Hancornia speciosa Gomes Latex Increases Bone Mineralization in Rats: A Preclinical Study.

Objective  To evaluate the systemic effect of Hancornia speciosa latex on bone neoformation and mineralization in rats. Methods  For that, the latex was first collected, and its composition was analyzed. A total of 30 male Wistar rats were used, which were simultaneously submitted to two surgical procedures: extraction of an incisor and creation of a defect with 2 mm in diameter in the parietal bone. The rats were divided into two groups: systemic control (SC) systemic latex (SX) which were administered, orally and daily, 1.5 mL of water or a solution containing 50% of water and 50% of latex by gavage, respectively. After 15 days of the treatment, the animals were euthanized and their samples were collected. Results  The results were statistically analyzed, and the level of significance was set at 0.05. We showed that H. speciosa latex contained calcium. The oral and daily administration of the latex for 15 days increased the contents of calcium and phosphorus in the basal bone and newly-formed bone in the mandibular alveolus of rats. Conclusion  The present was a pioneer study demonstrating the potential of H. speciosa latex in increasing bone mineralization. Our results may aid in the conception and development of a natural drug. Sociedade Brasileira de Ortopedia e Traumatologia. This is an open access article published by Thieme under the terms of the Creative Commons Attribution-NonDerivative-NonCommercial License, permitting copying and reproduction so long as the original work is given appropriate credit. Contents may not be used for commecial purposes, or adapted, remixed, transformed or built upon. ( https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ ).

Introduction

Bone is a mineralized connective tissue mainly composed of osteoblasts, osteoclasts, bone lining cells, and osteocytes. These cells are essential for the bone regeneration process, and play an important role after the development of bone defects. 1 2 3 4 5 However, in extensive bone defects, the repair must be supported by other biological products. 6 7

Some biological products have an important osteogenic potential, such as the latex extracted from the trunk of Hevea brasiliensis (rubber tree) 6 7 8 9 10 11 and Hancornia speciosa Gomes ( mangaba tree, or mangabeira , in Portuguese). 12 13 14

A study 12 conducted with H. speciosa latex has shown that its topical application increased the area of newly-formed bone on the calvarial defect of rats. Besides that, there are also popular beliefs in Brazil that support the benefits of this product. In Northeastern Brazil, some communities collect the H. speciosa latex and mix it with water to obtain a 50% latex solution called“leite da mangaba” ( mangaba milk), which is used in the treatment of bone fractures. 13 However, to date, no studies have been conducted to confirm this effect.

These findings motivated us to study the regenerative potential of the H. speciosa latex. Therefore, the present study aims to assess the effect of the oral administration of H. speciosa latex on bone neoformation and mineralization in Wistar rats.

Materials and Methods

Ethical Statement

The procedures were performed according to the guidelines of the Brazilian National Council for Animal Experimentation Control (Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal, CONCEA, in Portuguese), and were approved by the institutional Ethics Committee on the Use of Animals (under protocol 37901). The study data were developed based on a PhD thesis, and are available in the university repository at the following link: http://acervus.unicamp.br/index.asp?codigo_sophia=987041.

Study Design and Experimental Procedures

The present study was designed according to the Animals in Research: Reporting In Vivo Experiments (ARRIVE) guidelines. 15 The sample size was calculated using the data obtained from the pilot project (protocol: 34271) and the following formula: n = (N[S] 2 [t] 2 ) / (N(Ex-) 2  + [S] 2 [t] 2 . A total of 30 healthy male Wistar rats of the HanUnib strain, with an average weight od 390 g, and age of 10 weeks, were obtained from a center for biological research at the university and accommodated at its licensed bioterium. The rats were housed in individual plastic cages with bedding materials, and maintained under standard conditions of temperature and light (12:12h light-dark cycle). To minimize potential confounders regarding the order of treatment of each rat, the cages were numbered individually. They received distilled water and rodent feed ad libitum. The rats were anesthetized with an intraperitoneal injection of 80 mg/kg ketamine (Dopalen, Sespo Indústria e Comércio Ltda., Paulínia, SP, Brazil) and 8 mg/kg xylazine (Rompun, Bayer SA, São Paulo, SP, Brazil). Then, two procedures were simultaneously performed: extraction of the lower-left incisor and creation of a defect in the left parietal bone (diameter: 2 mm), 12 using an adapted diamond drill bit number 4142 (KG Sorensen, Cotia, SP, Brazil) on a low-speed handpiece (KAVO, Kaltenback & Voigt, São Paulo, SP, Brazil) with mounted irrigation with physiological saline solution. These procedures developed a bone injury to verify the potential of the latex regarding bone regeneration and mineralization. After surgery, the rats were administered 2 mg/mL of tramadol hydrochloride intramuscularly (Tramal, Grunenthal do Brasil Farmacêutica Ltda, São Paulo, SP, Brazil) and were monitored for 24 hours. To minimize the effects of subjective bias during the allocation to treatment, the rats were randomly divided into 2 groups: systemic control (SC, n  = 15) and systemic latex (SX, n  = 15). The rats were numbered, and randomization was performed using sealed opaque envelopes. The day after the surgery, we noticed that five rats had died, and these animals were excluded from the study. Therefore, the SC group was then composed of 14 animals, and the SX group, of 11 ( Fig. 1 ). The SX was submitted to a regimen of 5 hours of fasting, followed by the administration by gavage of 1.5 mL of a solution containing 50% of water and 50% of latex. The SC group was treated the same way, but with the administration of 1.5 mL of distilled water. As recommended by CONCEA, 15 days after the surgery, all rats were euthanized by cervical dislocation, and their calvaria, hemimandible, stomach, and blood were collected.

Fig, 1

Flowchart of the experimental protocol with the number of animals used, those that died, and those that were included in the study.

Experimental Outcomes Assessed

All of the analyses (of the latex, of the blood, of histology, and through scanning electron microscopy [SEM] with energy dispersive X-ray [EDX] spectroscopy) were performed by a single-blind examiner, previously trained on animal care, laboratory, and histological techniques.

Latex Collection and Analysis

H. speciosa latex was collected in the town of Mata de São João, state of Bahia, Brazil (12°27′42''S 37°56′38''O 69NE), 12 and mixed with distilled water (ratio: 1:1) to obtain a 50% latex solution. The solution was stored in syringes at 4°C. Then, the H. speciosa latex was diluted eleven times and subjected to colorimetry with arsenazo III and molybdic acid to assess the presence of calcium (Ca) and phosphorus (P).

Blood Analysis

From each rat, a total of 1 mL of blood was collected and centrifuged at 3,000 g-force (5,000 rpm) for 10min at 4°C. After centrifugation, 450 µL of the supernatant containing plasma was collected and examined by the colorimetric method using a calcium arsenazo III Kit and inorganic phosphorus by ultraviolet photometry (phosphorus UV) with the BS 120-Mindray/Bioclin (Bioclin, Belo Horizonte, MG, Brazil) automation equipment. The concentrations of Ca and P were recorded in mg/dL and compared between the groups.

Histological Processing

The stomach, hemimandible, and calvaria were fixed in Karnovsky solution and subjected to conventional histological processing. 16 First, the stomach was cut in halves, and a ring-shaped portion was collected. Second, the hemimandible was sectioned at the level of the mesial surface of the first molar, and two (one anterior and one posterior) fragments were obtained. Third, the calvaria was transversely sectioned, and only the bone portion was obtained. Subsequently, the anterior fragment of the hemimandible and the calvaria were decalcified with an ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) solution at 4%, and pH of 7.4, for 1 month. The ring-shaped portion of the stomach, the clavaria defect, and the anterior fragment of the hemimandible were dehydrated, diaphonized, and embedded in paraffin. 16 Sections were collected, the slides were prepared (stained with hematoxylin/eosin) and observed under a light microscope.

Descriptive and Histomorphometric Analysis

The slides were photographed using the OpticaView7 software. The images recorded were analyzed by a trained single examiner using the Image J software. The stomach, mandibular alveolus, and calvarial morphology were demonstrated using descriptive analysis. The are of newly-formed bone within the entire mandibular alveolus and calvarial bone defect were examined using histomorphometric analysis. The quantified values were compared between the groups.

SEM-EDX Analysis

The posterior fragment of the hemimandible was washed with phosphate-buffered saline (PBS), dehydrated with an increasing ethanol series, exposed to room temperature for drying, and attached on aluminum stubs. After conductive carbon coverage, the mandibular alveolar region was analyzed using SEM-EDX. 17 Once the sample image was acquired by SEM, the following areas of interest were selected: vestibular and proximal regions of the newly-formed bone and the basal bone. These regions were examined by EDX (acceleration voltage of 15 kV; working distance of 20 mm; acquisition time of 100 s). The atomic compositions were recorded, and the Ca/P ratio was calculated. The averages of the atomic content and proportions were compared between the groups.

Statistical Analysis

Data were analyzed using the R (R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria) software. Once the homogeneity of variance and normal distribution was confirmed with the Bartlett and Shapiro-Wilk tests, either the t -test or Welch-test was used to compare the SC and SX groups. Significance was set at 5% ( p  < 0.05).

Results

Latex Analysis

The H. speciosa latex diluted 11 times contained 0.1780 mg/mL of Ca. The concentration of P was not significant.

Analysis of Plasma Ca and P

Table 1 shows that both groups had an equal amount (mg/dl) of total Ca and P in blood plasma.

Table 1

Plasma concentration of calcium and phosphorus

Groups	Total calcium(mg/dl)	Total phosphorus(mg/dl)
Systemic control	8.79 ± 0.83 A	5.37 ± 1.32 A
Systemic latex	8.89 ± 0.52 A	5.05 ± 1.19 A

Note: Values are expressed as means ± standard deviations. Equivalent letters indicate that there is no statistically significant difference between the groups, as calculated using the t -test with p  < 0.05.

SEM-EDX Analysis

The results revealed that the main elements of all the evaluated samples and bone regions were sodium (Na), magnesium (Mg), P, and Ca.

Mineralization of the Basal Bone in the Mandibular Alveolus

We observed a similar Na content (%) in both groups. However, the content of Mg (%) was reduced by ∼ 50%, whereas those of Ca (%) and P (%) increased, respectively, ∼ 20% and 15% in the basal bone in the SX group when compared with the SC group ( Table 2 ). The Ca/P ratio in the SX group was elevated because the increase in Ca content was higher than that of the P content. An increase in the Ca and P contents indicates a higher degree of mineralization.

Table 2

Semi-quantitative chemical analysis of the basal alveolus (SEM-EDX)

Groups	Sodium (%)	Magnesium (%)	Calcium (%)	Phosphorus (%)	Calcium/Phosphorus ratio (%)
Systemic control	1.09 ± 0.09 A	0.82 ± 0.05 A	50.54 ± 3.52 A	23.36 ± 1.32 A	2.14 ± 0.03 A
Systemic latex	0.82 ± 0.09 A	0.42 ± 0.12 B	63.1 ± 1.93 B	27.33 ± 0.53 B	2.30 ± 0.03 B

Abbreviation: SEM-EDX, scanning electron microscopy with energy dispersive X-ray.

Notes: Values are expressed as means ± standard errors. The percentages of sodium, calcium, and phosphorus were evaluated using the t -test, and that of magnesium, using the Welch test. Different letters indicate a statistically significant difference in the results, with p  < 0.05.

Mineralization of the Newly-Formed Bone in the Mandibular Alveolus

On the newly-formed bone in the mandibular alveolus, we observed a similar Na content in both groups. However, the content of Mg was reduced by ∼ 40%, whereas those of Ca and P increased by ∼ 19% each in the newly-formed bone in the SX group when compared with the SC group ( Table 3 ). The Ca/P ratio was similar for both groups because of an equal increase in the Ca and P contents. Nevertheless, the newly-formed bone in the SX group was more mineralized due to its higher mineral content.

Table 3

Semiquantitative chemical analysis of the newly-formed bone in the alveolus (SEM-EDX)

Groups	Sodium (%)	Magnesium (%)	Calcium (%)	Phosphorus (%)	Calcium/Phosphorus ratio (%)
Systemic control	0.98 ± 0.07 A	0.80 ± 0.02 A	51.98 ± 3.79 A	21.82 ± 1.37 A	2.36 ± 0.04 A
Systemic latex	0.75 ± 0.09 A	0.47 ± 0.12 B	63.86 ± 1.90 B	26.75 ± 0.53 B	2.38 ± 0.04 A

Abbreviation: SEM-EDX, scanning electron microscopy with energy dispersive X-ray.

Notes: Values are expressed as means ± standard errors. The percentages of sodium, calcium, and phosphorus were evaluated using the t -test, and that of magnesium, using the Welch test. Different letters indicate a statistically significant difference in the results, with p  < 0.05.

Histological Analysis of Mandibular Alveolus and Calvarial Defect

We used these analyses to evaluate the newly-formed bone in the samples. A similar bone repair stage between both groups was observed. The trabeculae of the newly-formed bone extended from the edges of the basal bone toward the center of the defect ( Fig. 2 ) and the mandibular alveolus ( Fig. 3 ). The amount of new bone in these structures was also similar in both groups ( Fig. 4 ).

Fig. 2

Photomicrography of the calvarial defect in the SC and SX groups. Note: This is a representative image of the SC and SX groups. Coronal section. Notice the newly-formed bone extending from the edge of the defect toward the center. Abbreviations: C, calvaria; NB, newly-formed bone; →, edge of the defect; ▪, connective tissue; *, marrow spaces; ▶, osteoblasts; «, osteocytes (hematoxylin and eosin; A and B, 100x; C and D, 200x).

Fig. 3

Photomicrography of the mandibular alveolus in rats (SC and SX groups). Note: This is a representative image of the SC and SX groups. Cross-section. Notice the newly-formed bone extending from the periphery of the basal bone toward the center of the mandibular alveolus. Abbreviations: BB, basal bone; NB, newly-formed bone; →, periphery of the basal bone; ▪, connective tissue; *, marrow spaces; ▶, osteoblasts; «, osteocytes (hematoxylin and eosin; A and B, 50x; C and D, 400x).

Fig. 4

Area of newly-formed bone in the calvaria defect and the mandibular alveolus (cm 2 ) of rats in the SC and SX groups. Note: Equivalent letters indicate that there is no statistically significant difference between the groups, as calculated using a t -test with p  < 0.05.

Histological Analysis of Stomach Morphology

We evaluated the morphology of the body region of the stomach, and we observed that the stomachs of the rats on the SX group presented normality in its four layers ( Fig. 5 ). The mucosal layer exhibited regularity throughout the entire extension of the epithelium. No damage was observed in the gastric pit and gastric glands. The submucosal layer tipically exhibits large blood vessels and nerves intertwining with the dense connective tissue. No lesion was visualized along the muscularis externa and serous layer. In addition, there was no infiltration of leukocytes, ulcers, erosions, perforations, or gastric bleeding. Therefore, the latex administered systemically did not cause any damage to the stomach.

Fig. 5

Photomicrography of the body region of the stomach in rats (SC and SX groups). Note: This is a representative image of the SC and SX groups. Cross-section. Notice the aspect of normality in all the stomach layers of both groups. Abbreviations: SM, submucosa; ME, muscularis externa; ▶ serosa (hematoxylin and eosin; A and B, 100x, C and D, 200x).

In 2011, Marinho et al. 18 demonstrated the absence of toxic effects of the H. speciosa latex. In the present research, we state that the rats demonstrated no noticeable adverse effects, and to reduce any side effects of the latex in the stomach, we diluted it in distilled water.

Discussion

The present research evaluated the systemic effect of H. speciosa latex on bone neoformation and mineralization in Wistar rats.

We found that Ca is one of the components of H. speciosa latex. This element was also found in the fruit of H. speciosa , 19 20 and in the Hevea brasiliensis latex. 21 Possibly, after the ingestion of the latex, the blood Ca concentration increased in the SX group. However, we did not detect this change, possibly because of the rapid action of calcitonin and the deposition process of exchangeable salts. These actions may have culminated in blood homeostasis and deposition of Ca and P in the bones. Therefore, we observed an increase in the relative Ca and P contents in the basal bone of the mandibular alveolus in the SX group compared with the SC group.

Our results showed that, in addition to the increasing Ca and P contents, the latex treatment also resulted in the reduction of the Mg content. Therefore, we hypothesize that the amorphous crystals present in the bones were converted into hydroxyapatite crystals by the replacement/addition of atoms. Thus, the basal bone of the mandibular alveolus in the SX group became more mineralized.

The new mineralized bone can be analyzed by SEM-EDX to calculate the Ca/P ratio and to identify the degree of bone mineralization. 22 23 The present pioneering study demonstrated that H. speciosa latex increased the content of Ca and P, thus leading to an increase in the mineralization of the newly-formed bone in the mandibular alveolus of Wistar rats after 15 days of treatment. This effect can be attributed not only to the presence of Ca in the latex, but also to the presence of some phytochemicals (chlorogenic acid and naringenin-7-O-glucoside). 12 Studies 24 25 have shown that these phytochemicals can stimulate osteoblastic activitiy. Active osteoblasts secrete essential molecules for bone mineralization. 26 Thus, these compounds may improve bone mineral density and microarchitecture. 24 25

The histological analysis showed that the oral administration of H. speciosa latex at 50% did not increase the newly-formed bone in the mandibular alveolus or the calvarial defect. These data corroborate other results previously obtained by our team 27 with the oral administration of the latex in another concentration (of 50% and 3%).

On the other hand, it has been demonstrated that, in rats treated with topical applications of natural latex, there was an increase in the area of newly-formed bone in the calvaria 12 and mandibular alveolus. 8 This difference occurred due to the administration by distinct routes.

Although the oral treatment with 50% latex did not influence the amount of newly-formed bone, the main finding of the present paper is that the solution containing 50% latex increased bone mineralization.

We also demonstrated that the oral administration of the latex did not cause any stomach injury. Marinho et al. 18 administered different doses of H. speciosa latex by gavage, and observed that the product did not lead to the development of any lesions in the stomach. These results suggest that the latex has beneficial effects in the body, without damaging the gastric layers. Furthermore, Marinho et al. 18 also demonstrated the absence of toxic effects of this product. During the conduction of the present study, no behavioral alteration neither signs of intoxication were observed in the rats in the SX group.

Despite the advances in alternative methods, animal models still have the main advantage of providing information about the organism as a whole. 28 Rats are one of the most used vertebrates in research due to their genetic similarities to the human species. 28 Thus, the results of these studies can be extrapolated to human biology.

In addition, the authors valued the principles of the 3Rs (reduction, refinement, and replacement) for the use of animals. 29

Finally, the authors are aware that the present study has some limitations, such as the non-identification of significant concentrations of P by the colorimetric method, as well as the death of some animals after the surgical procedure, which reduced the number of samples. Nevertheless, these unforeseen events were not able to generate losses to the statistical analysis and the reliability of the data obtained with the research.

Conclusion

We found that H. speciosa latex contains Ca in its composition, and we demonstrated that the daily oral administration of the product for 15 days increases the Ca and P contents and decreases the Mg content of the basal and newly-formed bones in the mandibular alveolus. An increase in the Ca and P contents indicates higher Ca phosphate deposition in the bone; a decrease in the Mg content indicates that amorphous Ca phosphate present in the bones of the latex-treated rats was converted into hydroxyapatite crystals by the replacement/addition of atoms. Therefore, the basal and newly-formed bone in the mandibular alveolus became more mineralized after the latex treatment. Besides that, the oral treatment with latex did not change stomach morphology and plasma Ca and P concentrations. On the other hand, we showed that H. speciosa latex did not contribute to increasing the area of newly-formed bone in the calvarial defect and mandibular alveolus.

In conclusion, we may state that these results support the popular belief regarding the benefit of consuming mangaba milk daily for the treatment of fractures. Furthermore, our results may aid in the conception and development of a natural drug and favor the entire population that ingests the product.

Introdução

O osso é um tecido conjuntivo mineralizado composto principalmente de osteoblastos, osteoclastos, células de revestimento ósseo, e osteócitos. Essas células são essenciais para o processo de regeneração óssea, e desempenham um papel importante após o estabelecimento de defeitos ósseos. 1-5 No entanto, em defeitos ósseos extensos, o reparo deve ser auxiliado por outros produtos biológicos. 6 7

Alguns produtos biológicos têm um importante potencial osteogênico, como o látex extraído do tronco de Hevea brasiliensis (seringueira) 6-11 e Hancornia speciosa Gomes (mangabeira). 12-14

Um estudo 12 realizado com látex de H. speciosa mostrou que sua aplicação tópica aumentou a área óssea recém-formada no defeito calvarial dos ratos. Além disso, há também crenças populares quanto aos benefícios desse produto. No Nordeste do Brasil, algumas comunidades coletam o látex de H. speciosa e misturam-no com água para obter uma solução de 50% de látex, conhecida como “leite da mangaba”, utilizada para o tratamento de fraturas ósseas. 13 No entanto, até o momento, não foram realizados estudos que confirmem esse efeito.

Esses achados nos motivaram a estudar o potencial regenerativo do látex de H. speciosa. Portanto, este estudo tem como objetivo avaliar o efeito da administração oral de látex de H. speciosa na neoformação óssea e mineralização em ratos Wistar .

Declaração Ética

Os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (Concea) e aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais de nossa instituição (protocolo 37901). Os resultados do estudo foram desenvolvidos com base em uma tese de doutorado, cujos dados estão disponíveis no repositório da universidade, no seguinte link: http://acervus.unicamp.br/index.asp?codigo_sophia=987041.

Projeto de Estudo e Procedimentos Experimentais

O desenho do estudo foi realizado de acordo com as diretrizes do Animals in Research: Reporting In Vivo Experiments (Animais em Pesquisa: Relatando Experimentos In Vivo , ARRIVE, em inglês). 15 O tamanho da amostra foi calculado utilizando-se os dados obtidos do projeto piloto (protocolo: 34271) e a seguinte fórmula: n = (N[S] 2 [t] 2 ) /(N(Ex-) 2  + [S] 2 [t] 2 . Um total de 30 ratos Wistar machos saudáveis, da cepa HanUnib, com peso médio de 390 g e idade de 10 semanas, foram obtidos de um centro de pesquisa biológica da universidade e acomodados em seu bioterium licenciado. Todos os ratos estavam alojados em gaiolas de plástico (um rato por gaiola) com materiais de cama e mantidos sob condições padrão de temperatura e luz (ciclo claro-escuro de 12:12h). Para minimizar potenciais confusões quanto à ordem de tratamento de cada rato, as gaiolas foram numeradas individualmente. Os ratos receberam água destilada e ração para roedores ad libitum , e foram anestesiados com injeção intraperitoneal de 80 mg/kg de cetamina (Dopalen, Sespo Indústria e Comércio Ltda, Paulínia, SP, Brasil) e 8 mg/kg de xilazina (Rompun, Bayer SA, São Paulo, SP, Brasil). Em seguida, foram realizados dois procedimentos: a extração do incisivo inferior esquerdo e a criação de defeito no osso parietal esquerdo (diâmetro: 2 mm), 12 utilizando broca de diamante adaptada número 4142 (KG Sorensen, Cotia, SP, Brasil) em uma caneta de baixa rotação (KAVO, Kaltenback & Voigt, São Paulo, SP, Brasil) com irrigação montada de solução fisiológica de solução salina. Esses procedimentos estabeleceram uma lesão óssea para verificar o potencial do látex na regeneração óssea e mineralização. Após cirurgia, submeteu-se os ratos à administração intramuscular de 2 mg/mL de cloridrato de tramadol (Tramal, Grünenthal do Brasil Farmacêutica Ltda, São Paulo, SP, Brasil), e eles foram monitorados por 24h. Para minimizar os efeitos do viés subjetivo durante a alocação ao tratamento, os ratos foram divididos aleatoriamente em 2 grupos: controle sistêmico (CS, n  = 15) e látex sistêmico (XS, n  = 15). Os ratos foram numerados, e a randomização foi realizada utilizando envelopes opacos lacrados. No dia seguinte à cirurgia, notamos que cinco ratos haviam morrido, e esses animais foram excluídos do estudo. Assim, o grupo CS passou a contar com 14 animais, e o XS, com 11 ( Fig. 1 ). Diariamente, o grupo XS foi submetido a jejum por 5 horas, seguido da administração por gavagem de 1,5 mL de solução de 50% de água e 50% de látex. O grupo CS foi tratado da mesma forma, mas recebeu 1,5 mL de água destilada. Quinze dias após a cirurgia, todos os ratos foram eutanizados por luxação cervical, conforme recomendado pelo Concea, e sua calvária, hemimandíbula, estômago e sangue foram coletados.

Fig, 1

Fluxograma do protocolo experimental com o número de animais utilizados, mortos e incluídos no estudo.

Resultados experimentais avaliados

Todas as análises (do látex, do sangue, histológica e por microscopia eletrônica de varredura [MEV] com análises de espectroscopia de raio-X por dispersão em energia [ energy dispersive X-ray , EDX, em inglês]) foram realizadas por um examinador simples-cego, previamente treinado em técnicas de cuidados com animais, de laboratório, e histológicas.

Coleta e Análise de Látex

O látex de H. speciosa foi coletado da Mata de São João, Bahia, Brasil (12°27'42's 37°56'38''O 69NE), 12 e misturado com água destilada (razão: 1:1) para se obter uma solução com 50% de látex. A solução foi armazenada em seringas a 4°C. Depois, o látex foi diluído onze vezes e submetido a colorimetria com arsenazo III e ácido molibdico para examinar a presença de cálcio (Ca) e fósforo (P).

Análise sanguínea

De cada rato, um total de 1 mL de sangue foi coletado e centrifuado a 3.000 força-g (5.000 rpm) por 10 minutos a 4°C. Após a centrifugação, 450 μL do supernasal contendo plasma foi coletado e examinado pelo método colorimétrico usando um kit de arsenazo III de cálcio e fósforo inorgânico por fotometria em ultravioleta (fósforo UV) com equipamento de automação BS 120-Mindray/Bioclin (Bioclin, Belo Horizonte, MG, Brasil). As concentrações de Ca e P foram registradas em mg/dL e comparadas entre os grupos.

Processamento histológico

Estômago, hemimandíbula e calvária foram fixados em solução de Karnovsky e submetidos ao processamento histológico convencional. 16 Primeiro, o estômago foi cortado em metades, e uma porção em forma de anel foi coletada. Em segundo lugar, a hemimandíbula foi seccionada no nível da superfície mesial do primeiro molar, e dois fragmentos (um anterior e outro posterior) foram obtidos. Em terceiro lugar, a calvária foi transversalmente seccionada, e apenas a porção óssea foi obtida. Posteriormente, os fragmentos anteriores da hemimandíbula e da calvária foram decalcificados com solução de ácido etilenodiamino tetracético ( ethylenediamine tetraacetic acid , EDTA, em inglês) a 4%, com pH de 7,4, durante 1 mês. A porção estomacal em forma de anel, o defeito da calvária, e o fragmento anterior hemimandíbula foram desidratados, diafanizados, e embutidos em parafina. 16 Foram coletadas seções, e as lâminas foram preparadas (manchadas com hematoxilina/eosina) e observadas com um microscópio leve.

Análise descritiva e histomorfométrica

As lâminas foram fotografadas usando o programa OpticaView7. As imagens gravadas foram analisadas por um examinador único treinado utilizando o programa Image J. O estômago, o alvéolo mandibular e a morfologia calvarial foram demonstrados por meio de análise descritiva. A área óssea recém-formada dentro de todo o alvéolo mandibular e o defeito ósseo calvarial foram submetidos a análise histomorfométrica. Os valores quantificados foram comparados entre os grupos.

Análise MEV-EDX

O fragmento posterior da hemimandíbula foi lavado com solução salina tamponada com fosfato (STF), desidratado com uma série crescente de etanol, exposto a temperatura ambiente para secagem, e adaptado em suportes de alumínio. Após cobertura de carbono condutivo, a região alveolar mandibular foi analisada utilizando-se MEV-EDX. 17 Uma vez que a imagem amostral foi adquirida por MEV, foram selecionadas as seguintes áreas de interesse: regiões vestibulares e proximais do osso recém-formado e do osso basal. Essas regiões foram examinadas por EDX (tensão de aceleração de 15 kV; distância de trabalho de 20 mm; tempo de aquisição de 100 s). As composições atômicas foram registradas, e a razão Ca/P foi calculada. As médias do conteúdo atômico e das proporções foram comparadas entre os grupos.

Análise estatística

Os dados foram analisados utilizando-se o programa R (R Foundation for Statistical Computing, Viena, Áustria). Uma vez confirmada a homogeneidade de variância e distribuição normal com os testes de Bartlett e Shapiro-Wilk, o teste t ou o teste de Welch foram utilizados para comparar os grupos CS e XS. O nível de significância foi fixado em 5% ( p  < 0,05).

Análise do látex

O látex de H. speciosa diluído 11 vezes continha 0,1780 mg/mL de Ca. A concentração de P não foi significativa.

Análise de Ca e P no plasma

A Tabela 1 mostra que ambos os grupos apresentaram uma quantidade igual (mg/dl) de Ca e P no plasma de sangue.

Tabela 1

Concentração plasmática de cálcio e fósforo

Grupos	Cálcio total(mg/dl)	Fósforo total(mg/dl)
Controle sistêmico	8,79 ± 0,83 A	5,37 ± 1,32 A
Látex sistêmico	8,89 ± 0,52 A	5,05 ± 1,19 A

Notas: Os valores são expressos como ± desvio-padrão. Letras equivalentes indicam que não há diferença estatisticamente significativa entre os grupos, conforme calculado utilizando-se o teste t com p  < 0,05.

Os resultados revelaram que os principais elementos de todas as amostras avaliadas e regiões ósseas foram sódio (Na), magnésio (Mg), P, e Ca.

Mineralização do Osso Basal no Alvéolo Mandibular

Observou-se teor (%) semelhante de Na em ambos os grupos. No entanto, o teor de Mg sofreu redução de ∼ 50%, ao passo que os de Ca e P aumentaram, respectivamente, ∼ 20% e 15% no osso basal no grupo XS quando comparado com o grupo CS (Tabela 2 ). A razão Ca/P no grupo XS foi elevada, porque o aumento do teor de CA foi maior do que o de P. Um aumento nos teores de Ca e P indica maior grau de mineralização.

Tabela 2

Análise química semi-quantitativa do alvéolo basal (MEV-EDX)

Grupos	Sódio (%)	Magnésio (%)	Cálcio (%)	Fósforo (%)	Razão cálcio/fósforo
Controle sistêmico	1,09 ± 0,09 A	0,82 ± 0,05 A	50,54 ± 3,52 A	23,36 ± 1,32 A	2,14 ± 0,03 A
Látex sistêmico	0,82 ± 0,09 A	0,42 ± 0,12 B	63,1 ± 1,93 B	27,33 ± 0,53 B	2,30 ± 0,03 B

Abreviatura: MEV, microscopia eletrônica de varredura; EDX, energy dispersive X-ray (espectroscopia de raio-X por dispersão em energia).

Notas: Os valores são expressos como ± erro padrão. Os percentuais de sódio, cálcio e fósforo foram avaliados utilizando-se o teste t , e o de magnésio, utilizando-se o teste de Welch. Letras diferentes indicam que os resultados apresentaram diferença estatisticamente significativa ( p  < 0,05).

Mineralização do Osso Recém-Formado no Alvéolo Mandibular

No osso recém-formado no alvéolo mandibular, observamos teor de Na semelhante em ambos os grupos. No entanto, o teor de Mg sofreu redução de ∼ 40%, ao passo que os de Ca e P aumentaram ∼ 19% no osso recém-formado do grupo XS quando comparado com o grupo CS (Tabela 3 ). A razão Ca/P foi semelhante em ambos os grupos devido ao aumento igual nos teores de Ca e P. No entanto, o osso recém-formado do grupo XS foi mais mineralizado devido ao seu maior teor mineral.

Tabela 3

Análise química semiquantitativa do osso recém-formado no alvéolo (MEV-EDX)

Grupos	Sódio (%)	Magnésio (%)	Cálcio (%)	Fósforo (%)	Razão cálcio/fósforo (%)
Controle sistêmico	0,98 ± 0,07 A	0,80 ± 0,02 A	51,98 ± 3,79 A	21,82 ± 1,37 A	2,36 ± 0,04 A
Látex sistêmico	0,75 ± 0,09 A	0,47 ± 0,12 B	63,86 ± 1,90 B	26,75 ± 0,53 B	2,38 ± 0,04 A

Abreviatura: MEV, microscopia eletrônica de varredura; EDX, energy dispersive X-ray (espectroscopia de raio-X por dispersão em energia).

Notas: Os valores são expressos como ± erro padrão. Os percentuais de sódio, cálcio e fósforo foram avaliados utilizando-se o teste t , e o de magnésio, utilizando-se o teste de Welch. Letras diferentes indicam que os resultados apresentaram diferença estatisticamente significativa ( p  < 0,05).

Análise Histológica do Alvéolo Mandibular e Defeito Calvarial

Essas análises foram utilizadas para avaliar o osso recém-formado nas amostras. Observou-se um estágio semelhante de reparação óssea em ambos os grupos. Trabéculas do osso recém-formado se estenderam das bordas do osso basal em direção ao centro do defeito ( Fig. 2 ) e do alvéolo mandibular ( Fig. 3 ). A quantidade de osso novo nessas estruturas também foi semelhante em ambos os grupos ( Fig. 4 ).

Fig. 2

Fotomicrografia do defeito calvarial nos grupos CS e XS. Nota: Esta é uma imagem representativa dos grupos CS e XS. Seção coronal. Observe o osso recém-formado, que se estende da borda do defeito em direção ao centro. Abreviaturas: C, calvaria; NB, osso recém-formado; →, borda do defeito; ▪, tecido conjuntivo; *, espaços de medula; ▶, osteoblastos; «, osteócitos (hematoxilina e eosina; A e B, 100x; C e D, 200x).

Fig. 3

Fotomicrografia do alvéolo mandibular em ratos (grupos CS e XS). Nota: Esta é uma imagem representativa dos grupos CS e XS. Seção transversal. Observe o osso recém-formado, que se estende da periferia do osso basal em direção ao centro do alvéolo mandibular. Abreviaturas: BB, osso basal; NB, osso recém-formado; →, periferia do osso basal; ▪, tecido conjuntivo; *, espaços de medula; ▶, osteoblastos; «, osteócitos (hematoxilina e eosina; A e B, 50x; C e D, 400x).

Fig. 4

Área de osso recém-formado no defeito calvarial e o alvéolo mandibular (cm 2 ) de ratos nos grupos CS e XS. Nota: Letras equivalentes indicam que não há diferença estatisticamente significativa entre os grupos, conforme calculado utilizando-se um teste t com p  < 0,05.

Análise Histológica da Morfologia Estomacal

Avaliamos a morfologia da região corporal do estômago, e observamos que o estômago dos ratos do grupo XS apresentava normalidade em suas quatro camadas (Fig. 5 ). A camada de mucosa exibiu regularidade em toda a extensão do epitélio. Nenhum dano foi observado no poço gástrico e nas glândulas gástricas. Tipicamente, a camada submucosal manifesta grandes vasos sanguíneos e nervos entrelaçados com o tecido conjuntivo denso. Nenhuma lesão foi visualizada ao longo da camada muscular e sorosa. Além disso, não houve infiltração de leucócitos, úlceras, erosões, perfurações ou sangramento gástrico. Portanto, o látex administrado sistemicamente não causou nenhum dano ao estômago.

Fig. 5

Fotomicrografia da região corporal do estômago em ratos (CS e XS). Nota: Esta é uma imagem representativa dos grupos CS e XS. Seção transversal. Observe o aspecto da normalidade em todas as camadas estomacais de ambos os grupos. Abreviaturas: SM, submucosa; ME, muscularis externa ; ▶ serosa (hematoxilina e eosina; A e B, 100x, C e D, 200x).

Em 2011, Marinho et al. 18 demonstraram a ausência de efeitos tóxicos do látex de H. speciosa . Na presente pesquisa, afirmamos que os ratos não demonstraram efeitos adversos visíveis e, para reduzir qualquer efeito colateral do látex no estômago, nós o diluímos em água destilada.

Discussão

Esta pesquisa estudou o efeito sistêmico do látex de H. speciosa na neoformação óssea e mineralização em ratos Wistar.

Descobrimos que o látex de H. speciosa contém Ca em sua composição. Esse elemento também foi encontrado no fruto da H. speciosa 19 20 e no látex de Hevea brasiliensis. 21 Após a ingestão do látex, a concentração de Ca no sangue pode ter aumentado no grupo XS. No entanto, não detectamos essa mudança, possivelmente devido à rápida ação da calcitonina e ao processo de deposição de sais trocáveis, que podem ter culminado em homeostase de sangue e deposição de Ca e P nos ossos. Portanto, observou-se um aumento do conteúdo relativo de Ca e P no osso basal do alvéolo mandibular do grupo XS em comparação com o grupo CS.

Nossos resultados mostraram que, além do aumento dos teores de Ca e P, o tratamento com látex também resultou na redução do teor de Mg. Portanto, conjecturamos que os cristais amorfos presentes nos ossos foram convertidos em cristais de hidroxiapatita pela substituição/acréscimo de átomos. Desta forma, o osso basal do alvéolo mandibular do grupo XS tornou-se mais mineralizado.

O novo osso mineralizado pode ser analisado por MEV-EDX para calcular a razão Ca/P e identificar o grau de mineralização óssea. 22 23 Este estudo pioneiro demonstrou que o látex de H. speciosa aumentou o teor de Ca e P, o que levou a um aumento na mineralização do osso recém-formado no alvéolo mandibular de ratos Wistar após 15 dias de tratamento. Esse efeito pode ser atribuído não apenas à presença de Ca no látex, como também à presença de alguns fitoquímicos (ácido clorogênico e naringenina-7-O-glicosídeo). 12 Estudos 24 25 mostraram que esses fitoquímicos podem estimular atividades osteoblásticas, e osteoblastos ativos secretam moléculas essenciais para a mineralização óssea. 26 Assim, esses compostos podem melhorar a densidade mineral óssea e a microarquitetura. 24 25

A análise histológica mostrou que a administração oral do látex de H. speciosa a 50% não aumentou o osso recém-formado no alvéolo mandibular ou no defeito calvarial. Esses dados corroboram outros resultados que nossa equipe já obteve anteriormente 27 utilizando outra concentração de látex (50% e 3%) de administração oral.

Por outro lado, demonstrou-se que, nos ratos tratados com látex natural com aplicações tópicas, aumentou a área de osso recém-formado tanto na calvaria 12 quanto no alvéolo mandibular. 8 Essa diferença ocorreu devido às administrações por vias distintas.

Embora o tratamento oral com slução de látex a 50% não tenha influenciado a quantidade de osso recém-formado, o principal achado deste artigo é que a concentração de 50% de látex aumentou a mineralização óssea.

Também demonstramos que a administração oral de látex não causou nenhuma lesão estomacal. Marinho et al. 18 administraram doses diferentes de látex de H. speciosa por gavagem, e observaram que o produto não provocou qualquer lesão no estômago. Esses resultados sugerem que o látex causa efeitos benéficos no corpo, sem danificar as camadas gástricas. Além disso, Marinho et al. 18 também demonstraram a ausência de efeitos tóxicos deste produto. Durante o período do presente estudo, não foram observados sinais de embriaguez ou de intoxicação em ratos do grupo XS.

Apesar do progresso de métodos alternativos, os modelos animais ainda têm a principal vantagem de fornecer informações sobre o organismo como um todo. 28 Ratos são um dos vertebrados mais usados na pesquisa devido às suas semelhanças genéticas com a espécie humana. 28 Assim, os resultados desses estudos podem ser extrapolados para a biologia humana.

Além disso, os autores valorizaram o princípio dos 3R ( reduction , refinement , e replacement , redução, refinamento e substituição) para o uso de animais. 29

Por fim, os autores estão cientes de que este estudo tem algumas limitações, como a não identificação de concentrações significativas de P pelo método colorimétrico, bem como a morte dos animais após o procedimento cirúrgico, o que reduziu o número de amostras. No entanto, esses imprevistos não foram capazes de gerar perdas para a análise estatística e a confiabilidade dos dados obtidos com a pesquisa.

Conclusão

Descobrimos que o látex de H. speciosa contém Ca em sua composição, e demonstramos que a administração oral diária do produto por 15 dias aumenta o teor de Ca e P e diminui o de Mg dos ossos basal e recém-formado no alvéolo mandibular. Um aumento no teor de Ca e P indica maior deposição de fosfato de Ca no osso; uma diminuição no teor de Mg indica que o fosfato de Ca amorfo presente nos ossos dos ratos tratados com látex foi convertido em cristais de hidroxiapatita pela substituição/acréscimo de átomos. Assim, os ossos basal e recém-formado no alvéolo mandibular tornaram-se mais mineralizados após o tratamento com o látex. Além disso, o tratamento oral com látex não alterou a morfologia estomacal e concentrações plasmáticas de Ca e P. Por outro lado, mostramos que o látex de H. speciosa não contribuiu para o aumento da área óssea recém-formada no defeito calvarial e no alvéolo mandibular.

Em conclusão, podemos afirmar que esses resultados apoiam a crença popular no benefício do consumo diário de “leite de mangaba” para o tratamento de fraturas. Além disso, nossos resultados podem auxiliar na concepção e desenvolvimento de uma droga natural e favorecer toda a população que consome o produto.