[Homologous human milk supplement for very low birth weight preterm infant feeding].

OBJECTIVE: To develop a homologous additive of human milk for feeding the very low weight infants with an original and simplified methodology, to know the nutritional composition of fortified human milk with this additive and to evaluate its suitability for feeding these infants.
METHODS: For the production and analysis of human milk with the homologous additive, 25 human milk samples of 45 mL have undergone a lactose removal process, lyophilization and they were diluted in 50 mL of human milk. Doses of lactose, proteins, lipids, energy, sodium, potassium, calcium, phosphorus and osmolality were measured.
RESULTS: The composition of the additive milk was lactose 9.22 ± 1.00 g/dL; proteins 2.20 ± 0.36 g/dL; lipids 2.91 ± 0.57 g/dL; calories 71.93 ± 8.69 kcal/dL; osmolality 389.6 ± 32.4 mOsmol/kg H2O; sodium 2.04 ± 0.45 mEq/dL; potassium 1.42 ± 0.15 mEq/dL; calcium 43.44 ± 2.98 mg/dL; and phosphorus 23.69 ± 1.24 mg/dL.
CONCLUSIONS: According to the nutritional contents analyzed, except for calcium and phosphorus, the human milk with the proposed additive can achieve the nutritional needs of the very low birth weight preterm infant.

Introduction

Although it does not fully meet the nutritional needs of very low birth weight (VLBW) infants, human milk is recommended considering the digestive, metabolic and immunological immaturity of these children.1 , 2 The American Academy of Pediatrics, as well as the Brazilian Ministry of Health3 , 4 recognize that human milk is beneficial and has many advantages for preterm infant feeding. However, due to its physiological characteristics, human milk supplementation is recommended for these newborns.5 - 8

Considering its greater availability, cow's milk protein is the most commonly used human milk supplement. The concern with the short-term prognosis and the knowledge that nutrition in childhood is related to diseases of adulthood justify the study of supplement use that offers more adequate quality amino acids and fatty acids, such as those derived from human milk itself.9 - 14

These studies show that it is possible to offer higher concentrations of human milk nutrients to VLBW infants with good gastrointestinal and metabolic tolerance. Among such studies, we highlight those using viable methodologies to be applied in human milk banks, such as evaporation and freeze drying of skim or non-skim human milk after removal of part of the lactose.9 - 14 In these studies, human milk was concentrated in a rotary evaporator, a procedure that requires the milk to be on average 30 minutes at a temperature higher than room temperature, which in addition to requiring extensive manipulation of the milk, allows greater protein denaturation due to time and temperature range.

By analyzing the techniques used in these studies, it was intended to develop a homologous human milk supplement for VLBW infant feeding with an original, simplified methodology, which minimized the steps of handling and temperature change such as heating, freezing and thawing during its production. We also sought to assess the nutritional composition of human milk fortified with this supplement and evaluate its suitability for the feeding of these newborns.

Method

After approval by the Human Research Ethics Committee at Universidade Federal de Mato Grosso do Sul (UFMS) (n. 1975 CAAE 0035.0.049.000-11), the homologous supplement of human milk was prepared.

The human milk used in the production and dilution of the supplement and the one used for comparison with the supplemented milk was expressed manually at home or in the human milk bank at the University Hospital of UFMS, being donated by volunteer mothers whose children were born at full-term, with a lactation period between 0 and 12 months. Milk samples that were submitted to the selection criteria of the human milk bank and that showed an index ≤2 in the acidity titration analysis (Dornic acidity) were used for supplement production.15 Milk samples used in the study were not selected according to lactation period, beginning or end of feeding, or time of day when the sample was collected. Although all these characteristics influence the composition of human milk, it is known that human milk banks usually have no surplus milk supply, and therefore this study did not aim to work with selected milk samples.

The human milk samples underwent two phases of preparation: removal of lactose and lyophilization, as described below. First, 25 samples of human milk with 45mL were placed in conical plastic tubes, refrigerated at -22 °C for 24 hours. After this period, the samples were submitted to centrifugation at 3,500 rpm for 60 minutes in a NT 815 (NOVATECNICA(r), SP, Brazil) centrifuge at a temperature of 0-2 °C to allow the formation of lactose precipitate. The initial volume of 45mL was defined as it is the standard volume of the conical plastic tubes used in centrifuges. The samples were then heated in a water bath at 40 °C for the minimum time required for thawing to facilitate the standardized removal of 40mL of supernatant. The supernatant was then transferred to a glass container, using a graded pipette. The lactose deposit was discarded. The remaining contents of the lactose removal process were frozen again at -22 °C for 24 hours and placed in the vacuum chamber of the benchtop lyophilizer L101 (LIOBRAS(r), SP, Brazil) for 72 hours. The lyophilization process results in milk dehydration by sublimation. The weight of each lyophilized sample varied according to the initial fat content, as the volume of fat does not change in lyophilization. Each lyophilized sample was diluted in 50mL of human milk. By diluting the supplement in 50mL of human milk, the goal was to have approximately a two-fold higher content of nutrients in the supplemented milk, as the supplement originated from 45mL.

These samples were analyzed for the contents of lactose, protein, lipids, osmolality, sodium, potassium, calcium and phosphorous. The macronutrient measurement was performed in Nexgen equipment (Bentley(r), MN, USA), osmolality was evaluated in a VAPRO osmometer (WESCOR(r), UT, USA), sodium and potassium measurement was performed in a B262 flame photometer (Micronal(r), SP, Brazil), and calcium and phosphorus were measured in a spectrophotometer, with sample ash solution, according to the methodology described by Instituto Adolfo Lutz.16 For the comparison with the 25 supplemented milk samples, macronutrients were measured in 20 samples of human milk without supplement. The mineral contents were compared with those reported by Palhares et al in 1987.17 The energy value of the samples was calculated in calories by multiplying each gram of carbohydrate and protein by 4, and each gram of fat by 9.

During the supplement production, there was a concern regarding the maintenance of physicochemical quality and the lowest degree of microbiological contamination of the milk, as it may change the physicochemical aspects of milk. For that purpose, the following measures were taken: the containers that stored the milk during the two phases of preparation, as well as the volumetric pipette, were autoclaved; milk fractionation for supplement preparation and dilution was carried out after disinfecting hands, using gloves, masks, aprons and caps; the rim of the flasks were sterilized using the Bunsen burner after being opened and before being closed; the water bath used in sample thawing was previously cleaned and the water replaced for each preparation; the lyophilizer vacuum capsule was cleaned before and after use; the lyophilized supplement was stored with the cap on, under freezing conditions, in the same container in which it was lyophilized, until it was diluted. In this study, the VLBW infants were not fed with the supplemented milk, and therefore the supplemented milk did not undergo microbiological analysis. However, the supplement was designed to be added to raw human milk, which should be pasteurized after being supplemented and submitted to routine microbiological analysis of the human milk bank before being offered to newborns.

In experimental studies, compared groups should have a sample size that is sufficient to identify the difference between them, i.e., the sample size is related to the expected variation between the assessed groups, in addition to the confidence interval.18 Thus, the sample size in this study was defined by taking into account research in the area and the expected difference between the analyzed groups. To compare the nutritional content of supplemented human milk with human milk without supplement, the nonparametric Wilcoxon test was used in the GraphPad Software 2013, (GraphPad Software, Inc(c), CA, USA). The significance level was set at 5%.

Results

The mean, standard deviation, minimum and maximum values of lactose, proteins, lipids, energy, osmolality, sodium, potassium, calcium and phosphorus of human milk with homologous supplement are shown in Table 1. Table 2 shows the mean concentrations of the nutritional content in human milk with homologous supplement compared to human milk without supplement.

Table 1

Values of lactose, proteins, lipids, energy, osmolality, sodium, potassium, calcium and phosphorus in the homologous supplemented human milk.

Nutrient	Mean	SD	Minimum	Maximum
Lactose (g/dL)	9.22	1.00	7.80	11.02
Protein (g/dL)	2.20	0.36	1.60	2.90
Lipids (g/dL)	2.91	0.57	1.81	4.01
Energy (kcal/dL)	71.93	8.69	54.88	89.45
Osmolality (mOsm/KgH2O)	389.6	32.4	335.00	438.00
Sodium (mEq/dL)	2.04	0.45	1.30	2.60
Potassium (mEq/dL)	1.42	0.15	1.22	1.66
Calcium (mEq/dL)	43.44	2.98	38.07	48.21
Phosphorus (mEq/dL)	23.69	1.24	21.72	25.51
SD, standard deviation.

SD, standard deviation.

Table 2

Mean nutritional content of homologous supplemented human milk (HM+HS) and human milk from a milk bank (HM).

Nutrient	HM+HS	HM	Increase in folds	p
Lactose (g/dL)	9.22	6.78	1.36	<0.001
Protein (g/dL)	2.20	1.13	1.95	<0.001
Lipids (g/dL)	2.91	1.49	1.95	<0.001
Energy (g/dL)	71.93	45.06	1.60	<0.001
Osmolality (mOsm/KgH2O)	389.6	267.70	1.45	<0.001
Sodium (mEq/dL)	2.04	0.9317	2.19	<0.001
Potassium (mEq/dL)	1.42	1.1817	1.20	<0.011
Calcium (mEq/dL)	43.44	24.7117	1.76	<0.001
Phosphorus (mEq/dL)	23.69	10.7517	2.20	<0.001

Discussion

Human milk supplementation emerged with the aim of adapting it to the nutritional needs of the very low (VLBW) and extremely low birth weight (ELBW) preterm infants. The use of commercial fortifiers and lactoengeneering techniques of human milk, among them the adequate structuring of human milk banks, the breakdown of fat globules of human milk by ultrasound and the concentration of human milk through evaporation of milk stored in these banks, renewed the enthusiasm for the use of human milk to feed these children.19

The technique described in this study was designed to minimize the manipulation steps, changes in temperature and the physical state of milk to attain better nutrient conservation. The handling of milk is only performed in the steps of storing it in conical plastic tubes and removal of the supernatant. As for the temperature changes, before the supplement production process, it is frozen and thawed only once during the process (at the supernatant removal after lactose precipitation), when it is again frozen, freeze-dried at a temperature of -40 °C and maintained under freezing to be reconstituted in human milk. That is different from the techniques described in similar studies.11 - 14

Nutrient concentration in human milk and the use of supplements lead to increased osmolality. Therefore, part of the lactose was removed in the precipitation process. The content of lactose, which is a disaccharide, increases the solution's osmolality.20,21 On the other hand, lactose enhances calcium absorption and promotes fermentation, which reduces intestinal constipation.22 , 23 The mean content of lactose in supplemented human milk was 9.2g/dL, in accordance with the recommendation of 3 to 12g/dL. With the onset of minimal enteral feeding, the activity of lactase increases rapidly. Despite the increase in lactose content, osmolality was found to be 389.6mOsm/KgH2O. The osmolality of food for premature infants should be less than 450mOsm/kgH2O.24 Santos,12 in 1997, fed VLBW infants human milk with added homologous supplement whose lactose content was similar and reported good gastrointestinal tolerance. Thus, the lactose content found in this study seems to be adequate for feeding VLBW infants.

The amounts of proteins found in human milk with supplement meet the AAP recommendation,25 in 1985, of 2.9-3.3g/100kcal, and of the Canadian Society of Pediatrics,26 which recommended 2.7-3.5g/kg/day in 1995. With a supply of supplemented milk of 150-200mL/kg a day, the intake of 3.3-4.4g/kg of protein a day is attained, coincident with the interval of 3.5-4.0g/kg/day recommended by the European Society for Pediatric Gastroenterology, Hepatology, and Nutrition (ESPGHAN) in 2010.27

The sodium content found in supplemented milk also meets the recommendations of the AAP for infant formulas, which are 2.5-3.5mEq/kg/day, when 120kcal/kg/day are offered,25 and of ESPGHAN26 (2.7-4.6mEq/100kcal). If the child's gastric capacity allows it, the intake of a volume of milk that supplies 4mEq/kg/day of sodium is recommended for the prevention of hyponatremia.25 As for potassium, supplemented human milk in this study had 1.42mEq/dL of potassium. The estimated requirement of potassium can be supplied by breastfeeding, which contains 1.25-1.60mEq/dL.28

The presence of calcium in human milk differs from that in infant formulas, not only in quantity, but also regarding the constituent chemical species due to differences in the protein fraction of human and cow's milk. In formulas, calcium is mainly associated with casein. In human milk, a high proportion of calcium constitutes part of the lipid fraction. In the aqueous fraction, most of the calcium is associated with whey proteins and low-molecular weight compounds. In human milk there is little calcium bound to casein. These differences in the chemical structure of the constituent species of the calcium content of milk explain the high bioavailability of calcium in human milk.28 Despite the significant increase in the levels of calcium and phosphorus in supplemented human milk compared to human milk without supplement, these levels do not meet the recommendations for very low birth weight infants, which, according to ESPGHAN, are 20-140mg/kg/day of calcium and 60-90mg/kg/day of phosphorus,27 and according to AAP, are 200 to 250mg/kg/day of calcium and 110 to 125mg/kg/day of phosphorus.25 Still, this significant increase of approximately twice than that of human milk without supplements is advantageous due to the increased bioavailability of calcium and phosphorus in human milk when compared to commercial supplements. Additionally, the acquisition of calcium and phosphorus supplements alone is cheaper than purchasing multinutrient supplements.

As the incorporation of fat in the fetus occurs in the last trimester, the VLBW infants are vulnerable to the lack of lipids. The fat in VLBW infants' diet must meet the needs of fatty acids and prevent lack of calories.29 The amount of fat in the human milk with homologous supplement in g/100kcal was 4g, close to the recommendations of the AAP, 4.5-6.0g/100kcal25 and of ESPGHAN,27 4.4-6.0g/100kcal. The contents of fat in human milk homologous supplement and of the human milk without supplement shown in the results are lower than the mean fat content in human milk described in the literature. This occurred because the milks used were not selected according to their caloric value, due to the difficulty of having surplus milk in the milk bank for research. Nevertheless, the supplement made with these "lean" milks was able to significantly improve the nutritional content of human milk from the bank for VLBW infants.

The milk produced by the mother of a preterm newborn has a different composition from mature milk, regarding protein and energy content and immunological constituents in the first weeks of production. These modifications make breast milk adapted to the needs of the premature infant. In the first four weeks, preterm human milk contains a higher concentration of nitrogen, protein with immune function, total lipids, medium-chain fatty acids, vitamins, calcium, sodium and energy than milk produced by mothers of full-term newborns. The greater the degree of prematurity, the higher the lipid and protein content.1 , 30 With the exception of calcium and phosphorus, the nutrient levels evaluated in supplemented milk meet the recommendations for nutrition of VLBW infants and their composition is similar to preterm human milk, thus suitable for feeding these children. The result obtained in this study is similar to that of human milk with added supplements produced by Thomaz et al,14 and has a higher protein content than those produced by Santos12 and Valentini.13

The main limitations regarding the study methodology are its reproducibility, as the values of nutritional composition vary according to the human milk used; using different pools of human milk in the supplement production, dilution and comparison of their nutritional compositions, and the comparison of the mineral content with data from another study. Such limitations are justified below.

When reproducing the methodology used in this study, the results of the nutritional composition of human milk with or without supplement can vary according to the nutritional composition of the human milk used, which undergoes variations during the day, from one breast to another, from the beginning to the end of the feeding, and during the period of lactation. However, the main objective of this study is to show that the technique for supplement production is capable of making the milk from the milk bank more suitable for feeding VLBW infants without establishing selection and exclusion criteria for the milk, in addition to those that guarantee sanitary safety. This is due to the fact that, in human milk banks, there is usually no surplus breast milk, and thus a technique that establishes selection criteria for the available milk used in the production of the supplement would not be feasible. Because of this variation in availability of milk from the milk bank, in this study the milk used in the production of the supplement, in the dilution and comparison of their nutritional compositions did not originate from the same pool, but represented mean values of different samples.

A comparison of the mineral content of human milk with homologous supplement with human milk without supplement was carried out with data published in another study, because the nutritional composition of human milk with no supplements is well described in the publications.

Regarding the feasibility of the supplement production, the only initial cost to equip the milk bank and produce the homologous supplement is approximately U$19,000.00 (nineteen thousand American Dollars) to acquire the refrigerated centrifuge and the benchtop freeze-dryer. Considering that the market price of the commercial supplement box with 70 vials is R$115.00, and one vial is enough to supplement 20mL of human milk, the cost to feed a child weighing 1.000g with a daily volume of 150mL/kg for 30 days will be approximately R$370.00. To feed 10 children a day with this volume for 1 year, the cost will be R$44,400.00. Therefore, a neonatal unit that treats 10 children per month, using the proposed volume, will have spent in one year roughly the same amount needed to equip the human milk bank to produce the same homologous supplement.

The homologous supplement has advantages over commercial ones, as it provides protein of high biological value and nutrients of human milk. The technique can be implemented in human milk banks and has financial viability in developing countries, as it requires only an initial investment for the purchase of equipment and it reduces costs with commercial supplements.

Introdução

Apesar de não atender plenamente àss necessidades nutricionais do recém-nascido de muito baixo peso (RNMBP), o leite humano é recomendado em vista da imaturidade digestiva, metabólica e imunológica que essas crianças apresentam.1 and 2 A Academia Americana de Pediatria, bem como o Ministério da Saúde brasileiro,3 and 4 reconhece que o leite humano é benéfico e apresenta inúmeras vantagens na alimentação de pré-termos. No entanto, por suas características fisiológicas, recomenda-se a suplementação do leite humano para esses recém-nascidos.5 , 6 , 7 and 8

Considerando sua maior disponibilidade, a proteína do leite de vaca é a mais frequentemente usada nos aditivos de leite humano. A preocupação com o prognóstico em curto prazo e o conhecimento de que a nutrição na infância se relaciona com doenças da vida adulta fizeram com que o uso de aditivos que ofereçam qualidade de aminoácidos e ácidos graxos mais adequados, como os derivados do próprio leite humano, esteja sendo estudado.9 , 10 , 11 , 12 , 13 and 14

Esses trabalhos mostram que há possibilidades de oferecer concentrações maiores de nutrientes do leite humano ao RNMBP com boa tolerância gastrointestinal e metabólica. Dentre tais estudos, destacam-se aqueles que usaram metodologias viáveis para serem aplicadas em bancos de leite humano, como evaporação e liofilização do leite humano desnatado ou não, após retirada de parte da lactose.9 , 10 , 11 , 12 , 13 and 14 Nesses trabalhos o leite humano foi concentrado em um rotaevaporador, procedimento que exige que o leite fique em média 30 minutos a uma temperatura maior do que a ambiente, o que, além de exigir grande manipulação do leite, possibilita maior desnaturação de proteínas pelo tempo e pela faixa de temperatura.

Na análise das técnicas usadas nestes estudos, pretendeu-se: elaborar um aditivo homólogo do leite humano para a alimentação do RNMBP com metodologia original, simplificada e que minimizasse etapas de manipulação e mudanças de temperatura como aquecimento, congelamento e descongelamento durante sua produção. Além disso, procurou-se conhecer a composição nutricional do leite humano fortificado com esse aditivo e avaliar sua adequação para a alimentação desses recém-nascidos.

Método

Após a aprovação do Comitê de Ética em Pesquisas com seres humanos da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul (UFMS) (n° 1.975 CAAE 0035.0.049.000-11), foi preparado o aditivo homólogo de leite humano.

O leite humano usado na produção e diluição do aditivo e aquele empregado na comparação com o leite aditivado foi ordenhado por meio de expressão manual em domicílio ou no banco de leite humano do Hospital Universitário da UFMS e doado por mães voluntárias, cujos filhos nasceram a termo, com período de lactação de até 12 meses. Para a produção do aditivo foram usados leites que passaram pelo critério de seleção do banco de leite humano15 e que obtiveram, na análise de titulação de acidez (acidez Dornic), índice ≤2. As amostras de leite usadas não foram selecionadas segundo tempo de lactação, início ou fim da mamada ou hora do dia em que a amostra foi coletada. Apesar de essas características influenciarem a composição do leite humano, sabe-se que os bancos de leite humano usualmente não têm estoque excedente de leite e, por isso, este trabalho não teve o objetivo de trabalhar com leites selecionados.

As amostras de leite humano passaram por duas fases de preparo: retirada de lactose e liofilização, descritas a seguir. Em primeiro lugar, foram acondicionadas 25 amostras de 45 mL de leite humano em tubos plásticos cônicos refrigerados a -22 °C por 24 horas. Após esse período, as amostras foram submetidas à centrifugação a 3.500 rpm durante 60 minutos em centrífuga NT 815 (Novatecnica(r), SP, Brasil) na temperatura de 0-2 °C para formação de precipitado de lactose. O volume inicial de 45 mL foi definido porque é o volume padrão dos tubos plásticos cônicos usados na centrifuga. As amostras foram então aquecidas em banho-maria a 40 °C por tempo mínimo necessário ao descongelamento para facilitar a retirada padronizada de 40 mL do sobrenadante. O sobrenadante foi transferido para um recipiente de vidro, com o uso de uma pipeta graduada. O depósito de lactose formado foi desprezado. O conteúdo restante do processo de retirada da lactose foi congelado novamente a -22 °C por 24 horas e colocado na câmara de vácuo do liofilizador de bancada L101 (Liobras(r), SP, Brasil) por 72 horas. O processo de liofilização promove a desidratação do leite por sublimação. O peso de cada amostra liofilizada varia de acordo com o teor inicial de gordura, uma vez que o volume dessa não se altera na liofilização. Cada amostra liofilizada foi diluída em 50 mL de leite humano. Ao diluir o aditivo em 50 mL de leite humano, o objetivo foi ter aproximadamente o dobro de nutrientes no leite aditivado, já que o aditivo originou-se de 45 mL.

Essas amostras foram analisadas quanto ao teor de lactose, proteínas, lipídios, osmolalidade, sódio, potássio, cálcio e fósforo. A dosagem de macronutrientes foi feita no aparelho Nexgen (Bentley(r), MN, EUA), a osmolalidade foi avaliada no aparelho osmômetro Vapro (Wescor(r), UT, EUA), a dosagem de sódio e potássio foi feita no fotômetro de chama B262 (Micronal(r), SP, Brasil) e a dosagem de cálcio e fósforo, no espectrofotômetro com a solução de cinzas das amostras, conforme metodologia descrita do Instituto Adolfo Lutz.16 Para a comparação com as 25 amostras de leite aditivado, foram dosados os macronutrientes de 20 amostras de leite humano sem aditivo. Os teores de minerais foram comparados com os teores descritos por Palhares et al., em 1987.17 O valor energético das amostras foi calculado em calorias com a multiplicação de cada grama de carboidrato e de proteína por quatro e cada grama de gordura por nove.

Durante a produção do aditivo, houve a preocupação de manter a qualidade físico-química e o menor grau de contaminação microbiológica, uma vez que essa pode alterar os aspectos físico-químicos do leite. Para isso, foram tomados os seguintes cuidados: os recipientes que armazenavam o leite durante as duas fases de preparo, bem como a pipeta volumétrica, eram autoclavados; o fracionamento do leite para preparo e diluição do suplemento foi feito após desinfecção das mãos, com o uso de luvas, máscara, avental e gorro; as bordas dos frascos passavam pela chama do bico de Bunsen após serem abertos e antes de serem fechados; o banho-maria usado no descongelamento das amostras foi higienizado previamente e a água trocada a cada preparo; a cápsula de vácuo do liofilizador foi higienizada antes e após ser usada; o aditivo liofilizado ficou armazenado tampado, sob congelamento, no mesmo recipiente em que foi liofilizado até ser diluído. Neste trabalho, os RNMBP não foram alimentados com o leite aditivado e, por isso, o leite aditivado não passou por análise microbiológica. Porém, o aditivo foi elaborado para ser adicionado ao leite humano cru que deve ser pasteurizado após ser aditivado e passar pelas análises microbiológicas de rotina do banco de leite humano antes de ser oferecido aos recém-nascidos.

Em trabalhos experimentais os grupos comparados devem ter um tamanho amostral que seja suficiente para identificar a diferença entre eles, ou seja, o tamanho amostral se relaciona com a variação esperada entre os grupos avaliados, além do intervalo de confiança.18 Assim, o tamanho amostral neste trabalho foi definido com base em pesquisas da área e na diferença esperada entre os grupos analisados. Para comparar os teores nutricionais do leite humano aditivado com o leite humano sem aditivos foi usado o teste não paramétrico de Wilcoxon no GraphPad Software 2013 (GraphPad Software, Inc(c), CA, EUA). O nível de significância estabelecido foi de 5%.

Resultados

A média, o desvio padrão, o valor mínimo e o máximo de lactose, proteínas, lipídios, energia, osmolalidade, sódio, potássio, cálcio e fósforo do leite humano com aditivo homólogo estão referidos na tabela 1. Na tabela 2 estão apresentadas as médias dos teores nutricionais no leite humano com aditivo homólogo em comparação com o leite humano sem aditivo.

Tabela 1

Teores de lactose, proteínas, lipídios, energia, osmolalidade, sódio, potássio, cálcio e fósforo do leite humano com aditivo homólogo

Nutriente	Média	Desvio padrão	Mínimo	Máximo
Lactose (g/dL)	9,22	1,00	7,80	11,02
Proteína (g/dL)	2,20	0,36	1,60	2,90
Lipídios (g/dL)	2,91	0,57	1,81	4,01
Energia (kcal/dL)	71,93	8,69	54,88	89,45
Osmolalidade (mOsm/KgH2O)	389,60	32,40	335,00	438,00
Sódio (mEq/dL)	2,04	0,45	1,30	2,60
Potássio (mEq/dL)	1,42	0,15	1,22	1,66
Cálcio (mEq/dL)	43,44	2,98	38,07	48,21
Fósforo (mEq/dL)	23,69	1,24	21,72	25,51

Tabela 2

Teores nutricionais médios de leite humano com aditivo homólogo (LH + AH) e de leite humano de banco de leite (LH)

Nutriente	LH + AH	LH	Aumento n° de vezes	p
Lactose (g/dL)	9,22	6,78	1,36	<0,001
Proteína (g/dL)	2,20	1,13	1,95	<0,001
Lipídios (g/dL)	2,91	1,49	1,95	<0,001
Energia (g/dL)	71,93	45,06	1,6	<0,001
Osmolalidade (mOsm/KgH2O)	389,6	267,70	1,45	<0,001
Sódio (mEq/dL)	2,04	0,9317	2,19	<0,001
Potássio (mEq/dL)	1,42	1,1817	1,2	<0,011
Cálcio (mEq/dL)	43,44	24,7117	1,76	<0,001
Fósforo (mEq/dL)	23,69	10,7517	2,2	<0,001

Discussão

A suplementação do leite humano com aditivos surgiu com o objetivo de adequá-lo às necessidades nutricionais do recém-nascido pré-termo (RNPT) de muito e extremo baixo peso. O uso de fortificantes comerciais e técnicas de lactoengenharia do leite humano, entre elas a estruturação adequada dos bancos de leite humano, a quebra de glóbulos de gordura do leite humano por ultrassom e a concentração do leite humano por meio da evaporação dos leites estocados nesses bancos renovaram o entusiasmo com o uso do leite humano para essas crianças.19

A técnica descrita neste estudo foi planejada para minimizar as etapas de manipulação, mudanças de temperatura e do estado físico do leite para melhor conservação dos nutrientes. A manipulação do leite é feita somente nas etapas de acondicionamento nos tubos plásticos cônicos e retirada do sobrenadante. Quanto às mudanças de temperatura, antes do processo de produção do aditivo, ele é congelado e descongelado somente uma vez durante o processo (na retirada do sobrenadante, após precipitação da lactose), quando é novamente congelado, liofilizado à temperatura de -40 °C e mantido sob congelamento até ser reconstituído em leite humano. Diferente das técnicas descritas em trabalhos semelhantes.11 , 12 , 13 and 14

A concentração de nutrientes no leite humano e o uso de aditivos levam ao aumento da osmolalidade. Por isso, parte da lactose foi retirada no processo de precipitação. O teor de lactose, por ser um dissacarídeo, aumenta a osmolalidade da solução.20 and 21 Por outro lado, a lactose aumenta a absorção de cálcio e favorece a fermentação, que diminui a obstipação intestinal.22 and 23 O teor médio de lactose no leite humano aditivado foi de 9,2 g/dl, de acordo com a recomendação, que é de 3 a 12 g/dL. Com o início da alimentação enteral mínima, a atividade da lactase aumenta rapidamente. Apesar do aumento no teor de lactose, a osmolalidade encontrada foi de 389,6mOsm/KgH2O. A osmolalidade do alimento destinado ao prematuro deve ser inferior a 450mOsm/kgH2O.24 Santos,12 em 1997, alimentou RNMBP com leite humano adicionado de aditivo homólogo com teor de lactose semelhante a esse e relatou boa tolerância gastrointestinal. Assim, o teor do encontrado neste trabalho parece ser adequado para alimentar RNMBP.

Os valores de proteínas encontrados no leite humano aditivado atendem à recomendação da AAP,25 em 1985, de 2,9-3,3 g/100 kcal, e da Sociedade Canadense de Pediatria,26 que recomendou 2,7-3,5 g/kg/dia em 1995. Com uma oferta de leite aditivado de 150-200 mL/kg ao dia, atinge-se ingestão de 3,3-4,4 g/kg de proteína ao dia, coincidente com o intervalo de 3,5-4,0 g/kg/dia recomendado pelo Comitê da Sociedade Europeia de Gastroenterologia Hepatologia e Nutrição Pediatrica (ESPGHAN) em 2010.27

O teor de sódio encontrado no leite aditivado também atende à recomendação da AAP para fórmulas infantis, que é de 2,5-3,5mEq/kg/dia, quando oferecidas 120 kcal/kg/dia,25 e da ESPGHAN27 (2,7-4,6mEq/100 kcal). Se a capacidade gástrica da criança permitir, a ingestão de um volume de leite que oferte 4mEq/kg/dia de sódio é recomendada para prevenção de hiponatremia.25 Já quanto ao potássio, o leite humano aditivado neste estudo ofereceu 1,42mEq/dL de potássio. O requerimento de potássio estimado pode ser suprido com o aleitamento materno que contém 1,25-1,60mEq/dL.28

A presença de cálcio no leite humano difere das fórmulas infantis, não somente em quantidade, como também nas espécies químicas constituintes, devido às diferenças na fração proteica do leite humano e de vaca. Nas fórmulas, o cálcio está associado principalmente à caseína. No leite humano, uma proporção elevada de cálcio forma parte da fração lipídica. Na fração aquosa, a maior parte do cálcio está associada às proteínas do soro e a compostos de baixo peso molecular. No leite humano há pouco cálcio ligado à caseína. Essas diferenças na estrutura química das espécies constituintes do conteúdo de cálcio dos leites explicam a elevada biodisponibilidade de cálcio do leite humano.28 Apesar do aumento significativo nos teores de cálcio e fósforo do leite humano aditivado em relação leite humano sem aditivos, esses teores não atendem às recomendações para recém-nascidos de muito baixo peso que, segundo a ESPGHAN, são de 20-140 mg/kg/dia de cálcio e 60-90 mg/kg/dia de fósforo27 e, segundo a AAP, são de 200 a 250 mg/kg/dia de cálcio e de 110 a 125 mg/kg/dia de fósforo.25 Ainda assim, esse aumento significativo, aproximadamente o dobro do leite humano sem aditivos, é vantajoso pela maior biodisponibilidade do cálcio e do fósforo do leite humano, comparado aos suplementos comerciais. Além disso, a aquisição de suplementos de cálcio e fósforo isolados é mais barata do que a aquisição de suplementos com multinutrientes.

Devido à incorporação de gordura no feto ocorrer no último trimestre gestacional, o RNMBP é vulnerável à falta de lipídios. A gordura da dieta do RNMBP deve atender às necessidades de ácidos graxos e prevenir a falta de calorias.29 A quantidade de gordura do leite humano com aditivo homólogo em g/100Kcal foi de 4 g, próximo das recomendações da AAP, 4,5-6 g/100kcal,25 e da ESPGHAN,27 4,4-6 g/100 kcal. Os teores de gordura do leite humano com aditivo homólogo e do leite humano sem aditivos apresentados nos resultados são mais baixos do que a média de gordura do leite humano descrita na literatura. Isso ocorreu porque os leites usados não foram selecionados segundo seus valores calóricos, devido à dificuldade de ter leite excedente no banco de leite humano para a pesquisa. Apesar disso, o aditivo feito com esses leites "magros" foi capaz de melhorar significativamente o conteúdo nutricional do leite humano de banco para os RNMBP.

O leite produzido pela mãe do recém-nascido pré-termo apresenta composição diferenciada do leite maduro no aporte proteico energético e de constituintes imunológicos nas primeiras semanas de produção. Essas modificações tornam o leite materno adaptado às necessidades do prematuro. Nas primeiras quatro semanas, o leite humano pré-termo contém maior concentração de nitrogênio, proteína com função imunológica, lipídios totais, ácidos graxos de cadeia média, vitaminas, cálcio, sódio e energia do que os de mães de recém-nascidos a termo. Quanto maior o grau de prematuridade, maior é o teor proteico e de lipídios.1 and 30 Com exceção do cálcio e do fósforo, os teores nutricionais avaliados no leite aditivado atendem às recomendações para a nutrição de RNMBP e sua composição é semelhante à do leite humano pré-termo, indicado para alimentação dessas crianças. O resultado obtido no presente estudo é similar ao do leite humano aditivado com os aditivos produzidos por Thomaz et al.14 e tem maior teor de proteínas do que os produzidos por Santos12 e Valentini.13

As principais limitações na metodologia deste estudo são a sua reprodubilidade, pois os valores de composição nutricional variam de acordo com o leite humano usado; o uso de diferentes pools de leite humano na produção do aditivo, na diluição e na comparação de suas composições nutricionais; e a comparação do teor de minerais com dados de outro estudo. Tais limitações estão justificadas abaixo.

Ao reproduzir a metodologia exposta neste trabalho, os resultados obtidos da composição nutricional do leite humano com ou sem aditivo podem variar por causa da composição nutricional do leite humano usado, que sofre variações ao longo do dia, de uma mama para outra, do início para o fim da mamada e durante o tempo de lactação. Porém, o principal objetivo deste estudo é mostrar que a técnica para produção do aditivo é capaz de tornar o leite de banco de leite humano mais adequado à alimentação dos RNMBP sem impor critérios de seleção e exclusão de leite, além daqueles que garantem a segurança sanitária. Isso porque nos bancos de leite humano não há normalmente leite humano excedente. Assim, uma técnica que imponha critérios de seleção do leite disponível para a produção do aditivo não seria viável. Devido a essa variação de disponibilidade de leite no banco de leite humano, neste estudo o leite usado na produção do aditivo, na diluição e na comparação de suas composições nutricionais não se originou do mesmo pool, mas representou valores médios de diferentes amostras.

A comparação do teor de minerais do leite humano com aditivo homólogo com leite humano sem aditivos foi feita com os dados publicados em outro trabalho, porque a composição nutricional do leite humano sem aditivos é bem descrita nas publicações.

Quanto à viabilidade da produção do aditivo, o custo único e inicial para equipar o banco de leite humano e produzir o aditivo homólogo é de U$ 19 mil para aquisição da centrífuga refrigerada e do liofilizador de bancada. Considerando que o preço de mercado da caixa do aditivo comercial com 70 flaconetes é de R$ 115 e que um flaconete aditiva 20 mL de leite humano, o custo para alimentar uma criança de 1.000 g com um volume diário de 150 mL/kg por 30 dias será de R$ 370,00. Para alimentar 10 crianças por dia com esse volume durante um ano serão gastos R$ 44.400. Sendo assim, uma unidade de terapia neonatal que atende 10 crianças por mês, se usar o volume proposto, terá gastado em um ano o mesmo valor necessário para equipar o banco de leite humano para produzir o aditivo homólogo.

O aditivo homólogo tem vantagens sobre aditivos comerciais por oferecer proteínas de alto valor biológico e nutrientes do próprio leite humano. A técnica pode ser implantada nos bancos de leite humano e apresenta viabilidade financeira para países em desenvolvimento por requerer apenas investimento inicial para aquisição dos equipamentos e por diminuir os gastos com aditivos comerciais.