-se os grupos de crianças por métodos moleculares, as do grupo DCC apresentaram maior taxa de detecção (p=0,02).

Tabela 1.

Detecção de HAdV por DFA e nested PCR entre as diferentes populações estudadas

	N°	DFA		Nested PCR		p	Positividade global
		Positivo	Negativo	Positivo	Negativo
Comunidade	165	2 (1,2%)	163 (98,8%)	15 (9,1%)	150 (90,9%)	<0,001	17 (10,3%)
DCC	125	2 (1,6%)	123 (98,4%)	24 (19,2%)	101 (80,8%)	<0,001	26 (20,8%)
Total	290	4 (1,4%)	286 (98,6%)	39 (13,4%)	251 (86,5%)		43 (14,8%)

DCC, crianças com doença cardíaca congênita; DFA, imunofluorescência direta; PCR, reação em cadeia de polimerase.

A análise do tempo decorrido desde o início dos sintomas até o dia da coleta mostrou uma diferença estatística entre os métodos DFA e nested PCR ( tabela 2). Entre as crianças da comunidade, a média±desvio padrão, a mediana e o intervalo desde o início dos sintomas foram respectivamente 3,2±2,72; 3; 1-20 dias; e entre as crianças do grupo DCC 6,5±7,1; 5; 1-60 dias. O método nested PCR, em comparação com a DFA, detectou maior número de casos, tanto para amostras coletadas com ≤5 dias desde o início dos sintomas como para amostras com >5 dias desde o início dos sintomas.

Tabela 2.

Tempo do início dos sintomas de acordo com o teste usado

	≤5 dias		>5 dias
	Positivo %	Negativo %	Positivo %	Negativo %
DFA	3 (1,4%)	211 (98,6%)	1 (1,3%)	75 (98,7%)
Nested PCR	24 (11,2%)	190 (88,8%)	15 (19,7%)	61 (80,3%)
p	<0,001	<0,001
Total	214	76

DFA, imunofluorescência direta; PCR, reação em cadeia de polimerase.

A tabela 3 mostra a concordância entre os testes avaliados. A concordância geral foi baixa, principalmente entre as crianças da comunidade. A concordância relativa aos resultados negativos foi elevada para ambas as populações estudadas.

Tabela 3.

Avaliação de concordância entre os testes usados

	Amostras coletadas	DFA positiva	Nested PCR positiva	Concordânciaa	Concordância de positividade	Concordância de negatividadeb
Crianças
Comunidade	165	2 (1,2%)	15 (9,1%)	64,9%	0%	98,7%
DCC	125	2 (1,6%)	24 (19,2%)	79,2%	0%	98,0%
Total	290	4 (1,4%)	39 (13,5%)

DCC, crianças com doença cardíaca congênita; DFA, imunofluorescência direta; PCR, reação em cadeia de polimerase. aConcordância calculada por um método para comparar dois testes quando o método padrão de ouro não era conhecido. bOs valores mais elevados de concordância de negatividade mostram que os métodos apresentaram desempenho similar aos casos negativos detectados.

A tabela 4 mostra o resultado da análise da razão de probabilidade univariada de ocorrência do HAdV entre as diferentes populações estudadas. A variável resposta foi a presença ou ausência de HAdV e a variável independente foi o grupo estudado: as crianças da comunidade e as crianças com DCC. As crianças com DCC apresentaram aproximadamente duas vezes mais chance de infecção adquirida por HAdV quando comparadas com as crianças da comunidade.

Tabela 4.

Análise univariada da razão de chances (odds ratio OR) da ocorrência de HAdV entre as populações estudadas

Populações	Positividade geral	χ2 (p)	OR (95% CI)
Comunidade	17 (10,3%)	0,01	1
DCC	26 (20,8%)		2,3 (1,18-4,43)

DCC, crianças com doença cardíaca congênita; OR, odds ratio; IC95%, Intervalo de Confiança de 95%.

Discussão

Entre as crianças da comunidade, a taxa de detecção de adenovírus foi semelhante à descrita na literatura nacional, variação de 6% a 7,1%.13 , 14 , 15 and 16 Um estudo brasileiro recente avaliou 1.121 amostras coletadas de crianças hospitalizadas e encontrou ocorrência de adenovírus em 15,8%, o que corrobora os resultados do presente estudo.10 Estudos internacionais relatam a ocorrência do HAdV variando de 2% a 3,8% em populações pediátricas, o que é ligeiramente menor quando comparado com os nossos resultados.20 , 21 and 22 Estudos com crianças com cardiopatia congênita demonstram a circulação dos vírus respiratórios, com taxas relativamente altas de ocorrência, e mostram que esses agentes devem ser considerados na prática clínica e diagnóstica.22 O presente estudo é o primeiro a descrever a infecção respiratória por HAdV em crianças brasileiras com DCC. A taxa de detecção de HAdV nos cardiopatas foi maior (20,8%) quando comparada com a de crianças da comunidade (10,3%). Vale ressaltar que, entre as crianças com cardiopatia congênita, a coleta de amostras foi feita durante a consulta de rotina. Se o paciente apresentava infecção respiratória durante a consulta agendada, a amostra era colhida. Portanto, a taxa encontrada pode estar subestimada, porque prováveis casos podem ter sido perdidos por conta da falta de demanda dos pacientes. Uma hipótese para a maior detecção pode estar relacionada com a presença de comorbidades entre essas crianças.23

Ao avaliar os dois testes usados neste estudo, algumas questões importantes para clínicos e administradores hospitalares são levantadas: Qual é o melhor teste? Até qual dia é o período ideal para coletar a amostra? Há necessidade de repetir o teste? Qual é o número ideal de amostras para o fluxo de rotina do laboratório? Qual é o impacto de testes negativos e positivos em pacientes de alto risco? Alguns desses aspectos puderam ser avaliados no presente estudo.

A análise da associação entre o início dos sintomas no paciente e os resultados dos testes laboratoriais mostrou que o método molecular foi mais sensível do que o DFA e essa diferença foi mais evidente após o quinto dia do início dos sintomas (p<0,001). A menor detecção por DFA estava relacionada com a baixa carga viral nas amostras respiratórias. 24 As taxas de detecção mais elevadas entre os pacientes com mais de cinco dias do início dos sintomas eram esperadas por conta da maior sensibilidade do teste nested PCR. 25 and 26 Para o sucesso do teste DFA são necessários alguns fatores-chave, como a boa coleta de amostras e pessoal de laboratório experiente, 10 enquanto o nested PCR, baseado na amplificação de ácidos nucleicos, pode detectar um número muito baixo de partículas virais. 26 and 10

A análise univariada mostrou que crianças com cardiopatia congênita têm maior risco de adquirir o HAdV (OR: 2,29) quando comparadas com as crianças da comunidade. Utokaparch (2011)27 descreveu que pacientes pediátricos com infecção respiratória do trato inferior apresentavam carga viral mais elevada quando comparados com pacientes com infecção do trato respiratório superior. Echavarria et al.28 descreveram que crianças têm 2 a 3,5 vezes mais chances de ser infectadas por HAdV do que os adultos. Esses dados corroboram os resultados do presente estudo.

Uma das limitações do estudo foi a ausência de pesquisa de outros vírus respiratórios. Entre as amostras negativas para HAdV, outros vírus poderiam estar presentes. Como resultado da alta sensibilidade dos métodos moleculares, as infecções virais poderiam ser detectadas semanas após o término dos sintomas,29 and 30 mas, no presente estudo, as amostras incluídas foram coletadas de crianças com infecção respiratória aguda, o que diminui a chance de detecção de uma infecção anterior. Outra limitação do estudo foi a falta de coleta de amostras durante 2006; no entanto, a ideia principal do estudo foi pesquisar a ocorrência do vírus na comunidade (crianças da comunidade) e em uma população com um risco elevado de complicações após uma infecção respiratória viral (crianças com DCC). Alguns estudos descrevem uma ocorrência de adenovírus durante diferentes anos e ao longo do ano,31 and 32 com padrões de ocorrência semelhantes; portanto, a coleta de amostras durante anos diversos aparentemente não comprometeu o objetivo do estudo.

Três parâmetros podem indicar a validade da escolha do teste diagnóstico: o custo por amostra, o tempo de resposta (tempo necessário para fornecer o resultado) e a confiabilidade do teste. Em um estudo publicado em 2009, Mahony et al.33 compararam o custo do DFA com o da técnica molecular para o diagnóstico de infecção pelo vírus respiratório e descreveram que o teste molecular tinha um custo ligeiramente maior, mas, ao mesmo tempo, apresentava um custo-benefício excelente por conta da redução do tempo de hospitalização. Diferentes estudos descreveram o tempo de resposta do DFA e do PCR. Ambos os testes apresentaram a capacidade de fornecer resultados em um dia.34 and 35 Gharabaghi et al.34 compararam a sensibilidade e especificidade do DFA e do ensaio molecular comercial. Esse estudo mostrou uma baixa sensibilidade do teste DFA em comparação com o teste molecular para todos os vírus pesquisados. O adenovírus apresentou a menor sensibilidade (38,1%).34

Sugerimos que a vigilância de rotina seja feita em pacientes de alto risco por métodos moleculares, o que melhora o fluxo de diagnóstico e a eficiência. Nossos resultados também demonstraram que, em amostras com mais de cinco dias do início dos sintomas, o método nested PCR pode ser a melhor opção.