Mediterranean visceral leishmaniasis : update on biological diagnosis.

Visceral leishmaniasis (VL) is a severe life threatening parasitosis requiring early management of cases. It is an emerging disease in the Mediterranean region with a spread of endemic areas and an increase in case incidence. The patient profile has also evolved with more affected adults, presenting generally non-specific symptoms. Hence the interest of a systematic biological confirmation. The microscopic detection of Leishmania amastigotes in bone marrow aspirates (BMA) smears is the gold standard diagnostic technique. However, it requires invasive sampling. Serological tests searching for specific antibodies remain highly contributory, but their interpretation must always take into account the epidemiological context and the patient's clinical and biological features. Currently, the Western-Blot represents the most specific serological technique for diagnostic confirmation. VL diagnosis has greatly improved by the introduction of both rapid diagnostic tests (RDTs) and molecular biological techniques. RDTs using recombinant rk39 antigen are easy to perform and deliver results in less than 30 minutes. Real-time PCR (Polymerase Chain Reaction) is currently retained as the best technique for VL diagnosis. It is efficient on simple blood samples, allowing to avoid invasive BMA needed for microscopy. In addition, real time PCR estimates parasite load which is helpful for the post-treatment follow-up. In any case, the choice of techniques to be used should be strategic and adapted to the local epidemiology as well as to the means available.

INTRODUCTION

La leishmaniose viscérale (LV) est une infection parasitaire causée par un protozoaire du complexe Leishmania (L.) donovani, qui comprend deux espèces majeures L. donovani sensus stricto et L. infantum (1 ). C’est une maladie essentiellement transmise par la piqûre d'un insecte vecteur ; le phlébotome (1 ). D’autres modes de contamination sont possibles tels que les échanges de seringues souillées chez les toxicomanes, les transfusions sanguines et les greffes d'organes (2, 3, 4 ). Les infections congénitales par transmission transplacentaire sont exceptionnelles (5 ). Selon l’OMS, l'incidence annuelle mondiale de la LV est estimée en 2018 entre 50 000 et 90 000 nouveaux cas qui engendrent 20 000 à 30 000 décès (6, 7 ). La LV se présente sous deux formes nosogéographiques qui différent par la nature du réservoir, les espèces de leishmanies en cause et les zones géographiques concernées :

– la LV anthroponotique appelée aussi kala-azar. Elle est due à L. donovani et sévit dans le sous-continent indien et en Afrique de l’Est (1 ).

– la LV zoonotique qui est due à L. infantum et dont le réservoir est le chien. Elle sévit principalement sur le pourtour du bassin méditerranéen, au moyen orient et en Amérique du Sud (1 ).

Dans le bassin méditerranéen, la LV a une incidence annuelle qui varie de 600 à 2000 cas selon les années (8 ). Son épidémiologie est marquée par certaines émergences périodiques ainsi qu’une extension des zones endémiques particulièrement en Afrique du Nord et au Sud de l’Europe (9). Cette extension serait surtout liée à des facteurs environnementaux particulièrement ceux favorables aux phlébotomes vecteurs et aux chiens réservoirs comme la mobilisation des ressources hydrauliques, l’élevage et l’agriculture (10).

La LV est fréquente au Maghreb. En Tunisie, son incidence annuelle varie de 50 à 150 cas (11 ). Elle est endémique surtout au nord et au centre du pays. Une extension géographique a été notée ces dernières années vers le sud du pays et serait aussi associée aux changements écologiques suscités (11, 12, 13 ). En Algérie, la LV est endémique dans les régions humides et sub-humides du nord avec une incidence de 100 à 200 cas annuels ; comparable à celle enregistrée en Tunisie (14 ). Au Maroc, La LV sévit dans certaines zones subhumides du Nord et s’étend vers le centre du pays. Son incidence moyenne est estimée à environ 100 cas par an, avec une recrudescence nette depuis les années 1990 (15, 16, 17 ). Il est à noter que dans les 3 pays du Maghreb, des cas plus rares sont occasionnellement observés plus au sud dans des foyers circonscrits à certains oasis comme celles de Tozeur en Tunisie et Illizi en Algérie (11, 14, 18). En Afrique du Nord, la LV reste majoritairement une maladie de la petite enfance qui concerne dans environ 80% des cas des enfants de moins de 5 ans (11, 18, 19, 20). Cependant, une recrudescence des cas chez les adultes a été observée depuis les années 1990 (21, 22). Elle a été surtout rapportée chez des sujets présentant une immunodépression liée principalement à l'infection par le VIH et à certains traitements par les immunosuppresseurs, les corticoïdes ou les antimitotiques. Les cas de LV de l’adulte ont été également décrits chez des sujets sans facteurs d’immunodépression (21, 23). Ils pourraient être en rapport avec des souches parasitaires plus virulentes ou des déficits immunitaires discrets ou non investigués. Il est à signaler que la LV à L. infantum est de nos jours considérée comme une parasitose opportuniste (2, 3). En Europe du sud, la LV est endémique dans 8 pays (France, Espagne, Portugal, Italie, Albanie, Chypre, Grèce et Malte) ( 9, 24 ). En France, la LV autochtone se transmet sur la Côte d’Azur, en Provence, dans les Cévennes, dans les Pyrénées Orientales et en Corse ( 24, 25 ). Le nombre moyen de cas de LV autochtones enregistrés au centre national de référence des leishmanioses a été de 22,6 cas annuel entre 1999 et 2012 (26). Les autres pays de la rive nord méditerranéenne comme l’Italie, l’Espagne et l’Albanie rapportent plus de 100 cas de LV par an ( 27, 28 ). Une épidémie a été même observée dans la banlieue sud de Madrid entre 2009 et 2012 avec 446 cas enregistrés ( 29, 30). Il est à noter que dans les pays du sud-ouest de l’Europe (Portugal, Espagne, France, Italie), les cas d’adultes sont majoritaires avec plus de 50% d’entre eux co-infectés par le VIH (30). Les cas d’adultes sans facteurs d’immunodépression ne sont pas exceptionnels et sont de plus en plus rencontrés. A titre d’exemple, lors de l’épidémie récente de la LV de Madrid, près de 70% des cas ont été diagnostiqués chez des adultes immunocompétents (29 ).

En zone endémique, la LV doit être suspectée devant tout contexte évocateur. C’est une infection grave et fatale en l’absence de traitement. Son diagnostic doit être fiable et rapide.

L’objectif de cette mise au point est d’une part de rappeler les données épidémiologiques et clinico-biologiques évocatrices de la LV et d’autre part de passer en revue les techniques actuelles de son diagnostic biologique en précisant leurs performances, leurs avantages et leurs limites et de conclure en recommandant une stratégie de leur utilisation selon les contextes épidémio-cliniques.

SIGNES CLINIQUES

Les manifestations cliniques de l’infection par L. infantum sont très variables et polymorphes. Elles vont du portage asymptomatique assez fréquent à la maladie polysymptomatique potentiellement mortelle ( 1, 30, 31, 32). L’expression clinique dépend d’une part de l’hôte infecté ; principalement de l’âge, de l’état immunitaire, de la prédisposition génétique, d’une éventuelle malnutrition, etc et d’autre part de la virulence de la souche en cause et de la quantité de parasites infectants inoculés ( 33 ). Les constituants de la salive du phlébotome pourraient également intervenir d’après certaines données récentes ( 34 ). La LV méditerranéenne atteint souvent les enfants avec des signes cliniques évocateurs. Les formes observées chez l’adulte sont plus rares et s’associent à des manifestations cliniques moins caractéristiques, expliquant les difficultés diagnostiques.

- La forme clinique type de l’enfant se caractérise par une triade classique comprenant une fièvre irrégulière décrite comme folle évoluant pendant plusieurs semaines voir des mois, une pâleur témoin de l’anémie et une splénomégalie lisse ferme et indolore pouvant dépasser l’ombilic ( 35 ). Les adénopathies sont rares mais peuvent être isolées (36 ). À ces signes s’associe le plus souvent une altération de l’état général avec une perte de poids. Une hépatomégalie peut être notée dans plus de la moitié des cas témoignant souvent d’une forme évoluée ( 37 ). Sous les climats tempérés comme celui du bassin méditerranéen, les signes cliniques peuvent avoir un caractère saisonnier avec un début plutôt hivernal, soit après une incubation silencieuse de quelques semaines à quelques mois après la piqure infectante souvent estivale des phlébotomes ( 11, 13, 18). Cette période d’incubation est cependant plus variable et moins marquée qu’au cours de la leishmaniose cutanée (LC) faisant que contrairement à cette dernière forme, les cas de LV sont observés sur tous les mois de l’année (11, 38 ).

- Chez l’adulte, le tableau clinique est souvent incomplet et moins bruyant. En effet, l’infection est généralement pauci-symptomatique. Les atteintes bronchiques, digestives ou tégumentaires sont plus fréquentes ( 22, 39 ). Dans la moitié de ces cas, on retrouve une immunodépression telle qu’une co-infection avec le VIH avec un taux de lymphocytes CD4 inférieur à 200/mm3 ou une thérapeutique immunosuppressive (2, 10 ). Dans les pays d’endémie comme le notre, il faut toujours évoquer la LV devant une fièvre au long cours ou une splénomégalie isolée non étiquetées.

SIGNES BIOLOGIQUES NON SPECIFIQUES D’ORIENTATION

Le tableau biologique associe habituellement une pancytopénie, un syndrome inflammatoire et une dysprotéinémie. L’anémie est quasi constante (30, 40 ). Elle est normochrome, normocytaire et arégénérative et s’aggrave progressivement au cours de l’évolution. La neutropénie est fréquente et parfois importante avec une agranulocytose aiguë. L’absence d’hyperleucocytose dans un contexte infectieux est évocatrice. La thrombopénie reste longtemps modérée mais peut s’aggraver (10 ). Le syndrome inflammatoire est marqué par une vitesse de sédimentation globulaire très accélérée atteignant en général 50 à 100 mm à la première heure et une CRP très augmentée ( 20 ). La protidémie totale peut être normale, diminuée ou élevée avec un rapport albumine/globuline souvent inférieur à un. L’électrophorèse des protides met en évidence une hypoalbuminémie et une hypergammaglobulinémie polyclonale très suspecte touchant surtout les IgG (1 ).

En l’absence de traitement, la LV peut s’aggraver progressivement et entraîner la mort par des complications principalement hémorragiques et/ou infectieuses (1, 30 ). Son pronostic dépend de la précocité du diagnostic et de la prise en charge thérapeutique. D’où l’intérêt de penser au diagnostic devant un contexte évocateur et surtout utiliser les techniques biologiques performantes et rapides pour le confirmer.

DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE SPECIFIQUE

De très nombreux outils sont actuellement disponibles pour confirmer le diagnostic de la LV. Leur accessibilité, leurs performances, leur coût et leur rapidité d’exécution sont très variables. Ils sont groupés en 3 grandes classes selon la preuve d’infection parasitaire qu’ils cherchent : l’observation du parasite, la détection des anticorps spécifiques et la mise en évidence de l’ADN parasitaire.

I.Diagnostic parasitologique

Il repose sur la mise en évidence des leishmanies apportant ainsi un diagnostic de certitude de la LV.

1. Examen microscopique direct :

classiquement la recherche du parasite nécessite un prélèvement de moelle osseuse (MO) réalisé par ponction sternale chez l’adulte et par ponction de la crête iliaque chez l’enfant. La ponction de MO reste un geste invasif, douloureux et souvent traumatisant pour le patient. Lorsqu’il est réalisé, il doit être réussi afin de ramener le matériel médullaire utile et ainsi optimiser les chances de mise en évidence des leishmanies. D’autres prélèvements ; du foie, des ganglions lymphatiques, des muqueuses digestives ou des lavages broncho-alvéolaires peuvent être effectués en fonction des manifestations cliniques (39, 41 ). Il est à noter que la ponction splénique constitue un prélèvement de choix crédité de la meilleure sensibilité (93%-99%) ( 42, 43 ). Néanmoins, elle présente un risque hémorragique important à cause de la thrombopénie souvent associée et devrait être évitée autant que possible (44 ). L’examen direct des frottis de MO après coloration au May-Grünwald-Giemsa ou au Giemsa ou ses dérivés (RAL555®) montre les formes amastigotes ; souvent en extracellulaire et/ou typiquement en intracellulaires dans les cellules phagocytaires ( 20, 30 ). Elles sont ovales ou arrondies de 2 à 5 μm de diamètre et renferment un noyau et un kinétoplaste punctiforme ou de forme allongée. Le cytoplasme est coloré en bleu pâle, alors que le noyau et le kinétoplaste sont colorés en rouge pourpre (Figure 1) (10 ). L’examen microscopique de la MO est une méthode de base du diagnostic de la LV ( 45, 46 ). Il est avantageux grâce à son coût faible et son résultat rapide. Cependant, la lecture des frottis nécessite un biologiste expérimenté. Les faux négatifs ne sont pas exceptionnels et s’observent en cas de faible charge parasitaire ou de ponction hémodiluée. La sensibilité du médullogramme varie entre 53% et 86% selon les séries (44, 47, 48).

 Figure 1. Amastigotes de leishmanies en intra-macrophagique au myélogramme (X100).

Ces dernières années, la recherche de leishmanies au niveau du sang périphérique, après leuco-cyto-centrifugation a été utilisée par plusieurs équipes (49, 50, 51 ). Elle est recommandée chez les sujets immunodéprimés, en raison du caractère peu invasif du prélèvement sanguin comparativement à la ponction médullaire et des parasitémies relativement élevées en cas d’immunodépression.

2. Culture :

la mise en culture de la MO sur milieux spécifiques permet l’obtention de formes promastigotes de leishmanies de 10 à 15 µm de long sur 1 à 3 µm de large, flagellées et mobiles. Le milieu Novy, Mc Neal et Nicolle est le plus utilisé en pratique courante (52, 53). C’est un milieu facile à préparer et peu coûteux. Il est constitué d’une gélose enrichie de sang de lapin et additionnée d’antibiotiques et d’antifongiques pour inhiber la prolifération des bactéries et des moisissures. D'autres milieux de culture peuvent être utilisés tels que le milieu de sérum de lapin coagulé, le milieu RPMI et le milieu de Sloppy-Evans (52). Cependant, ces derniers sont plus difficiles à préparer et sont plus coûteux. La culture présente l’avantage de rattraper certains examens directs négatifs (30, 53 ). Elle permet également d’isoler les souches et ainsi les identifier par typage isoenzymatique ( 54 55 ). Elle permet également dans certains cas l’évaluation de leur sensibilité aux anti-leishmaniens (56). Néanmoins, le principal inconvénient de la culture est son incubation d’un minimum d’une semaine jusqu’à un mois. De tels délais sont longs pour une maladie grave nécessitant une prise en charge rapide voir urgente. Selon les études, les sensibilités rapportées des myélocultures varient de 60% à 100% (52, 57 ). Les faux négatifs sont observés en cas de faible charge parasitaire ou de difficulté de pousse de certaines souches de leishmanies dont celles de L. infantum (48). De même, les cultures peuvent être confrontées aux problèmes de contaminations ; diminuant ainsi leurs sensibilités (52). Ces 25 dernières années, l’isolement des leishmanies en culture a été efficacement réalisé à partir du sang périphérique (52, 58). Plusieurs études ont ainsi montré que les sensibilités de mises en cultures de la couche leucocytaire sanguine et de la MO sont comparables chez les sujets immunocompétents (47, 52). Les faux négatifs sont observés en cas de très faible parasitémie ou de quantité insuffisante du sang prélevé.

La mise en culture du sang représente une option intéressante dans le diagnostic de la LV. Cependant, les longs délais d’incubation et la nécessité de disposer d’une animalerie ont réduit son usage en pratique courante ; la laissant l’apanage des laboratoires spécialisés et des centres de recherche.

3. Autres méthodes:

D’autres techniques de mise en évidence de leishmanies sont décrites telles que le xénodiagnostic et l’inoculation à l’animal, particulièrement le hamster pour L. infantum. Elles sont cependant peu employées dans le cadre du diagnostic puisqu’elles sont longues, modérément sensibles et exigent un élevage de phlébotome ou une animalerie (59 ).

II.Diagnostic immunologique

Il se base principalement sur la mise en évidence des anticorps spécifiques anti-Leishmania dans le sérum ou le plasma.

1. Mise en évidence des anticorps spécifiques :

plusieurs techniques immunologiques sont utilisées pour le diagnostic des LV. Elles se pratiquent sur des prélèvements de sang et sont donc moins invasives que la ponction de MO. Elles détectent des anticorps spécifiques qui sont de très haute valeur diagnostique.

*L’immunofluorescence indirecte (IFI) : elle est considérée comme la technique sérologique de référence (25, 59 ). Sa sensibilité et sa spécificité rapportées varient respectivement de 87 à 100% et de 77 à 100% (46 60 ). Néanmoins, malgré ces bonnes performances, le résultat de l’IFI demeure étroitement lié à l’expérience du microscopiste. De plus, elle exige un microscope à fluorescence de coût élevé pas toujours disponible.

*L’ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) : c’est une technique immunoenzymatique qui est progressivement en train de supplanter l’IFI en pratique courante. Elle peut être automatisable et offre la possibilité de tester de nombreux prélèvements en série sur une même plaque. Cependant, ses sensibilités et spécificités dépendent étroitement de l’antigène employé (47 61 ). Les kits utilisant le peptide recombinant K39 (rK39) ont d’excellentes spécificités estimées de 93% à 100% ( 62, 63, 64 ). Un test ELISA développé récemment et basé sur la détection d'anticorps contre la protéine de fusion rk28 a montré une sensibilité et une spécificité très prometteuses de 99,6 (IC 95%, 0.97–0.99) et de 94,1-100% respectivement (65 ). Par ailleurs, des tests ELISA détectant les IgE anti-leishmaniens ont été également utilisés pour le diagnostic. En plus de leur sensibilité élevée, ils ont montré un intérêt dans le suivi post-thérapeutique puisque leur négativité est en faveur d’une bonne réponse (66).

L’IFI et l’ELISA sont des techniques quantitatives employées couramment en diagnostic de routine. Les résultats montrant des titres élevés d’anticorps sont en faveur du diagnostic de la LV. Cependant, l’interprétation des titres faibles d’anticorps est délicate particulièrement en zones d’endémie des LV et des LC, comme le Maghreb où des sujets tout venant peuvent présenter pareils titres sans que ce ne soit associé à une vraie LV (67). D’autre part, ces techniques sont parfois prises en défaut dans certaines immunodépressions, dont l’infection par le VIH, révélant ainsi des résultats faussement négatifs (68).

*L’hémagglutination indirecte et l’électrosynérèse : elles sont rarement employées pour le diagnostic des LV à cause d’un manque de sensibilité et de spécificité lié aux antigènes utilisés (45).

*L’immunoempreinte ou western blot (WB) : elle représente une technique sérologique de choix pour confirmer le diagnostic d’une LV à L. infantum en mettant en évidence deux bandes spécifiques 12/14 et/ou 16 kDa (66 ). En plus de sa spécificité, plusieurs études ont montré que la sensibilité du WB était supérieure à celle des techniques de sérologiques conventionnelles et approche 100% chez l’immunocompétent ( 70, 71 )En outre, ce test permet aussi de différencier les sujets malades de ceux porteurs asymptomatiques. En effet, selon certains auteurs, la présence simultanée des bandes 14 kDa et/ou 16 kDa avec des bandes comprises entre 18 et 33 kDa serait plutôt spécifique de la LV maladie ( 70, 72 ). Malgré le coût élevé des Kits commercialisés, leurs bonnes performances justifient leur utilisation en tant que techniques de confirmation dans les laboratoires spécialisés et ce particulièrement dans certaines situations comme chez les sujets immunodéprimés dont les titres d’anticorps sont parfois très faibles. En effet, chez les patients co-infectés par le VIH, la méta-analyse de Cota et al a montré des sensibilités supérieures du WB (84%) par rapport à l’ELISA (66%) et l’IFI (51%). Les spécificités de ces différentes techniques étaient respectivement de 82%, 90% et 93% (73).

*Les tests d’agglutination directe DAT (Direct Agglutination Test) : développés à la fin des années 1990, ils sont basés sur la détection semi-quantitative des anticorps spécifiques en utilisant des leishmanies formolés. Ils sont peu coûteux, de lecture simple et bien adaptés aux conditions des structures sanitaires des zones rurales et périphériques, d’où sont originaires la majorité des cas de LV ( 46, 74 ). Néanmoins, ils nécessitent plusieurs dilutions, une incubation assez longue de 12 à 18 heures et des conditions minimales de conservation de l’antigène. La méta-analyse de Chappuis incluant 30 études estimait une sensibilité et une spécificité des DAT élevées de 94,8% (IC 95%, 92.7–96.4) et de 85,9% (IC 95%, 72,3– 93,4) respectivement (75 ). L’étude récente de Bangert en 2018 utilisant le test DAT (ITM-DAT/VL, Belgium) rapporte une sensibilité de 84% et une spécificité de 86% (76 ). Il faut toutefois signaler que les valeurs prédictives des DAT sont variables et sont étroitement liées à la prévalence de l'infection et au contexte épidémiologique ( 25, 45 ). En effet, ces tests peuvent être « faussement positifs » en cas de portage asymptomatique du parasite ou d’une infection ancienne ( 45, 77 ). De même, des réactions croisées ont été observées en cas d’autres infections tels que le paludisme, la maladie de chagas et la brucellose ( 45, 77 ). Par conséquent, l’utilisation des DAT reste limitée en pratique courante. La méta-analyse de Maia et al suggère leur utilisation lorsque d’autres techniques de confirmation ; particulièrement celles de mise en évidence du parasite ne sont pas disponibles (78). Un nouveau test d'agglutination rapide (FAST) adapté au dépistage de masse et permettant un résultat rapide en moins de trois heures a été testé en Iran. Sa sensibilité et sa spécificité étaient respectivement de 95,4% et 88,5% en comparaison avec le DAT classique (79 ). Chez les patients co-infectés par le VIH, la méta-analyse de Cota et al rapporte une meilleure sensibilité des DAT (81%) par rapport à l’ELISA (66%) et l’IFI (51%) ainsi qu’une bonne spécificité de 90% (73 ).

*Les tests de diagnostic rapide  (TDR) : Ils ont été développés plus récemment pour la détection des anticorps anti-Leishmania dans le sérum, le plasma ou le sang total et sont en train de révolutionner le diagnostic et la prise en charge (PEC) de la LV. Ils reposent sur le principe de l’immunochromatographie en utilisant des bandelettes sensibilisées par un antigène recombinant tels que le rK39, le rK9, le rKE16, le rK26 et le rK28 (65, 80, 81).

Les TDR utilisant le rK39 ont montré les meilleurs sensibilités et spécificités et sont actuellement les plus utilisés (Figure 2 ) ( 63, 75 ). Néanmoins, les performances diagnostiques des tests commercialisés sont très variables et dépendent des variations régionales de l’expression de l'antigène rK39 au niveau des souches circulantes ( 75, 82, 83, 84 ). Actuellement, parmi les TDR basés sur le rK39,  le Kalazar Detect® (Inbios International, USA) et le IT-LEISH® (BioRad, France) sont les tests les plus validés (85 ). Dans une évaluation menée par l'OMS en 2012, les sensibilités du test DiaMed IT-LEISH® (Biorad, France) ont été de 87,2% en Afrique de l'Est, de 92% au Brésil et de 98,8% sur le sous-continent indien. Les spécificités étaient de 96,4% en Afrique de l’est, de 95,6% au Brésil et de 97,6% en Inde (86 ). De même, une revue systématique récente, montre une sensibilité du TDR rK39 dans le sous-continent indien et au Brésil estimée à 97% et 88-94% respectivement, tandis qu’elle était plus faible en Afrique de l'Est (85%), alors que les spécificités étaient toujours supérieures à 90% (87 ). En France, Marty et al rapportent une sensibilité et une spécificité du test DiaMed IT-LEISH® (Biorad, France) respectivement de 97% et 98% (25 ). En Espagne, l’étude de Bangert et al rapporte 83% de sensibilité et 100% de spécificité pour le Kalazar Detect® avec des valeurs prédictive positive (VPP) et négative (VPN) respectives de 100% et de 93,6% (76 ). En Tunisie, l’évaluation du test Kalazar Detect® sur une série de 574 cas de LV trouve une sensibilité de 87,1% et une spécificité de 94,4% (67 ). En 2015, l’évaluation d’un nouveau TDR basé sur la protéine recombinante rK28 a montré une sensibilité supérieure à 95% en Inde et en Afrique de l'Est (88 ). Un autre test de détection rapide (TRALd®) (InBios International, USA) utilisant le rK39 et le rK26 a montré une sensibilité et une spécificité élevées respectivement de 100% et de 98% ( 89 ).

 Figure 2. Test rapide de leishmaniose IT-LEISH® positif.

Les TDR ont révolutionné la prise en charge de la LV en raccourcissant le délai diagnostique avec un résultat rapide en 10 à 20 mn. Ils ne nécessitent pas d’équipements ou de réactifs spécifiques, ni de modalités de transport et de conservation exigeantes et sont simples à réaliser par un personnel n’ayant pas nécessairement une expertise sur le sujet. Actuellement, les TDR sont fortement recommandés par l’OMS en cas de suspicion de LV particulièrement en zones d’endémie de la maladie et en l’absence d’autres techniques de confirmation du diagnostic (7 ). En Tunisie, ils ont été introduits en routine ces dernières années, permettant ainsi d’accélérer la démarche diagnostique particulièrement dans les laboratoires non spécialisés dont ceux des hôpitaux régionaux (circulaire 19/2018, Ministère de la Santé, Tunisie). Ceci permet l’instauration rapide du traitement et l’amélioration du pronostic de la maladie. Par ailleurs, il faut signaler que chez les sujets immunodéprimés, principalement ceux co-infectés par le VIH, les TDR sont moins sensibles (90 ). En effet, la sensibilité du test IT-LEISH® n’était que de 54% (avec une spécificité de 98%) dans l’étude de Marty concernant des sujets séropositifs pour le VIH ( 25 ). De même, Bangert rapporte chez une population comparable une sensibilité de 67,3% avec une spécificité de 100% pour le test Kalazar Detect®. La VPP était de 100%, alors que la VPN n’était que de 66,7% (76 ). Par conséquent, en cas de TDR négatif chez les patients immunodéprimés, il est recommandé de compléter par une PCR, un médullogramme ou un WB.

Les faux positifs des TDR ont été fréquemment observés chez les porteurs asymptomatiques vivant dans les zones endémiques(91, 92, 93 ). De même les TDR peuvent être positifs chez certains sujets atteints de LC qui synthétisent et gardent des taux faibles d’anticorps spécifiques anti-Leishmania (67, 94, 95). Cette positivité est liée à des communautés antigénique entres les différentes espèces en cause. Par conséquent, en Tunisie et dans les autres pays où coexistent la LC et La LV, l’interprétation de ces tests doit tenir compte des antécédents du patient et de son origine géographique. Les réactions croisées ont été également observés en cas de paludisme, de fièvre typhoïde, de trypanosomose et de tuberculose (91, 96 ). Dans tous les cas, l’interprétation des résultats des TDR et leur confirmation éventuelle par des tests plus spécifiques (médullogramme ou PCR) doivent prendre en compte le contexte épidémiologique, les signes clinico-biologiques et la disponibilité des autres techniques du diagnostic biologique.

La détection des anticorps sériques anti-Leishmania demeure très utile dans le diagnostic de la LV. Elle l’est encore davantage quand la recherche du parasite est négative ou ne peut être réalisée. En effet, une sérologie positive de la leishmaniose permet une très forte présomption du diagnostic devant des signes cliniques et des anomalies biologiques évocateurs (25 ). Les présomptions tendent vers les certitudes lorsque les titres d’anticorps sont significatifs avec les techniques quantitatives. Néanmoins, chez les sujets immunodéprimés, la majorité des techniques sérologiques manquent de sensibilité car les anticorps sont souvent à des titres faibles voire absents (2, 47 ). Les faux positifs du sérodiagnostic sont rencontrés suite à des réactions croisées chez des patients atteints de paludisme, de trypanosomose, de tuberculose, d’une connectivité ou de syndromes myéloprolifératifs (48, 59 ). Par ailleurs, la sérologie peut être positive en cas de portage asymptomatique posant ainsi un problème diagnostique dans les zones d’endémie (97, 98 ). En conséquence, l’interprétation des résultats sérologiques doit toujours tenir compte du contexte épidémiologique et du tableau clinico-biologique du patient. Il est également important de signaler que la sérologie n’est pas indiquée dans le suivi post-thérapeutique puisque les anticorps persistent à des titres élevés plusieurs mois après la guérison (20, 99).

2. Mise en évidence des antigènes parasitaires :

plusieurs tests d’agglutination indirecte recherchant les antigènes circulants dans les urines ont été mis au point (46, 100). Leurs performances varient selon les études et montrent une sensibilité très variable de 47 à 95% avec une bonne spécificité de 82 à 100% (48, 100, 101 ). La méta-analyse de Cochrane en 2014 incluant six études et évaluant le test KAtex® (Kalon Biological, United Kingdom) rapporte une spécificité élevée de 92,9% (IC 95%, 76,7%-99,2%) et une sensibilité relativement faible de 63,6%  (IC 95%, 40,9%-85,6%) (87 ). Plus récemment, Ghosh et al ont rapporté l’intérêt d’un nouveau kit ELISA détectant l’Ag recombinant rK28 dans les urines avec une sensibilité de 95,4% et une bonne spécificité de 96,3% (102 ). Les bonnes spécificités des tests détectant des antigènes parasitaires soulignent leur utilité en cas de positivité surtout qu’ils sont rapides, simples à exécuter et que les urines sont faciles à obtenir. Ils sont également adaptés au suivi des patients traités puisqu’ils se négativent un à six mois après un traitement efficace (103 ). Ils sont non exigeants en équipement et en matériel, ce qui privilégie leur utilisation sur le terrain. Toutefois, leur indication reste limitée en pratique courante à cause de leur faible VPN et des faux positifs possibles en cas de portage asymptomatique (104, 105). Ils seraient plus intéressants chez les patients immunodéprimés co-infectés par le VIH dont les titres en anticorps peuvent être faibles et chez lesquels les performances sont meilleures avec une sensibilité de 85 à 100% et une spécificité de 96 à 100% ( 103, 106).

III. Diagnostic moléculaire

La détection de l’ADN de leishmanies par amplification génique par PCR (Polymerase Chain Reaction) est de nos jours la méthode la plus utilisée à travers le monde pour le diagnostic de la LV (107, 108, 109). Elle peut être réalisée sur divers prélèvements biologiques principalement les ponctions de la MO, du foie ou des ganglions. Il est également possible de la pratiquer sur des biopsies tissulaires d’organes potentiellement touchés. Le plus indéniable de la PCR au cours de la LV reste ses très bonnes performances sur les échantillons de sang qui sont même rapportées comme comparables à celles avec la MO (47, 97 ). Par conséquent, la recherche d’ADN parasitaire dans du sang périphérique, facilement recueilli sur un anticoagulant (EDTA), a désormais permis de supplanter l’invasive ponction médullaire dans le diagnostic de la LV. Les cibles d’amplification les plus fréquemment utilisées correspondent à de l’ADN kinétoplastique, l’ADN ribosomique 18S et le gène codant pour l’ARN polymérase II (47). La méta-analyse de Ruiter et al. incluant 19 études ayant utilisé les prélèvements sanguins rapporte une sensibilité et une spécificité de la PCR de 93,1% (95% IC, 90,0-95,2) et de 95,6% (95% IC, 87,0-98,6) respectivement ( 97 ). Il faut toutefois signaler que dans ces études l’analyse des performances des PCR en question n’a pas pris en considération la détection du portage asymptomatique fréquent en zone d’endémie ainsi que les vraies infections non détectées par l’examen microscopique, la culture et/ou la sérologie préalablement adoptées comme techniques de référence. Les performances de la PCR seraient donc probablement meilleures que celles rapportées dans ces études. L’apport des techniques PCR est encore plus important chez les patients immunodéprimés en raison des plus fortes charges parasitaires (CP). En effet, la méta-analyse de Cota et al regroupant 33 études montre que ces techniques sont les plus performantes au cours de la LV chez les patients co-infectés par le VIH, avec une sensibilité de 95% et une spécificité de 96% (73 ).

Parmi les différentes variantes de PCR disponibles, la PCR quantitative en temps réel ressort actuellement comme celle de choix dans le diagnostic de la LV (Figure 3 ) (107, 110 111 ). C’est la méthode la plus sensible. Elle peut détecter des parasitémies inférieures à un parasite/microlitre de sang en ciblant l’ADN kinétoplastique dont le nombre de copies peut aller jusqu’à 10 000 par parasite ( 110, 111). La PCR en temps réel présente également l’avantage d’un diagnostic rapide en rendant un résultat en quelques heures. De plus, elle est réalisée en système fermé ce qui réduit les risques de contaminations (110). En plus de son apport diagnostique, la PCR quantitative évalue la CP d’où son intérêt dans l’évaluation et le suivi de la réponse au traitement des patients (111, 112 ). Elle permet de détecter précocement les résistances aux traitements et les fréquentes rechutes et récidives chez les immunodéprimés améliorant ainsi sensiblement la PEC de ces patients (90 ). Grace à l’estimation de la CP, elle aide également à faire la part dans certaines situations entre le portage asymptomatique et la maladie active ( 111, 113 ). Les sensibilités de cette technique pour les prélèvements médullaires et sanguins sont proches de 100% avec des spécificités excellentes (30 ). Selon l’étude de Aissi et al concernant 240 cas de LV diagnostiqués en Tunisie, la PCR en temps réel était la technique la plus sensible (100%) suivie de la sérologie par ELISA (95%), de l’examen direct du myélogramme (82,8%) et enfin de la culture du sang sur milieu NNN (69,3%) (40 ).

 Figure 3. Courbes d’amplifications d’une PCR en temps réel TaqMan de dilutions en série d’ADN de Leishmania infantum.

La limite des techniques PCR en temps réel est l’exigence d’appareils assez coûteux pas toujours disponibles dans les structures sanitaires des pays en voie de développement. L’alternative des PCR classiques en point final dont les thermocycleurs sont plus accessibles reste fort utile malgré les résultats plus tardifs liés à l’étape de migration des amplifias sur gel et à l’absence de quantification de la charge parasitaire. Plus récemment, la technique LAMP à amplification isotherme de l’ADN et à révélation plus simple semble prometteuse. En effet, elle est nettement moins exigeante en équipements et peut s’adapter aux structures sanitaires périphériques (114, 115).

En dépit de son coût plus élevé, le diagnostic moléculaire de la LV est devenu incontournable pour la confirmation diagnostique et le suivi des malades. Les techniques de biologie moléculaire sont également utiles à l’identification des espèces de Leishmania en cause chez les patients. La PCR-RFLP (Restriction fragment length polymerase) ciblant le gène ribosomal ITS1 (internal transcribed spacer) (116), la PCR utilisant des températures de fusion (HRM) et le séquençage de plusieurs gènes discriminatifs sont les plus utilisés pour cet objectif ( 107, 116, 117 ). Cependant, l’identification d’espèce est mois intéressante et contributive au cours de la LV. En effet, la majorité des foyers mondiaux de la maladie n’impliquent qu’une seule espèce à la fois à savoir L. donovani dans le sous continent indien et L. infantum en Amérique du sud, en méditerrané et au moyen orient. Ces identifications ne seraient utiles que dans certaines régions d’Afrique de l’Est où des cas d’infection à L. infantum sont rapportés à côté d’une majorité à L. donovani (118 ). Dans tous les cas, l’identification d’espèce impacte peu la PEC au cours de la LV vu la rareté des options thérapeutiques disponibles et l’absence d’indications strictes dépendant des espèces en cause.

STRATEGIES DIAGNOSTIQUES

La confirmation biologique du diagnostic de la LV est incontournable en raison des lourdes implications qui en découlent en termes de PEC hospitalière et de traitements. Elle s’est pendant longtemps reposée sur la mise en évidence des leishmanies sur le médullogramme qui impose malheureusement des prélèvements invasifs. Des techniques récentes performantes offrent de nos jours des alternatives intéressantes. Ces techniques doivent être privilégiées en priorité. Les choix dépendront des moyens et méthodes disponibles ainsi que du contexte clinico-épidémiologique. Malgré son coût et ses exigences, la PCR en temps réel est à privilégier en cas d’accessibilité à des laboratoires spécialisés. En effet, elle est la plus sensible, se pratique sur de simples prélèvements de sang et permet le suivi post-thérapeutique des patients. En cas de non disponibilité de la PCR avec une forte préemption, le diagnostic de la LV peut être retenu grâce aux autres tests biologiques. Ainsi un test sérologique quantitatif (ELISA, IFI) exprimant un titre élevé d’anticorps spécifiques, voir un TDR positif, chez un enfant vivant en zone d’endémie et présentant les signes cliniques caractéristiques pourrait faire retenir le diagnostic et démarrer le traitement. La pratique des TDR est actuellement fortement recommandée et gagnerait à être diffusée vu leur simplicité et leur rapidité. D’ailleurs, la nouvelle stratégie nationale soutenue par l’OMS et basée sur un dépistage régional par les TDR a permis de réduire les délais de diagnostic de la maladie et d’en améliorer sensiblement le pronostic. Une confirmation ultérieure dans des centres spécialisés par la PCR serait souhaitable et utile entre autre pour la surveillance post thérapeutique. Le WB, voir la recherche d’antigènes parasitaires, sont intéressants chez les sujets immunodéprimés dont les tests sérologiques classiques se sont révélés négatifs.

Chez l’adulte, les formes atypiques et les localisations inhabituelles peuvent égarer le diagnostic. La recherche du parasite peut s’effectuer dans les biopsies digestives, les biopsies ganglionnaires ainsi que les lavages broncho-alvéolaires selon les signes cliniques. Enfin et au-delà des malades suspects de LV, le dépistage sérologique d'une infection asymptomatique par L. infantum, pourrait stratégiquement être discutée à titre préventif, en cas de transplantation d’organes ou de don de sang particulièrement lorsque les poches de sang en question sont destinées à des patients immunodéprimés. Il est à signaler que le risque de transmission des leishmanies par transfusion sanguine a nettement diminué grâce à la déleucocytation des culots de globules rouges.

CONCLUSION

L’avènement des techniques PCR et des TDR a beaucoup amélioré le diagnostic et la PEC de la LV. Le choix des techniques à engager est stratégique et dépend de l’épidémiologie de la maladie et des moyens économiques et logistiques disponibles.

Conflits d’intérêt : Aucun