Microbiological findings of the maternal periodontitis associated to low birthweight.

OBJECTIVE: To determine the association between the presence of periodontal pathogens and low birthweight.
METHODS: This observational and case-control study consisted of mothers of infants weighing <2,500g (Group A), and mothers of newborns weighing ≥2,500g (Group B), born at Hospital da Mulher in Feira de Santana (BA), Brazil. A semi-structured questionnaire covering demographic data, gestational history and aspects related to general and oral health was employed postpartum. Following a complete periodontal examination, biofilm samples were collected at six sites in the mouth. The participants were further categorized in terms of presence or absence of periodontitis. Differences between the groups were determined using Pearson's χ 2 test, odds ratio, and confidence intervals were obtained using the Mantel-Haenszel test.
RESULTS: Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, Tannerella forsythia and Prevotella intermedia were detected by polymerase chain reaction. A total of 303 postpartum women were evaluated, 224 (73.9%) in Group B. Statistically significant differences between the groups were found for age, body mass index and history of previous low birthweight babies. Group A had a higher frequency of periodontitis (33.34%) than Group B (16.22%). P. gingivalis and P. intermedia were detected more frequently among women with periodontitis (74.19% and 88.70%, respectively).
CONCLUSION: In this population, there was no association between the presence of maternal periodontal pathogens and the occurrence of low birthweight infants.

INTRODUCTION

Although it is well established that increases in hormone levels during pregnancy may cause significant exacerbation of gingivitis, ( it was not until the 1990s, that evidence regarding associations between maternal periodontitis and undesirable pregnancy outcomes, such as preterm birth (PTB) and low birthweight (LBW), began to emerge. ( Modest but statistically significant associations ( were found in observational studies, even after controlling for factors that contribute to both periodontitis and adverse pregnancy outcomes. ( However, intervention studies failed to show that periodontal therapy reduced the overall rates of PTB and LBW. (

This lack of consensus may be attributed to variations in the populations evaluated, presence of potential confounding factors, and discrepancies in the way periodontitis is defined in different studies. ( Nonetheless, despite the different methods used, the prevalence of periodontal disease remains high among pregnant women. ( Furthermore, the complexities involved in performing intervention studies (inappropriate timing and/or type of intervention, inclusion of patients whose risk is not modifiable, and transient bacteremia caused by periodontal treatment) warrants a more thorough understanding of the effects of treatment and improvement in periodontal health on the pathophysiology of PTB and LBW. (

Several studies investigating the association between the presence of periodontopathogens and the risk of adverse pregnancy outcomes have been reported. ( However, these reports are contradictory and divergent in terms of sample size, the number of biofilm collection sites, the technique used to detect pathogens, and the prevalence of periodontal disease in the populations studied. Therefore, the meticulous study of maternal periodontal pathogens as markers of risk for PTB and LBW remains crucially important.

Previous studies carried out in Northeastern region of Brazil have demonstrated an association between periodontitis and LBW. ( We believe that studies assessing the relation between maternal periodontal pathogens and can broad current knowledge by providing a substantially larger sample size and allowing for the exploration of potential confounders.

OBJECTIVE

To determine the association between the presence of maternal periodontal pathogens and low birthweight.

METHODS

Study design

The present case-control study consisted of a Case Group, with mothers of newborns whose birthweight was <2,500g (Group A), and a Control Group, mothers of children from the same hospital whose birthweight was ≥2,500g (Group B). In addition, these women were further grouped in accordance with their periodontal condition: presence of periodontitis (P), indicating clinically diagnosed periodontitis, or absence of periodontitis (NP), without periodontitis.

Study sample

The participants were women who gave birth at the Hospital Inácia Pinto dos Santos , in the city of Feira de Santana, state of Bahia, Brazil, between June 2012 and June 2013.

The sample size calculation was based on the frequency of periodontitis among mothers in the Group A (57.8%) and those in the Group B (39%) in a previous study. ( The minimum sample size (316) with 79 cases and 237 controls was determined using Epi Info™ software, assuming 95% of confidence level and 80% power, with a ratio of three controls for each case.

The study was approved by the Universidade Estadual de Feira de Santana Institutional Review Board (no. 152/2008), CAAE: 0151.0.059.000-08. All women signed the Informed Consent Form.

All participants were asked to complete a semi-structured questionnaire containing identification and demographic data, as well as information pertaining to obstetric history, lifestyle habits and oral health aspects.

Postpartum women with cardiovascular disease, type 2 diabetes mellitus , kidney disease, parathyroid disease, urolithiasis, bacterial vaginosis, congenital malformation of the fetus, and other factors that could affect pregnancy outcome ( were not included. Mothers who required antibiotic prophylaxis for dental procedures or had undergone periodontal treatment during pregnancy were also excluded.

Diagnosis of periodontitis and newborn birthweight

Each woman’s periodontal condition was evaluated by a single, trained dentist. The degree of agreement between the obtained result and the expected result in the evaluation of the clinical attachment level was measured by the Kappa coefficient (0.832 indicated almost perfect agreement) for examiner selection. The periodontal examination was performed in the hospital until 3 days after the delivery. The following clinical parameters were evaluated in six sites per tooth: probing depth, gingival recession, clinical attachment level and bleeding on probing. The examiner was blinded to the status of the participants at the time of clinical periodontal examination. Periodontitis was defined as three or more teeth with one or more sites presenting a probing depth ≥4mm, clinical attachment level ≥3mm, as well as bleeding on probing at the same site. (

The hospital birth register was searched to obtain data on weight of each newborn. Each woman’s gestational outcome was evaluated in accordance with World Health Organization (WHO) criteria ( with respect to LBW (<2,500g).

Microbiological evaluation

The presence of five pathogens in the subgingival dental biofilm was evaluated: Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa), Porphyromonas gingivalis (Pg), Treponema denticola (Td), Tannerella forsythia (Tf) and Prevotella intermedia (Pi). Co-infection, i.e ., the presence of three or more pathogens in a single participant, was also determined.

Following drying and isolation the subgingival dental biofilm was collected from the six sites of greatest probing depth in each individual using a Gracey curette (Hu-Friedy, Chicago, IL, USA).

Samples were pooled and stored in a single DNAse-free and RNAse-free microcentrifuge tube (Eppendorf, San Diego, CA, USA ) with phosphate-buffered (PBS) saline sterile solution at -20°C until time of analysis.

Deoxyribonucleic acid (DNA) was extracted from each sample using a PureLink™ Genomic DNA Mini Kit (Invitrogen, Life Technologies, SP, BR) in accordance with manufacturer instructions. Polymerase chain reaction (PCR) was used to detect bacterial DNA using pairs of primers specific to the five periodontal pathogens: Aa, Pg, Td, Tf and Pi. ( The presence of bacterial DNA was confirmed using a universal pair of primers that bind to the 16S rDNA sequence. (

Each reaction was performed at a final volume of 25µL, containing 1x PCR buffer (Invitrogen, Life Technologies, SP,BR), 0.2mM of dNTP (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA), 0.02U/µL of Platinum Taq polymerase (Invitrogen, Life Technologies, SP, BR), 0.3µM of each primer, 10ng of DNA Template and 14.15µL of RNAse-free H 2 O. For denaturation, a thermocycler (Perkin Elmer, GeneAmp PCR System 2400, Norwalk, CT, USA) set at 94°C was used for 5 minutes. Next, reactions were annealed for 40 cycles at a suitable annealing temperature for each pair of primers. Finally, reactions were submitted to a temperature of 72°C for 4 minutes to complete DNA extension.

Amplification products were compared using a standard 100bp DNA ladder (Perkin Elmer, GeneAmp PCR System 2400, Norwalk, CT, USA). Electrophoresis was performed using 1.5% agarose gels in 1x TAE buffer (Perkin Elmer, GeneAmp PCR System 2400, Norwalk, CT, USA) stained with SYBR ® Safe DNA Gel Stain (Perkin Elmer, GeneAmp PCR System 2400, Norwalk, CT, USA). Gels were photographed under a blue-light transilluminator (Kodak Digital Science System 120, Eastman Kodak Company, NY, USA).

Statistical analysis

Simple frequencies and central trend measurements were calculated using the study sample’s sociodemographic, medical and lifestyle data. The groups were compared using the χ 2 distribution test with respect to categorical variables, with a significance level of 5% (p<0.05).

Odds ratio (OR) with a 95% confidence interval (CI) was used to evaluate the association between periodontitis and LBW, as well as any associations between the presence of any or a combination of the following periodontal pathogens Aa, Pg, Td, Tf, Pi, and LBW. The association between the co-infection condition and LBW was also evaluated. Stratified analysis and logistic regression analysis were conducted. The presence of effect-modifying covariables was investigated using the maximum likelihood ratio test (p<0.05). The presence of confounding covariables was evaluated utilizing backward strategy analysis. When any covariable varied more than 10% in the association measurement, it was confirmed as a confounder. Regardless of statistical confirmation, any covariable which is known to influence both periodontitis and LBW was also considered as a confounder. In sum, two types of models, crude and adjusted, were constructed to evaluate the associations studied.

The Hosmer-Lemeshow test was applied to verify goodness-of-fit. All data were analyzed using two software packages (Stata Data Analysis and Statistical Software, StataCorp LP, College Station, TX; SPSS – software, version 21.0, IBM, Armonk, NY ) .

RESULTS

The final sample consisted of 303 women who were evaluated and classified according to pregnancy outcome. Group A consisted of 79 (26.1%) mothers of newborns weighing <2,500g, while Group B had 224 (73.9%) mothers of newborns weighing ≥2,500g. The mean age of participants in Group A was 23±7.0 years (minimum 13 and maximum 57), and in the Group B, 24.6±6.1 years (minimum 13 and maximum 52) ( Table 1 ).

Table 1

Sociodemographic, life style and oral and general health condition of mothers of newborn with low birthweight

Characteristics	Group A	Group B	p value* †
Age 13-17 and >36 years	30 (37.98)	35 (15.63)	0.000
Maternal schooling level (0-4 years of study)/ 5	13 (16.46)	38 (17.36)	0.856
Family income (0-1 minimum monthly salaries)/ 3	53 (67.95)	154 (69.36)	0.815
Household density (≥4 number of people)	25 (31.64)	63 (28.13)	0.553
Marital status/ 3
Married/stable union	64 (82.05)	180 (81.08)	0.850
Single/widowed/divorced	14 (17.95)	42 (18.92)
Smoking habit during pregnancy/ 21	5 (6.58)	7 (3.40)	0.240
Pre-pregnancy BMI≤18.5/ 6	11 (14.29)	7 (3.18)	0.000
Hypertension/ 3	17 (21.52)	38 (17.20)	0.394
Type 1 diabetes/ 3	3 (3.80)	11 (4.98)	0.670
Periodontitis/ 3	26 (33.34)	36 (16.22)	0.001
No tooth brusing after meals/ 1	1 (1.27)	10 (4.49)	0.189
No dental floss usage/ 3	50 (64.11)	146 (65.76)	0.791
No dentist visit during the pregnancy/ 6	57 (73.08)	150 (68.49)	0.449
No prenatal educational activity during pregnancy/ 29	63 (82.90)	145 (73.23)	0.094

Results expressed as n (%).

/ x missing data.

* p value: significance level ≤0.05; † χ 2 test. BMI: body mass index.

Statistical comparisons made among the cases and controls found homogeneity for the majority of the sociodemographic, medical and lifestyle characteristics evaluated, except for age (p=0.000) and pre-gestational body mass index (BMI) (p=0.000).

With respect to oral health, women in Group A had a statistically significantly higher frequency of periodontitis (33.34%) compared with those in Group B (16.22%) (p=0.001).

No statistically significant differences were observed between the groups in terms of the presence of periodontal pathogens. The frequencies of the periodontal pathogens in case and Group B were, respectively, as follows: 64.55% and 61.60% for Aa; 63.29% and 61.16% for Pg; 88.60% and 86.16% for Td; 79.74% and 75% for Pi; and 98.73% and 100% for Tf. When co-infection, i.e ., the concomitant presence of three or more periodontal pathogen species, was evaluated, the frequencies found in the Group A and Group B were 86.08% and 81.70%, respectively, which were not statistically significantly different.

Table 2 shows the distribution of the periodontal pathogens and the presence of periodontitis. All participants were regrouped to reflect the presence or absence of periodontitis (P and NP Groups). As expected, a statistically significant difference was detected with respect to some of the periodontal pathogens, as well as for coinfection, when comparing these two groups. P. gingivalis (p=0.023), and P. intermedia (p=0.009) were detected more frequently in women with periodontitis in comparison to those without the disease. The presence of three or more pathogens was also a more common finding in postpartum women with periodontitis in comparison to unaffected individuals (91.93% versus 80.26%; p=0.030).

Table 2

Distribution of five periodontopathogens in the subgingival biofilm samples, between the no periodontitis and periodontitis puerperal groups

Periodontopathogens	Group NP	Group P	p value* †
Agregatibacter actinomycetemcomitans / 3	145 (60.92)	43 (69.35)	0.222
Treponema denticola / 3	139 (58.40)	46 (74.19)	0.023
Prevotella intermedia / 3	203 (85.29)	57 (91.93)	0.171
Porphyromonas gingivalis / 3	238 (100)	61 (98.38)	0.056
Tannerella forsythia / 3	173 (72.68)	55 (88.70)	0.009
Coinfection more than 2 species detected/ 3	191 (80.26)	57 (91.93)	0.030

Results expressed as n (%).

/ x missing data.

* p value: significance level ≤0.05; † χ 2 test.

Figure 1 depicts the crude and adjusted OR association measurements with respect to the association between periodontitis and LBW, as well as between periodontal pathogens and LBW.

Figure 1

Association measurements, odds ratios, crude, and adjusted for age, pre-gestational body mass index and family income and respective 95% confidence intervals for the association between periodontopathogens, periodontitis and low birthweight

* The concomitant presence of three or more periodontal pathogen species.

OR: odds ratio; Aa: Aggregatibacter actinomycetemcomitans; Pg: Porphyromonas gingivalis ; Td: Treponema denticola ; Tf: Tannerella forsythia; Pi: Prevotella intermedia .

Crude model analysis revealed a statistically significant association only between periodontitis and LBW: OR crude of 3.87, CI95%: 2.03-7.37. After adjusting for the covariables age, pre-gestational BMI and family income, a slight increase in the association measurement was observed (OR adjusted of 3.99; CI95%: 2.04-7.80), with statistical significance maintained, revealing that mothers with periodontitis were four times more likely to give birth to children with LBW as compared to mothers without periodontitis.

With respect to comparisons between the presence of the periodontal pathogens Aa (OR adjusted of 0.85; CI95%: 0.50-1.47), Pg (OR adjusted of 0.69; CI95%: 0.39-1.22), Td (OR adjusted of 0.61; CI95%: 0.27-1.42), Pi (OR adjusted =0. 60; CI95%: 0.31-1.17) and LBW, as well as co-infection (OR adjusted of 1.70; CI95%: 0.80-3.62)and LBW, no statistically significant associations were detected, even after adjusting for the same confounder covariables used in all adjusted analyses. Because the periodontal pathogen Tf was pervasive in the subgingival biofilm in both groups, it was impossible to obtain association measurements.

DISCUSSION

The principal finding of the present study was an association between maternal periodontitis and LBW. However, no associations were found with respect to the presence of periodontal bacteria in the subgingival biofilm and LBW. Although these findings are in agreement with those reported by other authors, ( some studies did detect an association between both clinical periodontitis, as well as the presence of periodontopathogens, and adverse gestational outcomes. (

Despite this evidence surrounding the association between maternal periodontitis, as an exposure factor, and adverse gestational outcomes, the magnitude of the observed association has been modest. While the majority of observational studies have confirmed this association, interventional studies found no benefits with respect to gestational outcomes in terms of periodontal therapy. ( In light of this controversy, the study of oral pathogens is crucial to the understanding of the nature of the challenge presented by periodontal disease.

The discrepancies between the present study and previous studies may be partially explained by variations in sample size, since most of these investigations had low numbers of participants. A total of 303 post-partum women were examined in the present study, which is more than most previous reports. ( The relatively elevated power of the present study in comparison to other reports in the literature, contributes to the body of microbiological investigations focused on unfavorable gestational outcomes.

Another factor that may explain the apparent discrepancies is the study population considered in the present study, which was recruited from the Northeastern region in Brazil, where periodontal conditions are extremely poor and the prevalence of periodontal disease is high. ( Nevertheless, another study performed in Southeastern Brazil ( reported similar results, i.e ., an association between periodontitis and prematurity/LBW. These authors also found that none of the 39 species of bacteria evaluated in the subgingival biofilm of postpartum woman were associated with either of these gestational outcomes.

In addition, many of these studies evaluated a limited number of biofilm samples, usually two to four per participant, which may underestimate actual rates of periodontal infection. ( By contrast, the present study collected six subgingival biofilm samples from each participant, which were obtained from the most compromised sites in each sextant.

Furthermore, it is interesting to note that these disparities may also be due to the clinical criteria utilized to define periodontitis, as well as study design, technique employed to evaluate the presence of periodontopathogens and the particular species of bacteria assessed.

A comparison of clinical and demographic characteristics of participants in the present study found homogeneity with respect to most aspects that represent risk factors for gestational complications. Nonetheless, some high-risk factors were observed at a higher frequency in mothers with LBW babies. Multivariate analysis was employed to adjust for age, pre-gestational BMI and family income in order to neutralize the effect of these confounding covariables in the group under study. However, no statistical significance was observed. This finding is in agreement with previous analyses, ( which found no significant differences, even after adjusting for confounders, in the levels of periodontopathogens among women with no adverse gestational outcomes, as well as in those who delivered preterm and/or those who gave birth to newborns with LBW.

Despite the lack of statistical significance in this study for the association between maternal schooling level and LBW, it cannot be disregarded that education level and body perception influence the degree of knowledge about health care. (

The present study found a high prevalence of periodontopathogens in both groups, which may be the result of what Dumitrescu et al., ( called the “carrier state”, in which low quantities of periodontopathogens may be present in individuals with no clinical diagnosis of periodontitis. This further complicates the assessment of their role in this disease.

Since several species of periodontal bacteria are commonly found together in periodontal pockets, isolating the specific type responsible for the pathogenesis of this disease can be a complex task. ( Due to the interaction and cooperation evidenced among diverse periodontopathogens, ( the occurrence of coinfection among the women studied was also evaluated.

Our results demonstrate that the presence of three or more pathogens in pregnant mothers is not associated with LBW babies. However, unlike the OR analyses considering each pathogen separately, the association measurement with respect to co-infection approaches the level of significance.

The recent use of metagenomic sequencing techniques allows for the screening of genetic composition and the functional potential of a microbial community by providing a comprehensive overview of these communities in association with periodontal health and chronic periodontitis. ( Furthermore, there may be several strains of each periodontopathogenic species with virulence factors of varying potential. The ability of each of these species to translocate, invade and colonize fetal tissues, as well as to evade host immune responses, determines its specific potential to contribute to adverse pregnancy outcomes. ( Further studies are therefore necessary to investigate the heterogeneity of periodontal microbial communities in individuals.

It is well-known that bacteria alone are not capable of provoking severe tissue destruction in all individuals, which suggests that individuals have a variable capacity to adapt to a certain bacterial load within their biofilm. (

The findings of the present study do not indicate that the presence of a specific periodontopathogen per se may be a plausible biological factor in the association between maternal periodontitis and the occurrence of babies with LBW. On the other hand, the present study not only reaffirms the association between maternal periodontitis and LBW baby, but it also broadens current knowledge by providing a substantially larger sample size, allowing for the exploration of potential confounders, increasing the number of biofilm collection sites and by considering a co-infection model in the analysis. Nonetheless, further studies are necessary to include a greater number of coinfection subgroups, employing larger samples.

CONCLUSION

In this population, there was no association between the presence of periodontal pathogens and the occurrence of low birthweight infants.

INTRODUÇÃO

Embora esteja bem estabelecido que o aumento dos níveis hormonais durante a gravidez possa causar exacerbação significativa da gengivite, ( foi somente a partir da década de 1990 que começaram a ser observadas associações entre a periodontite materna e os desfechos indesejáveis da gestação, como parto pré-termo (PTT) e baixo peso ao nascer (BPN). ( Foram encontradas associações moderadas, porém significativas, ( em estudos observacionais, mesmo após o controle de fatores que contribuem tanto para a periodontite quanto para os desfechos adversos da gravidez. ( Contudo, em estudos de intervenção, não foi possível mostrar que o tratamento periodontal resultasse em redução nas taxas gerais de PTT e BPN. (

Essa falta de consenso pode ser atribuída a variações nas populações avaliadas, presença de possíveis fatores de confusão, e discrepâncias na definição da periodontite nos diferentes estudos. ( No entanto, a despeito dos diferentes métodos utilizados, a prevalência da doença periodontal continua elevada nas gestantes. ( Além disso, as complexidades envolvidas na realização de estudos de intervenção (momento inadequado e/ou tipo de intervenção, inclusão de pacientes cujo risco não é modificável, e bacteremia transitória causada pelo tratamento periodontal) justificam a compreensão mais aprofundada dos efeitos do tratamento e da melhoria da saúde periodontal na fisiopatologia do PTT e do BPN. (

Foram relatados vários estudos que investigaram a associação entre a presença de periodontopatógenos e o risco de desfechos adversos da gestação. ( No entanto, esses relatos são contraditórios e divergentes, em termos de tamanho da amostra, número de locais de coleta de biofilme, técnica usada na detecção de patógenos e prevalência de doença periodontal nas populações estudadas. Assim, é de crucial importância um estudo minucioso dos patógenos periodontais maternos como marcadores de risco para PTT e BPN.

Estudos anteriores realizados no Nordeste do Brasil demonstraram associação entre periodontite e BPN. ( Acredita-se que estudos sobre a relação entre patógenos periodontais maternos e BPN possam ampliar o conhecimento atual, se realizados com uma amostra de tamanho significativamente maior e permitirem a exploração de potenciais fatores de confusão.

OBJETIVO

Determinar a associação entre a presença de patógenos periodontais maternos e o baixo peso ao nascer.

MÉTODOS

Desenho do estudo

O presente estudo caso-controle consistiu em um Grupo Caso, com mães de recém-nascidos com peso ao nascer <2.500g (Grupo A), e um Grupo Controle, com mães de crianças nascidas no mesmo hospital cujo peso ao nascer era ≥2.500g (Grupo B). Além disso, essas mulheres foram agrupadas de acordo com sua condição periodontal: presença de periodontite (P), indicando periodontite diagnosticada clinicamente, ou ausência de periodontite (NP), sem periodontite.

Amostra do estudo

As participantes eram mulheres que deram à luz no Hospital Inácia Pinto dos Santos, no município de Feira de Santana, estado da Bahia, entre junho de 2012 e junho de 2013.

O cálculo do tamanho da amostra foi baseado na frequência de periodontite entre as mães do Grupo A (57,8%) e entre as do Grupo B (39%), registrada em estudo anterior. ( O tamanho mínimo da amostra (316), com 79 casos e 237 controles, foi determinado pelo software Epi Info™, assumindo-se nível de confiança de 95% e poder de 80%, com relação de três controles para cada caso.

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade Estadual de Feira de Santana (n.º 152/2008), CAAE: 0151.0.059.000-08. Todas as mulheres assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.

Todas as participantes foram convidadas a preencher um questionário semiestruturado contendo dados de identificação e demográficos, além de informações referentes à história obstétrica, ao hábitos de vida e aos aspectos de saúde bucal.

Não foram incluídas puérperas com doença cardiovascular, diabetes mellitus tipo 2, doença renal, doença da paratireoide, urolitíase, vaginose bacteriana, malformação congênita do feto, e outros fatores que poderiam afetar o desfecho da gravidez. ( Também foram excluídas as mães que necessitaram de profilaxia com antibióticos para a realização de procedimentos odontológicos ou tinham sido submetidas a tratamento periodontal durante a gravidez.

Diagnóstico de periodontite e peso do recém-nascido ao nascer

A condição periodontal de cada mulher foi avaliada por um único dentista treinado. O grau de concordância entre o resultado obtido e o esperado na avaliação do nível de inserção clínico foi medido pelo coeficiente de Kappa (0,832, que indicou concordância quase perfeita) por escolha do examinador. O exame periodontal foi realizado no hospital até 3 dias após o parto. Os seguintes parâmetros clínicos foram avaliados em seis sítios por dente: profundidade de sondagem, recessão gengival, nível de inserção clínica e sangramento à sondagem. O examinador foi mantido cego em relação ao grupo a que pertenciam as participantes no momento do exame clínico periodontal. A periodontite foi definida como três ou mais dentes com um ou mais sítios apresentando profundidade de sondagem ≥4mm, nível de inserção clínico ≥3mm, e sangramento à sondagem no mesmo sítio. (

O registro de nascimento hospitalar foi consultado para obtenção dos dados de peso de cada recém-nascido. O desfecho gestacional de cada mulher foi avaliado de acordo com os critérios da Organização Mundial de Saúde (OMS) ( no tocante ao BPN (<2.500g).

Avaliação microbiológica

Foi avaliada a presença de cinco patógenos no biofilme dental subgengival: Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa), Porphyromonas gingivalis (Pg), Treponema denticola (Td), Tannerella forsythia (Tf) and Prevotella intermedia (Pi). Foi também avaliada a coinfecção, ou seja, a presença de três ou mais patógenos em uma única participante.

Depois da secagem e do isolamento, coletou-se o biofilme dental subgengival de seis sítios de maior profundidade de sondagem em cada paciente usando uma cureta Gracey (Hu-Friedy, Chicago, IL, EUA).

As amostras foram reunidas e armazenadas em um único tubo de microcentrífuga livre de DNAse e RNAse (Eppendorf, San Diego, CA, EUA), com solução estéril salina tamponada com fosfato (PBS) a -20°C até o momento da análise.

Extraiu-se ácido desoxirribonucleico (DNA) de cada amostra, usando mini-kit PureLink™ Genomic DNA (Invitrogen, Life Technologies, SP, BR), de acordo com as instruções do fabricante. A reação em cadeia da polimerase (PCR) foi usada para detectar o DNA bacteriano, usando pares de primers específicos para os cinco patógenos periodontais: Aa, Pg, Td, Tf e Pi. ( A presença do DNA bacteriano foi confirmada usando um par universal de primers que se ligam à sequência 16S rDNA. (

Cada reação foi realizada com volume final de 25µL, contendo tampão de PCR 1x (Invitrogen, Life Technologies, SP,BR), 0,2mM de dNTP (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, EUA), 0,02U/µL de Taq polimerase Platinum (Invitrogen, Life Technologies, SP, BR), 0,3µM de cada primer , 10ng de DNA molde e 14,15µL de H 2 O livre de RNAse. Para desnaturação, foi usado um termociclador (Perkin Elmer, GeneAmp PCR System 2400, Norwalk, CT, EUA) fixado a 94°C, por 5 minutos. Em seguida, as reações foram recozidas por 40 ciclos a uma temperatura de recozimento adequada para cada par de primers . Por fim, as reações foram submetidas a uma temperatura de 72°C por 4 minutos para completar a extensão do DNA.

Os produtos da amplificação foram comparados usando uma escada de DNA padrão de 100pb (Perkin Elmer, GeneAmp PCR System 2400, Norwalk, CT, EUA). A eletroforese foi realizada usando géis de agarose a 1,5% em tampão TAE 1x (Perkin Elmer, GeneAmp PCR System 2400, Norwalk, CT, USA), corados com SYBR ® Safe DNA Gel Stain (Perkin Elmer, GeneAmp PCR System 2400, Norwalk, CT, EUA). Os géis foram fotografados sob um transiluminador de luz azul (Kodak Digital Science System 120, Eastman Kodak Company, NY, EUA).

Análise estatística

As frequências simples e as medidas de tendência central foram calculadas usando os dados sociodemográficos, clínicos e de estilo de vida da amostra do estudo. Os grupos foram comparados pelo teste de distribuição do χ 2 em relação às variáveis categóricas, com nível de significância de 5% (p<0,05).

Odds ratio (OR), com intervalo de confiança de 95% (IC95%), foi utilizada para avaliar a associação entre periodontite e BPN, bem como quaisquer associações entre a presença de qualquer agente ou uma combinação dos seguintes patógenos periodontais: Aa, Pg, Td, Tf, Pi e BPN. Também foi avaliada a associação entre a condição de coinfecção e o BPN. Foram realizadas análises estratificadas e de regressão logística. A presença de covariáveis modificadoras de efeito foi investigada pelo teste da razão de máxima verossimilhança (p<0,05). A presença de covariáveis de confusão foi considerada utilizando análise de estratégia reversa. Quando qualquer covariável variou mais de 10% na medida da associação, foi confirmada como fator de confusão. Independentemente da confirmação estatística, qualquer covariável conhecida por influenciar tanto a periodontite quanto o BPN também foi considerada fator de confusão. Em suma, dois tipos de modelos, não ajustado e ajustado, foram construídos para avaliar as associações estudadas.

O teste de Hosmer-Lemeshow foi aplicado para verificar a qualidade do ajuste. Todos os dados foram analisados usando dois pacotes de software (Stata Data Analysis and Statistical Software, StataCorp LP, College Station, TX; e SPSS – software, versão 21.0, IBM, Armonk, NY).

RESULTADOS

A amostra final consistiu de 303 mulheres que foram avaliadas e classificadas de acordo com o desfecho da gravidez. O Grupo A tinha 79 (26,1%) mães de recém-nascidos com peso <2.500g, e o Grupo B tinha 224 (73,9%) mães de recém-nascidos com peso ≥2.500g. A média de idade das participantes do Grupo A era 23±7,0 anos (mínimo de 13 e máximo de 57), e, no Grupo B 24,6±6,1 anos (mínimo de 13 e máximo de 52) ( Tabela 1 ).

Tabela 1

Características sociodemográficas, estilo de vida e condição de saúde bucal e geral de mães de recém-nascidos com baixo peso ao nascer

Características	Grupo A	Grupo B	valor de p* †
Idade 13-17 e >36 anos	30 (37,98)	35 (15,63)	0,000
Nível educacional materno de 0-4 anos de estudo/ 5 0-4	13 (16,46)	38 (17,36)	0,856
Renda familiar de 0-1 salários mínimos mensais/ 3	53 (67,95)	154 (69,36)	0,815
Densidade familiar (≥4 pessoas)	25 (31,64)	63 (28,13)	0,553
Estado civil/ 3
Casada/união estável	64 (82,05)	180 (81,08)	0,850
Solteira/viúva/divorciada	14 (17,95)	42 (18,92)
Fumante durante a gravidez/ 21	5 (6,58)	7 (3,40)	0,240
IMC pré-gestacional ≤18,5/ 6	11 (14,29)	7 (3,18)	0,000
Hipertensão/ 3	17 (21,52)	38 (17,20)	0,394
Diabetes tipo 1/ 3	3 (3,80)	11 (4,98)	0,670
Periodontite/ 3	26 (33,34)	36 (16,22)	0,001
Não escovar os dentes após refeições/ 1	1 (1,27)	10 (4,49)	0,189
Não usar fio dental/ 3	50 (64,11)	146 (65,76)	0,791
Não ter feito consulta odontológica durante a gravidez/ 6	57 (73,08)	150 (68,49)	0,449
Sem atividade de educação pré-natal durante a gravidez/ 29	63 (82,90)	145 (73,23)	0,094

Resultados expressos por n (%).

/ x dados ausentes.

* valor de p: nível de significância ≤0,05; † teste χ 2 . IMC: índice de massa corporal.

As comparações estatísticas realizadas entre os casos e controles encontraram homogeneidade para a maioria das características sociodemográficas, clínicas e de estilo de vida avaliadas, com exceção da idade (p=0,000) e do índice de massa corporal (IMC) pré-gestacional (p=0,000).

Em relação à saúde bucal, as mulheres do Grupo A apresentaram frequência estatisticamente maior de periodontite (33,34%) em comparação com as do Grupo B (16,22%) (p=0,001).

Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre os grupos quanto à presença de agentes patogênicos periodontais. As frequências dos agentes patogênicos periodontais nos Grupo A e Grupo B foram, respectivamente, 64,55% e 61,60% para Aa; 63,29% e 61,16% para Pg; 88,60% e 86,16% para Td; 79,74% e 75% para Pi; e 98,73% e 100% para Tf. Ao se avaliar a coinfecção, ou seja, a presença concomitante de três ou mais espécies de agentes patogênicos periodontais, as frequências encontradas nos Grupos A e B foram 86,08% e 81,70%, respectivamente, não tendo diferença estatística significativa.

A tabela 2 mostra a distribuição dos agentes patogênicos periodontais e a presença de periodontite. Todas as participantes foram reagrupadas para refletir a presença ou ausência de periodontite (Grupos P e NP). Conforme esperado, foi detectada diferença estatisticamente significativa em relação a alguns agentes patogênicos periodontais, bem como na coinfecção, ao comparar esses dois grupos. Foram detectados com maior frequência em mulheres com periodontite Pg (p=0,023) e Pi (p=0,009) em comparação àquelas sem a doença. A presença de três ou mais agentes patogênicos também foi achado mais comum em puérperas com periodontite em comparação com indivíduos não afetados (91,93% versus 80,26%; p=0,030).

Tabela 2

Distribuição dos cinco periodontopatógenos nas amostras de biofilme subgengivais, entre os grupos de puérperas sem periodontite e com periodontite

Agentes patogênicos periodontais	Grupo NP	Grupo P	Valor de p* †
Agregatibacter actinomycetemcomitans / 3	145 (60,92)	43 (69,35)	0,222
Porphyromonas gingivalis / 3	139 (58,40)	46 (74,19)	0,023
Treponema denticola / 3	203 (85,29)	57 (91,93)	0,171
Tannerella forsythia / 3	238 (100)	61 (98,38)	0,056
Prevotella intermedia / 3	173 (72,68)	55 (88,70)	0,009
Coinfecção - mais de 2 espécies detectadas/ 3	191 (80,26)	57 (91,93)	0,030

Resultados expressos por n (%).

/ x dados ausentes.

* valor de p: nível de significância ≤0,05; † teste χ 2 .

A figura 1 mostra as medidas de associação estatística da OR não ajustada e ajustada, referentes à associação entre periodontite e BPN, bem como entre agentes patogênicos periodontais e BPN.

Figura 1

Medidas de associação estatística, odds ratio não ajustadas e ajustadas para idade, índice de massa corporal pré-gestacional e renda família, e os respectivos intervalos de confiança de 95% para a associação entre periodontopatógenos, periodontite e baixo peso ao nascer

* Presença concomitante de três ou mais espécies de agentes patogênicos periodontais.

OR: odds ratio ; Aa: Aggregatibacter actinomycetemcomitans; Pg: Porphyromonas gingivalis ; Td: Treponema denticola; Tf: Tannerella forsythia; Pi: Prevotella intermedia.

A análise do modelo não ajustado revelou associação estatisticamente significativa apenas entre periodontite e BPN: OR não ajustada de 3,87 e IC95%: 2,03-7,37. Após o ajuste para as covariáveis idade, IMC pré-gestacional e renda familiar, observou-se pequeno aumento na medida da associação estatística (OR ajustada de 3,99 e IC95%: 2,04-7,80), com significância estatística mantida, revelando que as mães com periodontite tiveram quatro vezes mais chances de dar à luz crianças com BPN do que as mães sem periodontite.

No tocante às comparações entre a presença dos patógenos periodontais Aa (OR ajustada d e 0,85; IC95%: 0,50-1,47), Pg (OR ajustada de 0,69; IC95%: 0,39-1,22), Td (OR ajustada de 0,61; IC95%: 0,27-1,42), Pi (OR ajustada de 0,60; IC95%: 0,31-1,17) e BPN, assim como coinfecção (OR ajustada de 1,70; IC95% [0,80 a 3,62]) e BPN, nenhuma associação estatisticamente significativa foi detectada, mesmos após ajuste para as mesmas covariáveis de confusão usadas em todas as análises ajustadas. Como o agente patogênico periodontal Tf estava presente no biofilme subgengival de ambos os grupos, não foi possível obter medidas de associação estatística.

DISCUSSÃO

O principal achado do presente estudo foi uma associação entre periodontite materna e BPN. No entanto, não foram encontradas associações entre a presença de bactérias periodontais no biofilme subgengival e BPN. Embora esses achados estejam de acordo com os relatados por outros autores, ( alguns estudos detectaram associação entre periodontite clínica, presença de periodontopatógenos e desfechos gestacionais adversos. (

Apesar dessas evidências referentes à associação entre periodontite materna, como fator de exposição, e desfechos gestacionais adversos, a magnitude da associação observada tem sido modesta. Embora a maioria dos estudos observacionais tenha confirmado essa associação, não foram encontrados benefícios referentes aos desfechos gestacionais nos estudos de intervenção, em termos de terapia periodontal. ( À luz dessa controvérsia, o estudo dos agentes patogênicos orais é crucial para a compreensão da natureza do desafio apresentado pela doença periodontal.

As discrepâncias entre este estudo e os anteriores podem ser parcialmente explicadas por variações no tamanho da amostra, uma vez que a maioria dessas investigações teve baixo número de participantes. Um total de 303 puérperas foram examinadas no presente estudo, ou seja, um número maior do que a da maioria dos relatórios anteriores. ( O poder estatístico relativamente elevado do presente estudo, em comparação com outros relatos da literatura, serve para contribuir para o corpo de investigações microbiológicas focadas em desfechos gestacionais desfavoráveis.

Outro fator que pode explicar as aparentes discrepâncias é o fato de a população estudada neste estudo ter sido recrutada no Nordeste do Brasil, onde as condições periodontais são extremamente precárias, e a prevalência de doença periodontal é alta. ( No entanto, outro estudo realizado no Sudeste do Brasil ( relatou resultados semelhantes, ou seja, uma associação entre periodontite e prematuridade/BPN. Esses autores também descobriram que nenhuma das 39 espécies de bactérias avaliadas no biofilme subgengival das puérperas estava associada a qualquer um desses desfechos gestacionais.

Além disso, muitos desses estudos avaliaram um número limitado de amostras de biofilme (geralmente duas a quatro por participante), o que pode subestimar as taxas reais de infecção periodontal. ( Por outro lado, o presente estudo coletou seis amostras de biofilme subgengival de cada participante, que foram obtidas nos locais mais comprometidos em cada sextante.

É interessante notar que essas disparidades também podem ser decorrentes dos critérios clínicos utilizados para definir a periodontite, bem como do desenho do estudo, da técnica empregada para avaliar a presença de periodontopatógenos, e as espécies específicas de bactérias avaliadas.

Uma comparação das características clínicas e demográficas das participantes do presente estudo encontrou homogeneidade em relação a maioria dos aspectos que representam fatores de risco para complicações gestacionais. No entanto, alguns fatores de alto risco foram observados com maior frequência em mães de bebês com BPN. A análise multivariada foi empregada para ajustar idade, IMC pré-gestacional e renda familiar, a fim de neutralizar o efeito dessas covariáveis de confusão no grupo estudado. No entanto, nenhuma significância estatística foi observada. Esse achado está de acordo com análises anteriores, ( que não encontraram diferenças significativas, mesmo após ajuste de fatores de confusão, nos níveis de periodontopatógenos entre mulheres sem desfechos gestacionais adversos, bem como naquelas que tiveram parto prematuro e/ou naquelas que deram à luz recém-nascidos com BPN.

Apesar da falta de significância estatística neste estudo para a associação entre escolaridade materna e BPN, não se pode desconsiderar que o nível de escolaridade e a percepção corporal influenciam no grau de conhecimento sobre os cuidados em saúde. (

Este estudo encontrou alta prevalência de periodontopatógenos em ambos os grupos, o que Dumitrescu et al., ( chamaram de “estado portador”, em que baixas quantidades de periodontopatógenos podem estar presentes em indivíduos sem diagnóstico clínico de periodontite. Isso complica ainda mais a avaliação de seu papel nessa doença.

Como várias espécies de bactérias periodontais são comumente encontradas juntas em bolsas periodontais, o isolamento de um tipo específico responsável pela patogênese dessa doença pode ser tarefa complexa. ( Devido à interação e à cooperação evidenciadas entre os diversos periodontopatógenos, ( também foi avaliada a ocorrência de coinfecção entre as mulheres estudadas.

Nossos resultados demonstram que a presença de três ou mais patógenos em mulheres grávidas não está associada a bebês com BPN. No entanto, diferentemente das análises de OR, considerando cada patógeno separadamente, a medida da associação estatística em relação à coinfecção se aproxima do nível de significância.

O uso recente de técnicas de sequenciamento metagenômico permite a triagem da composição genética e do potencial funcional de uma comunidade microbiana, fornecendo visão abrangente dessas comunidades em associação com a saúde periodontal e a periodontite crônica. ( Além disso, pode haver várias cepas de cada espécie periodontopatogênica com fatores de virulência de potencial variável. A capacidade que cada uma dessas espécies tem de translocar, invadir e colonizar tecidos fetais, bem como de evitar respostas imunológicas do hospedeiro, determina seu potencial específico de contribuir para desfechos adversos da gravidez. ( Portanto, são necessários mais estudos para investigar a heterogeneidade das comunidades microbianas periodontais em indivíduos.

É sabido que as bactérias, por si só, não são capazes de provocar destruição tecidual grave em todos os indivíduos, o que sugere que os indivíduos têm capacidade variável de se adaptarem a uma determinada carga bacteriana contida em seu biofilme. (

Os achados do presente estudo não indicam que a presença de um periodontopatógeno específico em si possa ser um fator biológico plausível na associação entre periodontite materna e a ocorrência de bebês com BPN. Por outro lado, o presente estudo não apenas reafirma a associação entre periodontite materna e bebê com BPN, mas também amplia o conhecimento atual, ao fornecer amostra substancialmente maior, permitir a exploração de possíveis fatores de confusão, aumentar o número de locais de coleta de biofilme e considerar um modelo de coinfecção na análise. No entanto, mais estudos são necessários para incluir um número maior de subgrupos de coinfecção, empregando amostras maiores.

CONCLUSÃO

Nesta população, não houve associação entre a presença de agentes patogênicos periodontais e a ocorrência de recém-nascidos com baixo peso ao nascer.